專利名稱：殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及殼聚糖在卵黃脂肪脫脂技術(shù)中的應用。
背景技術(shù)：
禽卵黃抗體是禽類B淋巴細胞在抗原物質(zhì)刺激下所產(chǎn)生并沉積在卵黃中的一種蛋白質(zhì)，主要成分為免疫球蛋白IgY (Immunoglobulin of yolk),由禽類血清免疫球蛋白轉(zhuǎn)移而來，功能上相當于哺乳動物IgG (Immunoglobulin G),結(jié)構(gòu)上具有典型的免疫球蛋白空間構(gòu)象，但不含絞鏈區(qū)。與哺乳動物免疫球蛋白IgG相比，禽類卵黃抗體具有很多優(yōu)越性其一，由于禽類與哺乳動物種系發(fā)生學的距離，禽類免疫球蛋白IgY不會激活哺乳動物的補體系統(tǒng)，不與哺乳動物免疫球蛋白IgG細胞表面Fe受體結(jié)合，更適合于生產(chǎn)用于檢測哺乳動物抗原的特異性抗體，在免疫檢測與診斷中具有重要意義；其二，禽類免疫球蛋白IgY具有較高的穩(wěn)定性，耐酸，耐堿，耐熱，耐冷藏，抗反復凍融，抗胃蛋白酶降解，方便生產(chǎn)、 加工、儲存和運輸，還可用于幼齡動物的經(jīng)口給服；其三，卵黃中抗體濃度能長期維持或超過血清中抗體濃度，產(chǎn)量高，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)；其四，從禽類卵黃中制備抗體可免去動物采血，符合現(xiàn)代動物保護規(guī)則，降低勞動成本；其五，產(chǎn)生有效免疫反應所需抗原量少，尤其是對高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)。作為一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的多克隆抗體，卵黃抗體IgY具有十分廣泛的用途和良好的開發(fā)應用前景，可以應用于人類和畜禽多種疾病的臨床治療、診斷和預防，可以作為免疫檢測工具應用于生物科學研究，可以用作飼料添加劑、保健品和無公害防腐劑等等。近年來，用卵黃生產(chǎn)制備多克隆抗體的技術(shù)已逐漸興起。除水分外，卵黃中的主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，其比例約為I :2，其中大部分蛋白為脂蛋白，不溶于水，雖然免疫球蛋白IgY是水溶的，但在卵黃中它與脂類、磷蛋白等形成穩(wěn)定的乳化狀態(tài)。所以，提取卵黃抗體IgY首先必須將卵黃中脂類組分和水溶性組分(蛋白)進行分離，即進行卵黃脫脂處理。IgY的分離純化曾一度成為難題，主要困難就在于如何去除高濃度的脂類。自從20世紀60年代Williams發(fā)現(xiàn)卵黃中存在大量的抗體以來，用于提取卵黃抗體的卵黃脫脂技術(shù)就得到了關(guān)注。1980年P(guān)olson等(Immunol Commun (Invest),1980,9 (5) : 475-493 )首先提出聚乙二醇沉淀法，1990年又改良為氯仿沉淀法(ImmunoIInvest, 1990，19 (3):253-258)。1981 年 Jensenius 等(Journal of ImmunologicalMethods, 1981, 46:63-68)提出硫酸葡聚糖沉淀法。1984 年 Bade 和 Stegemann (JImmunol Methods, 1984，72 (2) :421-426)用預冷的異丙醇和丙酮沉淀蛋白并去除脂類。1988年Hatta等(J Food Sci，1988，53 (2) : 425-427)用海藻酸鈉分離卵黃脂蛋白和水溶性組分，1990年又通過比較幾種天然樹膠的脫脂效果提出K-角叉藻聚糖法和黃原膠法，K-角叉藻聚糖脫脂效果較好但免疫球蛋白產(chǎn)量不如黃原膠(Agric BiolChem, 1990，54(10):2531-2535)。1992 年 Akita 等(J. Food Sci.，1992，(57):629-634)最早采用水稀釋法，并于1993年比較了水稀釋法、聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法和黃原膠法的提純效果，結(jié)果表明水稀釋法產(chǎn)量最高，依次為硫酸葡聚糖法、黃原膠法和聚乙二醇法(J Immunol Methods, 1993，160 (2) : 207-214)。但水稀釋法用水量較大(10倍稀釋)且操作繁瑣。1993 年 Horikoshi 等(Journal of Food Science. 1993, 58(4) :739742)報道了冷乙醇法，但免疫球蛋白得率僅40%，且耗能高。1994年McLaren等(J ImmunolMethods, 1994，177:175-184)提出了辛酸法。2000 年 Deigan (Food and AgriculturalImmunology, 2000, 12:77-85)在比較了 5種脫脂方法后，提出了他認為簡單而經(jīng)濟的反復凍融法，但其產(chǎn)率低于硫酸葡聚糖法近20% ;同年，Bizhanov等(Vet ResCommun, 2000, 24(2) : 103-113)采用藍色葡聚糖法獲得與聚乙二醇法相當?shù)漠a(chǎn)率。2004年徐錫殿等(山東家禽，2004， 2:10-11)報道了泊洛沙姆對雞卵黃的脫脂作用。2009年鄧碧華(動物醫(yī)學進展，2009, 30(1) :38-40)比較了泊洛沙姆和聚乙二醇的脂脫效果，認為二者沒有明顯區(qū)別，當濃度過高時都破壞抗體蛋白的水化膜從而影響抗體效價，且泊洛沙姆成本高于聚乙二醇。2011年張倫等(中國動物檢疫，2011，28(3) :49-51)進行了泊洛沙姆一辛酸法對雞卵黃脫脂條件的研究，發(fā)現(xiàn)隨辛酸濃度加大蛋白回收率和抗體效價都逐漸降低。2012年吳博等(中國獸藥雜志，2012，46(6) :42-45)比較了五種提取卵黃抗體的方法，回收率從高到低依次為辛酸法、酚沉淀法、水稀釋法、乙酸一乙酸鈉法和海藻酸鈉法，但所得卵黃抗體效價從高到低依次為辛酸法、海藻酸鈉法、水稀釋法、酚沉淀法和乙酸一乙酸鈉法。1995年，公開號為CN1117974A的中國專利公開了一種提取卵黃中抗體的新方法-甲醛脫脂法；1998年，公開號為CN1202496A的中國專利公開了一種利用苯酚使卵黃溶液破乳的苯酚脫脂法。但上述方法存在以下問題使用大量無機或有機試劑，甚至有毒有機溶劑，有毒有害試劑的殘留很難去除；脫脂的同時也消耗蛋白，IgY損失率高，甚至會導致抗體失活；需要使用大量儀器設(shè)備，增加了脫脂成本。于是，脫脂劑無毒、無害且儀器設(shè)備使用量少以減少脫脂成本等成為卵黃脫脂技術(shù)追求的目標。公開號為CN101225103A的中國專利公開了卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，安全、無毒，不使用大型儀器設(shè)備，但該方法使用的脫脂劑為聚乙二醇，利用的是聚乙二醇的強吸水能力打破卵黃的乳化狀態(tài)，脫脂試劑使用量較大，IgY損失率較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供殼聚糖的新用途，即殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中的應用，通過對殼聚糖進行了卵黃脂肪沉淀脫脂的實驗研究，并對不同殼聚糖濃度的脫脂效果進行了研究，為殼聚糖更好地應用提供了理論依據(jù)。本發(fā)明是這樣構(gòu)成的殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中的應用。所述的應用，其方法為對殼聚糖或殼聚糖溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液的混合溶液進行機械攪拌，使卵黃中的脂類組分與卵黃中的水溶性組分分離，再靜置沉淀和/或離心分離，使卵黃脂類組分凝集沉淀。所述的應用，其具體方法為在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，取卵黃原液，加水、生理鹽水或酸性溶液做η倍稀釋，制成卵黃稀釋液，然后將殼聚糖用水或酸性溶液進行溶解，制成m倍體積的殼聚糖溶液，將卵黃稀釋液與殼聚糖溶液混合得到混合溶液，充分攪拌混勻，靜置沉淀和/或離心分離，底部沉淀即為卵黃脂類組分，上清液為水溶性組分，即富含卵黃抗體免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0〈n< 10，100〈m ( 10000。
所述的應用，另一種具體方法為在4 50°C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后,打破卵黃膜，取卵黃原液，加水、生理鹽水或酸性溶液做η倍稀釋制成卵黃稀釋液，然后與殼聚糖混合得到混合溶液，充分攪拌混勻，靜置沉淀和/或離心分離，底部沉淀即為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即富含卵黃抗體免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0<η ≤10。所述的應用，又一種具體方法為在4 50°c環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后,打破卵黃膜，取卵黃原液，然后將殼聚糖用水或酸性溶液進行溶解，制成m倍體積的殼聚糖溶液，將卵黃原液與殼聚糖溶液混合得到混合溶液，充分攪拌混勻，靜置沉淀和/或離心分離，底部沉淀即為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即富含卵黃抗體免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中100〈m≤10000。所述的應用，又一種具體方法為在4 50°c環(huán)境中,將卵黃從雞蛋中取出后,打破卵黃膜，取卵黃原液，將卵黃原液與殼聚糖混合，然后向卵黃原液和殼聚糖混合物中加水、生理鹽水或酸性溶液做η倍稀釋得到混合溶液，充分攪拌混勻，靜置沉淀和/或離心分離，底部沉淀即為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即富含卵黃抗體免疫球蛋白IgY和其它蛋白的混合溶液，其中0〈η ( 10。所述的混合溶液中，殼聚糖與混合溶液的重量體積比(w/v)為O. 000Γ0. 005。所述的靜置沉淀的時間為O. 5 48h。所述的離心分離的離心速率為4000 12000rpm/min,離心時間為I lOmin。本發(fā)明中的殼聚糖，是由自然界中廣泛存在的幾丁質(zhì)(又名甲殼素)經(jīng)過脫乙酰作用而成，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡聚糖，具有較好的生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能，已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學工程等諸多領(lǐng)域。殼聚糖在1%乙酸或鹽酸中溶解度大于1%。殼聚糖在酸性溶液中可吸附脂類物質(zhì)并發(fā)生沉淀。一般認為，殼聚糖吸附油脂的機理是通過自身的氨基與脂肪酸的羧基發(fā)生靜電橋聯(lián)作用。本發(fā)明的要點在于將殼聚糖作為脫脂劑應用在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中，利用機械攪拌和殼聚糖對脂類的吸附能力從而打破卵黃的乳化狀態(tài)，使卵黃中的脂類組分與水溶性組分分離，從而達到卵黃脫脂的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明對已知化合物殼聚糖發(fā)掘了新的用途，開拓了一個新的應用領(lǐng)域，效果可靠，簡單易行；(2)本發(fā)明脫脂完全、脫脂效率高，安全，無毒，對卵黃蛋白成分的影響較小，IgY損失少；( 3 )本發(fā)明對環(huán)境條件要求低，應用過程無需大型設(shè)備儀器，且試劑用量少，費用、成本低；(4)本發(fā)明既適合于實驗室制備制備卵黃抗體和純化免疫球蛋白，也適合于企業(yè)大規(guī)模批量生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的應用范圍不限于如下實施例。實施例I在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中。精確稱取O. 4g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解得到殼聚糖溶液，然后將殼聚糖溶液倒入卵黃原液中并混勻，靜置沉淀24h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即含免疫球蛋白IgY的混合溶液。實施例2在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加IOOml蒸餾水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 6g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后液靜置沉淀3h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上 清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液。實施例3在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，加入O. 8g殼聚糖、300ml的1%(V/V)醋酸溶液，充分攪拌，然后將混合液靜置沉淀過夜。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液。實施例4在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，然后添加300ml的1%(V/V)醋酸溶液、O. Sg殼聚糖，充分攪拌混勻，然后靜置沉淀30min，8000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。沉淀后的溶液分為兩層，底部為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液。實施例5在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取I. Og殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表I、表2。實施例6在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 5g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表I、表2。實施例7在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 25g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表I、表2。實施例8在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 125g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表I、表2。實施例9在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 0625g殼聚糖溶于IOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表I、表 2。對比例I在4 5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，打破卵黃膜，量取卵黃原液100ml，置于500ml燒杯中，并添加200ml生理鹽水稀釋，混勻，制成卵黃稀釋液。精確稱取O. 3125g殼聚糖溶于IOOOml的1%(V/V)醋酸溶液中，攪拌至完全溶解。將IOOml殼聚糖溶液倒入卵黃稀釋液中充分攪拌混勻，然后靜置沉淀18h。沉淀后的混合液分為兩層，底部沉淀為卵黃脂類組分，上清液為卵黃水溶性組分，即免疫球蛋白IgY與其他蛋白的混合溶液，具體見表
I、表 2。表I殼聚糖濃度對卵黃脫脂效果的影響
權(quán)利要求
1.殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中的應用。
2.如權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，對殼聚糖或殼聚糖溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液的混合溶液進行機械攪拌，使卵黃中的脂類組分與卵黃中的水溶性組分分離，再靜置沉淀和/或離心分離，使卵黃脂類組分凝集沉淀。
3.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的混合溶液中，殼聚糖與混合溶液的重量體積比為O. 000Γ0. 005。
4.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的靜置沉淀的時間為O.5 48h。
5.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的離心分離的離心速率為4000 12000rpm/min,離心時間為 I lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖在卵黃脂肪沉淀脫脂技術(shù)中的應用。該應用的方法為對殼聚糖或殼聚糖溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液的混合溶液進行機械攪拌，使卵黃中的脂類組分與卵黃中的水溶性組分分離，再靜置沉淀和/或離心分離，使卵黃脂類組分凝集沉淀。本發(fā)明對已知化合物殼聚糖發(fā)掘了新的用途，開拓了一個新的應用領(lǐng)域，效果可靠，簡單易行；本發(fā)明脫脂完全、脫脂效率高，安全，無毒，對卵黃蛋白成分的影響較小，IgY損失少；本發(fā)明對環(huán)境條件要求低，應用過程無需大型設(shè)備儀器，且試劑用量少，費用、成本低；本發(fā)明既適合于實驗室制備制備卵黃抗體和純化免疫球蛋白，也適合于企業(yè)大規(guī)模批量生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/30GK102924593SQ20121047689
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者梁永利, 周東順, 呂素軍, 金東慶, 王可洲 申請人:梁永利