一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，包括以下步驟：1）取棉花葉片，研磨；2）經(jīng)研磨的葉片粉末轉(zhuǎn)入離心管中，并加入三氯乙酸提取液，混合均勻，放在－20℃冰箱中兩小時(shí)以上；3）離心管離心，棄上清，留沉淀，向沉淀中加入-20℃預(yù)冷丙酮溶液，混合均勻，于-20℃靜置2～4h；4）離心管離心，棄上清，留沉淀，洗滌沉淀，并保留沉淀；5）沉淀抽真空，揮發(fā)丙酮，得到蛋白質(zhì)干粉；6）取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35℃的水浴中裂解1h，離心，取上清，所述上清為棉花葉片蛋白溶解液。本發(fā)明所述棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法提取的蛋白質(zhì)穩(wěn)定,重復(fù)性好，且蛋白質(zhì)純度較高,電泳圖譜顯示幾乎沒有橫條紋和拖尾等紋理現(xiàn)象。
【專利說明】一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是重要的油料作物；同時(shí)棉花也是世界性的重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。棉花能制成各種規(guī)格的紡織物，這些紡織物具有穿著舒適，堅(jiān)牢耐磨，能洗滌并在高溫下熨燙等特點(diǎn)。因此，棉花具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。
[0003]棉花作為一種重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，在其進(jìn)行大量的分子標(biāo)記和QTL等研究后，對(duì)它開展蛋白質(zhì)組研究就顯得十分迫切，也更為可行。但棉花中含有大量的色素、酚、醌等一些次生代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重影響所提蛋白的純度，從而影響棉花蛋白質(zhì)領(lǐng)域的研究，以及影響棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，在提取蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)盡可能的除去這些物質(zhì)的干擾，對(duì)解決棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展中遇到的技術(shù)問題具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，該方法提取的棉花葉片蛋白純度高，適合后續(xù)研究工作的開展，利于促進(jìn)棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
[0005]一種棉花 葉片 蛋白質(zhì)提取方法，包括以下步驟:
[0006]I)取棉花葉片，用液氮研磨；
[0007]2)經(jīng)液氮研磨的葉片粉末轉(zhuǎn)入離心管中，并加入預(yù)冷的三氯乙酸提取液，混合均勻，放在一 20°C冰箱中兩小時(shí)以上，每半小時(shí)震蕩一次；
[0008]3)離心管離心，棄上清，留沉淀，向沉淀中加入_20°C預(yù)冷丙酮溶液，混合均勻，于-20°C靜置2~4h ；
[0009]4)離心管離心，棄上清，留沉淀，洗滌沉淀，并保留沉淀；
[0010]5)沉淀抽真空，揮發(fā)丙酮，得到蛋白質(zhì)干粉；
[0011]6)取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，35°C的水浴中裂解lh，離心，取上清，所述上清為棉花葉片蛋白溶解液。
[0012]所述三氯乙酸提取液的配方為:10%TCA，0.07%-0.1%DTT,0.5% β-巰基乙醇，lmmol/L PMSF，溶劑為丙酮。
[0013]所述丙酮溶液含有0.07%-0.1%DTT 和 lmmol/L PMSF。
[0014]所述蛋白裂解液的配方為:7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS, 80mmol/LDTT, lmmol/L PMSF, 0.3%載體兩性電解質(zhì)。
[0015]用液氮研磨葉片時(shí)加入PVPP和石英砂。
[0016]所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克葉片加入1.SmL預(yù)冷三氯乙酸提取液。
[0017]步驟4)所述沉淀重復(fù)洗滌3次或3次以上，或過夜洗滌，至接近白色。
[0018]所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20 μ I。[0019]本發(fā)明所述棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法提取的蛋白質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好，且蛋白質(zhì)純度較高，電泳圖譜顯示幾乎沒有橫條紋和拖尾等紋理現(xiàn)象，清晰，圓潤(rùn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1不同提取方法對(duì)棉花葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響，A:酹法，B =TCA/丙酮法，C:改良的TCA/丙酮法；
[0021]圖2不同上樣量對(duì)棉花葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響(IPGpH4-7，18cm)；
[0022]圖3不同上樣量對(duì)棉花葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜的影響(IPGpH4_7，24cm)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0024]本發(fā)明用到的材料:
[0025]植物材料:棉花品種“KK1543”，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。
[0026]實(shí)施例1棉花葉片獲取
[0027]選取籽粒飽滿且脫絨干凈的棉花種子處理后放入三角瓶里，浸種24小時(shí)，待種子露白后轉(zhuǎn)入放有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，并保持發(fā)芽盒濕潤(rùn)，待長(zhǎng)出兩片子葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)健壯，均一的棉苗轉(zhuǎn)入l/2Hoagland培養(yǎng)液中，人工氣候室水培。培養(yǎng)條件為溫度為28/25C(白天/晚上)，光強(qiáng)為120001x以上光照350~400，每天光照10小時(shí)，相對(duì)濕度為60~80%。每隔4d換一次培養(yǎng)液，并注意清洗根部和盆子等處的青苔,培養(yǎng)半個(gè)月后取其葉片，用純水，去離子水依次清洗干凈，用濾紙吸干水后，于液氮中速凍后置于-80°C超低溫冰箱保存，待用。
[0028]本實(shí)施例所用棉花為KK1543。
[0029]實(shí)施例2棉花葉片蛋白提取
[0030]將洗凈的研缽用酒精燈燒三分鐘放于_20°C冰箱中預(yù)冷后，加入I~2g材料，適量的PVPP和少許石英砂，用液氮研磨充分，直至粉末泛白即可。轉(zhuǎn)入幾個(gè)2mL離心管中(每管約0.4g)，每管中加入1.8mL預(yù)冷的三氯乙酸提取液中充分混合后，放在一 20°C冰箱中兩小時(shí)以上，并約半小時(shí)震蕩一次。4°C, 13000r/min離心15min,棄上清,取沉淀。將沉淀用槍頭搗碎后加入1.8mL的_20°C預(yù)冷丙酮(含0.07%-0.1%DTT，lmmol/LPMSF)，混勻后于_20°C靜置2~4h.，同上離心，棄上清，取沉淀，重復(fù)洗滌3次。最后取沉淀，如果發(fā)現(xiàn)有仍有粉色則可再過夜，直到沉淀顏色接近白色為止。得到沉淀后均用parafilm封口，用針在膜上扎幾個(gè)小洞，真空機(jī)中抽真空，揮發(fā)丙酮之后成為蛋白質(zhì)干粉。
[0031]取適量干燥后的樣品粉末，按20 μ Ι/mg的比例加入蛋白裂解液后，渦旋器上震蕩成粘稠狀，然后放在35°C (不能高于36°C)的水浴中裂解lh，不時(shí)振蕩。試管拿出后，室溫下13000r/min離心15min，取上清(重復(fù)一次)，得到棉花葉片蛋白溶解液，放于一 80°C保存。
[0032]三氯乙酸提取液配方如下:10%TCA，0.07%-0.1%DTT,0.5% β -巰基乙醇，Immol/LPMSF，溶劑為丙酮
[0033]蛋白裂解裂解液配方如下:7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，80mmol/LDTT, lmmol/LPMSF, 0.3% 載體兩性電解質(zhì)。[0034]本實(shí)施例所述棉花葉片蛋白提取方法命名為改良的TCA/丙酮沉淀法。
[0035]對(duì)照例I酚抽提法提取棉花葉片蛋白質(zhì)
[0036]取用蒸餾水沖洗干凈的棉花葉片約3g，加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpoly pyrrolidone, PVPP)后，在研缽中加入液氮冷凍研磨成粉后取Ig粉末加入到無(wú)菌的IOmL大離心管中，加入4~5倍體積的蛋白質(zhì)提取緩沖液(50mmol/LTris,50mmol/LEDTA, 100mmol/LKCl, lmmol/LPMSF,體積分?jǐn)?shù)2%P -疏基乙醇)混勻，加入等體積PH8.0 Tris-飽和酚，充分渦旋后，離心(4°C，，12000r/min)離心20min ;回收酚相轉(zhuǎn)至一新的離心管，各加入50mL乙酸銨甲醇溶液(0.lmol/L), -20°C沉淀2h以上或過夜。4°C，15000r/min離心20min，棄上清液，沉淀用丙酮(含體積分?jǐn)?shù)2% P -巰基乙醇，-20°C )洗滌I次，-20°C放置至少Ih后，重復(fù)以上步驟一次，棄上清，留蛋白沉淀。
[0037]對(duì)照例2 TCA/丙麗法提取棉花葉片蛋白質(zhì)
[0038]取用蒸餾水沖洗干凈的棉花葉片約2.5g，迅速在液氮中研磨后加入3倍體積_20°C預(yù)冷的含50% (w/v) TCA (三氯乙酸)的水溶液，上下劇烈顛倒，于4°C靜置2h以上，離心(4°C，12000r/min) 20min，棄上清；將沉淀懸浮于_20°C預(yù)冷的含0.1 % DTT (二硫蘇糖醇)的丙酮溶液中，蝸旋并在_20°C沉淀2h，離心(4°C，12000r/min)20min，棄上清。重復(fù)3次,最后棄上清，留蛋白沉淀。
[0039]實(shí)施例3所提取蛋白葉片蛋白純度檢測(cè)
[0040]檢測(cè)方法:
[0041]1.蛋白質(zhì)定量
`[0042]用1%BAS (牛血清蛋白)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，0.01%考馬斯亮藍(lán)G250，含5%乙醇(濃度為95%)，10%磷酸染色，在紫外分光光度計(jì)上以595nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。
[0043]2.水化
[0044]將置于超低溫冰箱下的蛋白樣品室溫下解凍后，向離心管中加入水化緩沖液(7mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4%CHAPS, 80mmol/LDTT, lmmol/LPMSF,0.3% 載體兩性電解質(zhì)(PH4-7),質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.002%溴酚藍(lán))。本實(shí)驗(yàn)，先用pH3-10的IPG膠條分離棉花葉片的總蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白點(diǎn)主要集中在PH5-8之間(結(jié)果未顯示)。為了使大部分蛋白得到更好地分離，得到較為理想的電泳圖譜，改用了 PH4-7的IPG膠條。實(shí)驗(yàn)中使用pH4~7，長(zhǎng)度分別為24cm和18cm長(zhǎng)的IPG線性膠條，這樣有助于掌握棉花葉片總蛋白在2-DE圖像上整體的分布情況。在保證其他實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下，上樣量為采用:18cm，pH4~7的線性IPG膠條:設(shè)計(jì)每根膠條上樣量分別為300iig，400iig，500iig，600iig上樣總體積為350 u L,以確定最佳上樣量。24cm，pH4~7的線性IPG膠條:設(shè)計(jì)每根膠條上樣量分別為400 u g，500 u g, 600 u g, 700 u g。上樣總體積為450 u L，以確定最佳上樣量。
[0045]選擇兩種不同的IPG膠條和八個(gè)不同的上樣量進(jìn)行雙向電泳，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以期找到最適合的上樣量和最優(yōu)的IPG膠條種類。將蛋白水化液，沿著水化盤的邊緣從左至右線性加入到水化盤中.將已室溫解凍十分鐘的IPG膠條去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層，膠面朝下輕輕地放入水化槽內(nèi)，除去膠面與泡脹液間的氣泡，蓋上膠條槽的蓋子，Ih后滴加2~3mL礦物油，20°C水化13-15個(gè)小時(shí)后。
[0046]3.等電聚焦電泳(IEF)[0047]將水化完成后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至聚焦盤上，用去離子水將預(yù)制好的電極濾紙片濕潤(rùn)，置于IPG膠條的末端，安裝電極，設(shè)定程序參數(shù)并開始運(yùn)行。采用的聚焦程序?yàn)?
[0048]24cm IPG 膠條:100V (Ih) — 200V (Ih) — 500V (Ih) — 1000V (Ih) — 8000V(2h) — 8000~12000V (2h)—維持電壓 500V。
[0049]18cm IPG膠條:250V( lh)— 500V( lh)— 2000VC lh)— 8000V(2h)— 8000 — 65000V(2h)—維持電壓500V。
[0050]4.膠條平衡
[0051]等電聚焦完成后，將水化盤中多余的礦物油倒掉，然后膠面向上轉(zhuǎn)移到一張干燥的濾紙上，用濕潤(rùn)的濾紙吸去IPG膠條上的礦物油，然后在平衡液A中平衡15min，再在平衡液B中平衡15min，再在干凈的濾紙上點(diǎn)兩下，以吸去膠條上多余的平衡液。膠條也可于-70°C下保存。平衡液A、B配制:
[0052]平衡液A:含 36%尿素，2%SDS，25%Tris_HCl (pH8.8)，20%甘油和 2%DTT(現(xiàn)用現(xiàn)加)。
[0053]平衡液B:含36%尿素，2%SDS, 25%Tris_HCl (pH8.8)，20%甘油和 2.5%_3%碘乙酰胺(現(xiàn)用現(xiàn)加)。
[0054]5.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
[0055]平衡后的膠條置于分離效果較好的12%聚丙烯酰胺凝膠上，用0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖(含有痕量溴酚藍(lán))作為封膠液壓頂，從而使使膠不至于飄動(dòng)。(注意膠條與凝膠間不能有氣泡)。按如下參數(shù)進(jìn)行電泳:16°C恒溫下，IW/條，1.5h;10ff/條，4h~6h。電泳至溴酚藍(lán)前沿達(dá)到膠的底部l_2cm時(shí)停止電泳。
[0056]6.剝膠與染色
`[0057]將玻璃板從電泳槽上卸下后依次用自來(lái)水和去離子水沖洗，然后將膠剝下放在洗凈的染色盤里，用去離子水洗三次，每次五分鐘。然后進(jìn)行染色。
[0058]固定:50mL冰乙酸，200mL無(wú)水乙醇，加水至500mL,搖床上輕搖lh。
[0059]敏化:稱取Ig硫代硫酸鈉，17g無(wú)水乙酸鈉，150mL無(wú)水乙醇，加水至500mL,搖床上輕搖30min。
[0060]漂洗:每次取500mL去離子水，水洗3次，每次在搖床上輕搖5min。
[0061]銀染:稱取Ig硝酸銀溶于500mL水，避光、搖床上輕搖30min。
[0062]漂洗:500mL去離子水水洗3次，每次搖床上輕搖10s。
[0063]顯色:稱取25g碳酸鈉，0.1mL甲醒,加水至1L,搖床上快速搖，顯色2次，兩次共約3~4min。
[0064]終止:稱取?.3gEDTA溶于500mL水，搖床上輕搖15min。
[0065]漂洗:5OOmL水洗3次，搖床輕搖5min/次。
[0066]7.圖象的掃描和分析
[0067]染色后的膠用Umax (PowerLook 2100XL)掃描儀掃描，采用透射模式，分辨率為600dpi。圖象用TOQuest軟件動(dòng)檢測(cè)蛋白點(diǎn)，人工去除了錯(cuò)誤檢測(cè)的蛋白點(diǎn)，加入未被檢測(cè)的蛋白點(diǎn)。
[0068]檢測(cè)結(jié)果:
[0069]1.蛋白穩(wěn)定性及純度
[0070]對(duì)比三張圖譜結(jié)果可知:采用酚抽提法(圖1-A)，2_DE圖譜中蛋白點(diǎn)最少.尤其是堿性端蛋白質(zhì)也很模糊，而且有橫向的拖尾，分辨率很低。采用TCA/丙酮法(圖1-B)，蛋白點(diǎn)雖有一定程度的增加但有有較多的縱向和橫向拖尾，表明采用此方法沉淀蛋白時(shí)，提取物中仍含有較多的雜質(zhì)直接影響蛋白質(zhì)的等電聚焦和電泳電泳。而且用此方法獲得的蛋白質(zhì)干粉較少，蛋白干粉得率很低。采用本申請(qǐng)改良的TCA/丙酮沉淀法(圖1-C)中蛋白點(diǎn)較多，尤其在酸性蛋白區(qū)域，用此方案提取蛋白質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好，且蛋白質(zhì)純度較高，幾乎沒有橫條紋和拖尾等紋理現(xiàn)象，電泳圖譜清晰，圓潤(rùn)，說明用此改良的方案適用于棉花的蛋白質(zhì)組研究。
[0071]2.蛋白上樣量的確定及IPG膠條長(zhǎng)度的選擇
[0072]上樣量的確定，不僅與IPG膠條的長(zhǎng)度及pH值范圍有關(guān)，也與凝膠的種類及染色方法有關(guān)[。要想獲得更多的蛋白點(diǎn)，就要保證足夠的上樣量，但是隨著上樣量的加大又會(huì)使樣品中的鹽離子及其它雜質(zhì)含量提高，這就將直接影響等電聚焦時(shí)電壓的上升，會(huì)造成蛋白質(zhì)的沉淀或圖譜橫縱向拖尾；而且會(huì)掩蓋有相似等電點(diǎn)/分子量的低豐度蛋白；較小的上樣量雖會(huì)提高蛋白質(zhì)的分離效果，但過少的上樣量使低豐度蛋白無(wú)法顯示。為探索棉花葉片蛋白質(zhì)雙向電泳的最佳上樣量，本實(shí)驗(yàn)從SDS-PAGE凝膠的分辨率、染色方法及IPG膠條的PH梯度和長(zhǎng)度范圍等條件綜合考慮，利用改良的三氯乙酸/丙酮法提取的蛋白樣品摸索優(yōu)化體系。經(jīng)軟件分析比較，上樣量為(18cm:300 Ug圖2-A，400ii g圖2-B ；24cm:400 Ug圖3_A，500ii g圖3-B)時(shí)，蛋白點(diǎn)數(shù)明顯較少，主要為酸性端蛋白，堿性端蛋白點(diǎn)較少，檢測(cè)范圍受到限制，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。但由圖可觀察到兩種膠條隨著上樣量的加大，并沒有呈現(xiàn)背景很重的現(xiàn)象，而且蛋白點(diǎn)都在增加；上樣量達(dá)到(18cm:500 Ug圖2-C ；24cm:600 y g圖3-C)時(shí)，蛋白點(diǎn)數(shù)量增幅很大，經(jīng)軟件分析有大約(18cm:900, 24cm:970)個(gè)點(diǎn)，堿性端蛋白 和低豐度蛋白數(shù)量明顯增加，整個(gè)凝膠圖上背景色很淺，蛋白點(diǎn)邊界清晰，分離均勻，圓潤(rùn)，橫向與縱向拖尾少；上樣量為(18cm:600 y g圖2-D ；24cm:700 u g圖3-D)時(shí)，蛋白點(diǎn)雖然有所增加，但增加不明顯，在酸性端和堿性端蛋白點(diǎn)出現(xiàn)橫向與縱向拖尾及外形不規(guī)則，說明上樣量增加，高豐度蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)過大，一些高豐度蛋白過于集中、交叉，重疊，低豐度蛋白被掩蓋。影響其他蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離，這樣不利于后續(xù)蛋白點(diǎn)的檢測(cè)、鑒定。在圖2-C和圖3-C中凝膠背景清晰，蛋白點(diǎn)較多。綜合考慮，為了能夠得到更好的蛋白分離效果，獲得感興趣蛋白，決定采用最佳上樣量為(18cm:500 ii g, 24cm:600 yg)，另外，由圖2和圖3比較觀察可知，棉花葉片蛋白質(zhì)廣泛分布于pH4~7的范圍，但是18cm膠條電泳結(jié)果(圖2-C)，蛋白點(diǎn)非常密集，蛋白點(diǎn)之間不易區(qū)分，而且在膠條兩端，部分蛋白質(zhì)在等電聚焦后沒有得到很好的分離，而使用了 24cm膠條(圖3-C)后，上述問題得到了較好的解決。所以，上樣量要兼顧最后蛋白分離的效果及分離到蛋白點(diǎn)的多少及重復(fù)性，綜合考慮，本試驗(yàn)最終采用PH4~7，24cm的IPG膠條。
【權(quán)利要求】
1.一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，包括以下步驟: 1)取棉花葉片，用液氮研磨； 2)經(jīng)液氮研磨的葉片粉末轉(zhuǎn)入離心管中，并加入預(yù)冷的三氯乙酸提取液，混合均勻，放在- 20°C冰箱中兩小時(shí)以上，每半小時(shí)震蕩一次； 3)離心管離心，棄上清，留沉淀，向沉淀中加入-20°C預(yù)冷丙酮溶液，混合均勻，于-20°C靜置2~4h ; 4)離心管離心，棄上清，留沉淀，洗滌沉淀，并保留沉淀； 5)沉淀抽真空，揮發(fā)丙酮，得到蛋白質(zhì)干粉； 6)取干燥的蛋白粉末，加入蛋白裂解液，350C的水浴中裂解lh，離心，取上清，所述上清為棉花葉片蛋白溶解液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，所述三氯乙酸提取液的配方為:10%TCA,0.07%-0.1%DTT,0.5% 3 -巰基乙醇，lmmol/L PMSF，溶劑為丙酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，所述丙酮溶液含有 0.07%-0.1%DTT 和 lmmol/L PMSF。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，所述蛋白裂解液的配方為:7mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4%CHAPS, 80mmol/L DTT, lmmol/L PMSF，0.3% 載體兩性電解質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，用液氮研磨葉片時(shí)加入PVPP和石英砂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，所述三氯乙酸提取液的用量是每0.4克葉片加入1.8mL預(yù)冷三氯乙酸提取液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，步驟4)所述沉淀重復(fù)洗滌3次或3次以上，或過夜洗滌，至接近白色。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的一種棉花葉片蛋白質(zhì)提取方法，其特征在于，所述蛋白裂解液的用量是每毫克干燥蛋白干粉加入蛋白裂解液20 yl。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK103665121SQ201210319381
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】曲延英, 陳全家, 郭忠軍, 孫國(guó)清 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)