專利名稱：膜聯(lián)蛋白1抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與膜聯(lián)蛋白-Al結(jié)合的特異性結(jié)合分子和產(chǎn)生這種特異性結(jié)合分子的雜交瘤細(xì)胞系，特別涉及該分子的抗體和片段。這種特異性結(jié)合分子可用于治療T-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。
背景技術(shù)：
由于糖皮質(zhì)激素(GCs)能夠同時(shí)阻止固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，因此經(jīng)常被用于治療各種慢性自身免疫疾病。通過本發(fā)明人和其他研究組過去約10年的研究已經(jīng)表明GCs對(duì)固有免疫應(yīng)答的某些炎癥效應(yīng)是由被稱作膜聯(lián)蛋白-1(Anx-Al)的蛋白介導(dǎo)的。已經(jīng)證明該蛋白在許多細(xì)胞種類包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的自我平衡控制中發(fā)揮著作用。然而，經(jīng)常被忽視的方面是Anx-Al在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用。令人驚訝的是考慮已經(jīng)將Anx-Al提議作為GCs的藥理作用的第二信使之一。本發(fā)明人先前已經(jīng)證明，Anx-Al通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)的強(qiáng)度在T細(xì)胞中發(fā)揮自我平衡作用(D，Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007)。而且，本發(fā)明人已經(jīng)證明，高水平的Anx-Al降低T細(xì)胞活化的閾值，并促進(jìn)其分化成Thl細(xì)胞，但Anx-Al基因缺陷型小鼠卻表現(xiàn)出T細(xì)胞活化受損和分化成Th2細(xì)胞的增加(D，Acquisto et al.，Eur.J.1mmunol.37:3131-3142，2007)。W02005/027965記載了凋亡中性粒細(xì)胞將抗炎信號(hào)傳遞到樹突細(xì)胞的機(jī)制的發(fā)現(xiàn)過程，并識(shí)別了干擾該過程的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)識(shí)別出一種在T細(xì)胞活化的特異性抑制方面性能良好且沒有任何不利的細(xì)胞毒性效應(yīng)的單克 隆抗體。該抗體可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥。因此，本發(fā)明提供一種針對(duì)具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子。定義本文中使用的“特異性結(jié)合分子”是一對(duì)彼此具有結(jié)合特異性的分子中的成員。特異性結(jié)合對(duì)中的成員可以是天然來源的或其整個(gè)或部分是合成產(chǎn)生的。成對(duì)分子中的一個(gè)成員的表面具有一個(gè)能與成對(duì)分子中的另一成員的特定空間和極性結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合從而互補(bǔ)的區(qū)域，該區(qū)域可以為突起或凹陷。因此，每對(duì)成員具有彼此特異性結(jié)合的特性。各種類型的特異性結(jié)合對(duì)的實(shí)例為抗原-抗體、生物素-親和素、激素-激素受體、受體-配體、酶-基質(zhì)。本發(fā)明主要考慮抗原-抗體類型的反應(yīng)。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子與Anx-Al的結(jié)合親和力大于與其它分子的結(jié)合親和力，即該特異性結(jié)合分子與Anx-Al特異性結(jié)合。與Anx-Al結(jié)合的特異性結(jié)合分子包括抗Anx-Al抗體和適體。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子通常為抗體。本發(fā)明的抗Anx-Al抗體通過阻止T細(xì)胞活化而發(fā)揮功能，因此，當(dāng)被給藥時(shí)，該抗體可以用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，該疾病通常是由異常的T細(xì)胞活化引起的。本文中使用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，該抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合抗原，無論該抗原是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的。該術(shù)語還包括任何具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白質(zhì)，該結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域。這些可以從天然來源得到，它們還可以部分或全部通過合成得到?？贵w是通常含有兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈的多肽，所述輕鏈小于所述重鏈。哺乳動(dòng)物的抗體有兩種稱作λ和K的輕鏈。每條重鏈和每條輕鏈都由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。重鏈可變區(qū)被稱作Vh區(qū)，輕鏈可變區(qū)被稱作'區(qū)。對(duì)于K輕鏈來說，'區(qū)也可以被稱作Vk區(qū)。重鏈和輕鏈的每個(gè)可變區(qū)都包括3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，CDR1、CDR2 和 CDR3。將這些分別稱作 VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和VHCDR3?？贵w的實(shí)例有免疫球蛋白亞型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)和它們的亞型子類；包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb、Fd ;和雙體抗體。所述抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。本文中，單克隆抗體可以被稱作“mAb”。
具體實(shí)施例方式膜聯(lián)蛋白是一類結(jié)合鈣和磷脂的細(xì)胞蛋白，也被稱作脂皮質(zhì)蛋白。膜聯(lián)蛋白家族有13個(gè)成員，包括膜聯(lián)蛋白Al、膜聯(lián)蛋白A2和膜聯(lián)蛋白A5。膜聯(lián)蛋白Al也被稱作膜聯(lián)蛋白-1，在本文中被稱作“Anx-Al”。膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)是一種分子量為37kDa的蛋白，并且最初被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素活動(dòng)的介導(dǎo)物。在過去的幾年中，已經(jīng)有證據(jù)表明Anx-Al通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)的強(qiáng)度在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，特別是在T細(xì)胞中發(fā)揮著自我平衡的作用。Anx-Al在體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中發(fā)揮著炎癥內(nèi)源性下調(diào)物的作用。

圖1A是顯示Anx-Al三維結(jié)構(gòu)的帶狀圖。人類有8個(gè)編碼Anx-Al的核苷酸序列。其中，僅有四個(gè)被翻譯，因此有四種Anx-Al的亞型，所述四個(gè) 亞型被命名為ANXA1-002、ANXA1-003、ANXA1-004和ANXA1-006。這些序列可以從數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(www.ensembl.0rg)中得到，且被命名為 0TTHUMT00000052664(ANXAl-002)、 0TTHUMT00000052665(ANXA1-003)、0TTHUMT00000052666 (ANXA1-004)和 0TTHUMT00000052668 (ANXA1-006)。圖 2A 顯示了一種人類膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)的ANXA1-003亞型的氨基酸和核苷酸序列。圖2B、2C和2D分別顯示了亞型ANXA1-002、ANXA1-004和ANXA1-006的氨基酸序列。從圖2可以看出，亞型ANXA1-002.ANXA1-004和ANXA1-006是ANXA1-003的短剪接變體或是少量氨基酸發(fā)生改變的ANXA1-003的變體。許多研究已經(jīng)表明，被稱作Ac.2-26的Anx-Al的N-末端肽作為整個(gè)蛋白質(zhì)的生物活性代表物(surrogate)(參見例如Lim et al., Proc Natl Acad SciUSA95, 14535-9，1998)。圖1B是膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列和該生物活性序列位點(diǎn)的示意圖。肽Ac.2-26是一種乙?；碾?，該肽具有圖2所示的Anx-Al的全長(zhǎng)氨基酸序列的氨基酸殘基2-26的序列。圖1C顯示了肽Ac.2-26的序列，該序列如下所述:ch3co-amvseflkqawfieneeqeyvqtvkAnx-Al及其N-末端衍生的生物活性肽通過甲酰肽受體(FPR)家族的成員介導(dǎo)它們的生物效應(yīng)。Anx-Al通過直接結(jié)合和活化該家族中的成員類甲酰肽受體-1 (FPRL-1)在中性粒細(xì)胞溢出和固有免疫中起到反向調(diào)節(jié)作用。先前，本發(fā)明的發(fā)明人就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在存在hrAnx-Al的情形下，通過刺激FPRL-1來刺激T細(xì)胞可提高T細(xì)胞的活化作用(DJ Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007)。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子可與膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)結(jié)合。特異性結(jié)合分子結(jié)合的Anx-Al是具有圖2A所示的多肽序列的人類Αηχ-Α1。在第一方面中，本發(fā)明提供一種針對(duì)具有圖2Α所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子。本發(fā)明的這個(gè)方面還涉及一種包括本發(fā)明的第一方面的特異性結(jié)合分子的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，或與每個(gè)單獨(dú)的 CDR 具有至少70%同一性的氨基酸序列的特異性結(jié)合分子。該特異性結(jié)合分子通常為抗體。在一種實(shí)施方式中，所述特異性結(jié)合分子具有互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)VIXDRl、VIXDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2和VHCDR3，或與它們具有至少70%同一性的氨基酸序列，所述每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)都各自具有如下所述的氨基酸序列，其中VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKGVHCDR3 為 WGLGYYFDY。CDRs 是根據(jù)保守序列定義(Kabat et al in “Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，Nat’ 1.1nst.Health, Bethesda, MD (1987))和結(jié)構(gòu)化定義(Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-17 (1987))的結(jié)合指定的。后來在 Carter etal,Proc Nat，I Acad Sci U S A.89:4285-9 (1992)中也記載了這些定義。本發(fā)明還涉及上述肽序列的變體。本文中使用的術(shù)語“變體”指的是具有相似氨基酸序列和/或保持相同功能的蛋白質(zhì)。例如，術(shù)語“變體”包括包含增加、缺失或置換等一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的變體的一個(gè)實(shí)例是蛋白，如融合蛋白，所述蛋白包括上面定義的肽，但其中用一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸置換了上面定義的肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。技術(shù)人員知道有幾種氨基酸具有相似的性質(zhì)。通?？梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)其它的這類氨基酸來置換物質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)同類氨基酸，而不會(huì)喪失該物質(zhì)的所需活性。因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通常能夠互相置換(具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)。在這些可能的置換中，優(yōu)選使用甘氨酸和丙氨酸互相置換(因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)較短的側(cè)鏈)，并且優(yōu)選使用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸互相置換(因?yàn)樗鼈兙哂休^大的脂肪族疏水側(cè)鏈)。其它可經(jīng)常互相置換的氨基酸包括:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨基酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸);天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸);以及半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。這種性質(zhì)的置換通常被稱作“保守的”或“半保守”的氨基酸置換。因此，本發(fā)明涉及一種具有CDRs的特異性結(jié)合分子， 所述CRDs具有上述的氨基酸序列，但在CDRs中有一個(gè)或多個(gè)保守置換，從而使得CFRs的氨基酸序列與上述序列具有至少70%的同一性。例如，與上面列出的⑶Rs的氨基酸序列相比，每個(gè)⑶R可有1、2、3、4或5個(gè)保守置換(取決于⑶R)。例如，在上面列出的VIXDRl的氨基酸序列中能有1、2或3個(gè)保守置換，在上面列出的VLCDR2的氨基酸序列中能有I或2個(gè)保守置換，在上面列出的VLCDR3的氨基酸序列中能有I或2個(gè)保守置換，在上面列出的VHCDRl的氨基酸序列中能有1、2或3個(gè)保守置換，在上面列出的VHCDR2的氨基酸序列中能有1、2、3、4或5個(gè)保守置換，在上面列出的VHCDR3的氨基酸序列中能有1、2或3個(gè)保守置換，并且所述序列仍保持與上面列出的CDR序列至少70%的同一性。氨基酸可以用下述的三字母代碼和單字母代碼表示:甘氨酸(G或Gly)、丙氨酸(A或Ala)、纈氨酸(V或Val)、亮氨酸(L或Leu)、異亮氨酸(I或lie)、脯氨酸(P或Pro)、苯丙氨酸(F或Phe)、酪氨酸(Y或Tyr)、色氨酸(W或Trp)、賴氨酸(K或Lys)、精氨酸(R或Arg)、組氨酸(H或His)、天門冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、天冬酰胺(N或Asn)、谷氨酰胺(Q或Gin)、半胱氨酸(C或Cys)、蛋氨酸(M或Met)、絲氨酸(S或Ser)和蘇氨酸(T或Thr)。在殘基可以是天門冬氨酸或天冬酰胺的位置，可以使用符號(hào)Asx或B。在殘基可以是谷氨酸或谷氨酰胺的位置，可以使用符號(hào)Glx或Z。除非上下文中指定，否則所提及的天門冬氨酸包括天冬氨酸鹽，且谷氨酸包括谷氨酸鹽。也可以對(duì)上述蛋白如融合蛋白的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸的缺失或插入。因此，例如，對(duì)多肽活性沒有實(shí)質(zhì)作用的氨基酸或至少?zèng)]有消除該活性的氨基酸是可以缺失的。這種缺失可能是有益的，因?yàn)樵诒３只钚缘耐瑫r(shí)，降低了該多肽的整體長(zhǎng)度和分子量。這可以減少特定目的所需的多肽量，如可以減少劑量水平。也可以對(duì)上述的融合蛋白進(jìn)行氨基酸插入。進(jìn)行該過程可以改變本發(fā)明物質(zhì)的性質(zhì)(如有助于識(shí)別、純化或表達(dá)，如上文與融合蛋白有關(guān)的解釋)?？梢允褂萌魏魏线m的技術(shù)進(jìn)行與上述序列有關(guān)的氨基酸改變，如通過使用定點(diǎn)誘變或固態(tài)合成。`應(yīng)該理解的是本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸置換或插入可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸進(jìn)行。無論使用的是天然氨基酸還是合成氨基酸，優(yōu)選僅存在L-氨基酸。本領(lǐng)域中已知的“同一性”是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系，這是通過比較序列確定的。在本領(lǐng)域中，同一性也可以指多肽或多核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)度，視具體情況而定，這是通過比對(duì)序列的字符串確定的。雖然有多種方法都可以測(cè)量?jī)蓚€(gè)多肽序列或兩個(gè)多核苷酸序列之間的同一性，但是用于確定同一性的一般方法是在計(jì)算機(jī)程序中進(jìn)行編碼。優(yōu)選的用于確定兩個(gè)序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序包括但不局限于 GCG 程序包(Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN和 FASTA(Atschul et al.，J.Molec.Biol.215，403(1990))。人們可以使用程序如CLUSTAL程序比較氨基酸序列。所述程序比較氨基酸序列，并通過在任一適合的序列中插入空格找到最優(yōu)比對(duì)。用最優(yōu)比對(duì)能夠計(jì)算出氨基酸的同一性或相似性(同一性加上保守氨基酸的類型)。程序如BLASTx將比對(duì)最長(zhǎng)的一段相似序列，并賦給一個(gè)合適的值。因此，可能獲得發(fā)現(xiàn)多個(gè)相似區(qū)域的比較，每個(gè)區(qū)域都有不同的評(píng)分。本發(fā)明中考慮了兩種類型的同一性分析。兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比是通過以實(shí)現(xiàn)最佳比對(duì)為目的的序列比對(duì)(例如，為了與序列最佳比對(duì)，可以在第一個(gè)序列中引入缺口)并比較相應(yīng)位置的氨基酸殘基或核苷酸確定的?！白顑?yōu)比對(duì)”是指兩個(gè)同一性百分比最高的序列的比對(duì)。同一性百分比是通過被比較的序列中同源氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)量確定的(即，同一性百分比=同源位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量X100)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù)學(xué)算法能夠完成兩個(gè)序列之間同一性百分比的確定。用于比較兩個(gè)序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)實(shí)例是Karlin and Altschul (1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264-2268 中的算法，后修改為 Karlin and Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877。Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 中的NBLAST和XBLAST程序已經(jīng)納入了該算法。用分?jǐn)?shù)=100、字長(zhǎng)=12的NBLAST程序可以進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，以得到與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。用分?jǐn)?shù)=50、字長(zhǎng)=3的XBLAST程序可以進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，以得到與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。為了得到用于比較目的的間隙比對(duì)，可以使用Altschul et al.(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中記載的間隙BLAST。或者，可以使用PS1-Blast進(jìn)行重復(fù)檢索，該重復(fù)檢索可檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系(Id.)。當(dāng)使用BLAST、間隙的BLAST和PS1-Blast程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見http://www.ncb1.nlm.nih.gov。序列比較使用的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)實(shí)例是CABIOS (1989)中的Myers和Miller算法。屬于CGC序列比對(duì)軟件包 的ALIGN程序(版本2.0)已經(jīng)納入了該算法。本領(lǐng)域中已知的其他序列分析算法包括Torellis and Robotti (1994) Comput.Appl.Biosc1.，10:3-5 中記載的 ADVANCE 和 ADAM ；以及 Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-8 中記載的FASTA。在FASTA內(nèi)，ktup是一個(gè)設(shè)置靈敏度和檢索速度的控制選項(xiàng)。通常，使用HGMP (人類基因組圖譜計(jì)劃)提供的BLAST計(jì)算機(jī)程序(Atschul etal.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))中的默認(rèn)參數(shù)時(shí)，本發(fā)明特異性結(jié)合分子的CDRs的氨基酸序列在氨基酸水平上與上述CDRs的氨基酸序列具有至少70%的同一性。更典型地，CDR序列在氨基酸水平上與上述序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的同一性。通常，本發(fā)明中特異性結(jié)合分子的每個(gè)⑶R序列與上面列出的CDRs的氨基酸序列都有該水平的同一性。或者，本發(fā)明的特異性結(jié)合分子的任何I個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)或5個(gè)⑶Rs與上面列出的⑶Rs的氨基酸序列有該水平的同一性。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子通常是抗體，更典型的是單克隆抗體。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體是人源化的。通過修飾抗體的氨基酸序列可以將本發(fā)明的單克隆抗體人源化。降低本發(fā)明特異性結(jié)合分子的免疫原性的方法包括例如通過定位誘變或其它常用的分子生物學(xué)方法(Roguska et al Protein Eng.9895-904 (1996))將CDR移植到適合的抗體主鏈骨架上或重
塑可變表面殘基。其它可用的方法可以包括分子內(nèi)潛在的T細(xì)胞表位的識(shí)別和隨后如通過定點(diǎn)誘變移除這些表位(去免疫法)。當(dāng)將特異性結(jié)合分子用作藥物時(shí)可能需要所述特異性結(jié)合分子的人源化。也可以按照需要進(jìn)行CDR區(qū)域或骨架序列周圍的人源化?？梢允褂脝慰寺】贵w和其它抗體并通過重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生保持原抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這類技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)的DNA引入不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加上骨架區(qū)。參見如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400。產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞可進(jìn)行基因突變或其它改變，這可能改變或不改變所得抗體的結(jié)合特異性。由于可以在多個(gè)方面對(duì)抗體進(jìn)行修飾，術(shù)語“抗體”應(yīng)該被解釋為涵蓋具有所需特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特異性結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語涵蓋抗體片段、衍生物、功能等效物和抗體類似物，人源化抗體，包括任何包括免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，不論是天然的還是整體或部分合成的。因此，涵蓋了與另一種多肽融合的含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等效物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023中記載了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。人源化的抗體可以是被修飾的具有非人如小鼠抗體的可變區(qū)和人類抗體的恒定區(qū)的抗體。例如，專利號(hào)為N0.5225539的美國專利中記載了制備人源化抗體的方法。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子可以是抗體的片段。已經(jīng)證明一個(gè)完整抗體的片段能夠發(fā)揮結(jié)合抗原的作用。結(jié)合片段的實(shí)例有(i)由Vu Vh，(^和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由Vh和ChI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由 Vh 結(jié)構(gòu)域組成的 dAb 片段(Ward, E.S.et al., Nature341:544-546 (1989))；(v)分離的⑶R區(qū)域；(vi) F(ab’)2片段，包括兩個(gè)聯(lián)合的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域是通過肽連接物連接的，所述肽連接物使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相連接以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird et al., Science242:423-426 (1988) ; Huston etal., PNAS USA85:5879-5883 (1988)) ; (viii )雙特異性單鏈 Fv 二聚體(PCT/US92/09965)和(ix) “雙體抗體”，通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(W094/13804;P.Hollingeret al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)) 通常，所述片段為 Fab、F(ab，)2或Fv片段或scFv分子。雙體抗體是多肽的多聚體，每個(gè)多肽都具有第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域，所述第一結(jié)構(gòu)域具有免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合區(qū)域，所述第二結(jié)構(gòu)域具有免疫球蛋白重鏈的結(jié)合區(qū)域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相連接(例如，通過肽連接物)但不能彼此結(jié)合成抗原結(jié)合位點(diǎn):抗原結(jié)合位點(diǎn)是通過將多聚體內(nèi)一個(gè)多肽的第一結(jié)構(gòu)域和多聚體內(nèi)另一多肽的第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成的(W094/13804)。

當(dāng)使用雙特異性抗體時(shí)，可以是常規(guī)的雙特異性抗體，這些抗體可以用各種方法(Hollinger&ffinter, Current Opinion Biotechnol.4:446-449 (1993))來制造，如通過化學(xué)方法制備或從混合的雜交瘤中制備，或這些抗體可以是任何上述的雙特異性抗體片段。優(yōu)選使用scFv 二聚體或雙體抗體,而非完整抗體。雙體抗體和scFv可以僅使用可變結(jié)構(gòu)域而不使用Fe區(qū)域來構(gòu)建，這潛在地減少抗獨(dú)特型反應(yīng)的效果。其它形式的雙特異性抗體包括 Traunecker et al., EMBO JournallO: 3655-3659 (1991)中記載的單鏈 “ Janusins”。也可以使用與雙特異性整體抗體不同的雙特異性雙體抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)贓.coli中很容易被構(gòu)建和表達(dá)。使用噬菌體展示技術(shù)(W094/13804)能夠從文庫中很容易的篩選出具有合適的結(jié)合特異性的雙體抗體(和許多其它的多肽如抗體片段)。例如，如果對(duì)抗原X有特異性的雙體抗體的一個(gè)臂保持恒定，那么在另一個(gè)臂變化時(shí)就可以制備文庫并篩選出具有合適特異性的抗體。單克隆抗體VJ-4B6是雜交瘤細(xì)胞系VJ-4B6-E5-B10-D4分泌的，所述細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)、HealthProtection Agency,Centre for Emergency Preparedness and Response, PortonDown, Salisbury, SP40JG, United Kingdom、登記號(hào)為 n0.10060301。保藏是由Fulvio D’Acquisto, Queen Mary and Westfield College, Centre forBiochemical Pharmacology, Charterhouse Square, London EC1M6BQ 完成的。根據(jù)歐洲專利公約的31(1) (d)款，保藏人已經(jīng)授權(quán)申請(qǐng)人可在本申請(qǐng)中援引該保藏材料，并且已經(jīng)給出無限制且不可撤銷的承諾，同意將該保藏材料向公眾提供。雜交瘤細(xì)胞系VJ-4B6-E5-B10-D4可產(chǎn)生與膜聯(lián)蛋白-Al特異性結(jié)合的單克隆抗體VJ-4B6。本發(fā)明的單克隆抗體VJ-4B6屬于IgG2b亞型?？贵wVJ-4B6是針對(duì)具有圖2所示的氨基酸序列的全長(zhǎng)人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的。圖11中顯示了抗體VJ-4B6的輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖12顯示了VJ-4B6的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其中標(biāo)注了 CDRs。圖12還顯示了 VJ-4B6的輕鏈恒定區(qū)的最初幾個(gè)氨基酸。圖13中顯示了抗體VJ-4B6的重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖14顯示了VJ-4B6的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，其中標(biāo)注了⑶Rs。圖14還顯示了 VJ-4B6的重鏈恒定區(qū)的最初幾個(gè)氨基酸?？贵wVJ-4B6 的 CDRs 如下:VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKGVHCDR3 為 WGLGYYFDY本發(fā)明涉及具有如本文所述的抗體VJ-4B6的CDRs的特異性結(jié)合分子，并且本發(fā)明還涉及具有與如本文所述的抗體VJ-4B6的一個(gè)或多個(gè)⑶Rs有至少70%同一性的⑶Rs的特異性結(jié)合分子。本發(fā)明還涉及具有抗體VJ-4B6的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)或具有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的特異性結(jié)合分子。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種具有具有圖11和/或圖13所示的氨基酸序列的多肽的特異性結(jié)合分子。本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式還涉及特定的抗體片段，所述片段具有具有圖11所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和/或具有圖13所示的氨基酸酸序列的重鏈可變區(qū)。例如，該實(shí)施方式涉及Fab、F(ab’)2或Fv片段和scFv分子。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明還涵蓋包括具有圖12和/或圖14所示的氨基酸序列的多肽的特異性結(jié)合分子。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子，所述雜交瘤細(xì) 胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為N0.10060301。在第二方面，本發(fā)明提供一種可產(chǎn)生特異性結(jié)合分子的雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生針對(duì)具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為 N0.10060301。在第三方面，本發(fā)明提供一種包括本發(fā)明的特異性結(jié)合分子的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明第三方面的組合物可以用任何方便的途徑制備。本發(fā)明的藥物組合物除包括本發(fā)明的特異性結(jié)合分子外，通常還包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、運(yùn)載工具、緩沖液或穩(wěn)定劑。所述載體包括但不局限于生理鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、脂質(zhì)體、水、甘油、聚乙二醇、乙醇及其組合。該藥物組合物可以為任何適合的形式，這取決于對(duì)患者給藥所需的方法。該藥物組合物可以以單位劑型提供，通常是用密閉容器提供，并且可以作為試劑盒的一部分來提供。這種試劑盒通常(雖然不是必須的)包括使用說明書。該試劑盒可以包括多個(gè)所述單位劑型?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)耐緩绞顾幬锝M合物適合于給藥，如通過口服(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或透皮)、陰道或非腸道(包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或真皮內(nèi)注射)途徑。該組合物可通過藥學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法制備，例如，通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。適合口服給藥的藥物組合物能夠以離散單元如膠囊或藥片、粉末或顆粒、溶液、酏劑或懸浮液(在水或非水液體中；或者作為可食用的泡沫或攪拌泡沫(Whips);或作為乳劑)存在。用于藥片或硬明膠膠 囊的合適賦形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或硬脂酸鹽。用于軟明膠膠囊的合適賦形劑包括如植物油、蠟、油脂、半固態(tài)或液態(tài)多元醇等。對(duì)于溶液和酏劑的制備，可使用的賦形劑包括如水、多元醇和糖類。對(duì)于懸浮液的制備，可使用油(例如植物油)來提供水包油或油包水懸浮液。適合經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以離散貼劑存在，這是為了在很長(zhǎng)的一段時(shí)間中可以與受體的表皮保持緊密接觸。例如，活性成分可通過PharmaceuticalResearch, 3 (6):318(1986)中普遍記載的電離子滲入療法從貼劑中釋放出來。適合局部給藥的藥物組合物可制造成藥膏、乳脂、懸浮液、洗液、粉劑、溶液、糊劑、凝膠劑、噴霧、氣溶膠或油。對(duì)于眼睛或其它外部組織如口和皮膚的感染，優(yōu)選使用局部藥膏或乳脂形式的組合物。配制軟膏時(shí)，可以使用活性成分與石蠟或可與水混溶的軟膏基質(zhì)?；蛘撸钚猿煞挚梢灾瞥删哂兴腿橹|(zhì)或油包水基質(zhì)的乳脂。適合眼睛局部給藥的藥物組合物包括眼藥水，其中活性成分溶解或懸浮在合適的載體特別是水溶劑中。適合口中局部給藥的藥物組合物包括糖果、藥片和漱口水。適合直腸給藥的藥物組合物可以栓劑或灌腸劑存在。適于鼻腔給藥且載體是固體的藥物組合物包括例如粒度在20-500微米范圍內(nèi)的粗粉劑，使用鼻煙的方式給藥，即將持有粉劑的容器靠近鼻子并通過鼻腔通道將容器內(nèi)的粉劑迅速吸入。通過噴鼻劑或滴鼻劑給藥且載體是液體的藥物組合物包括活性成分的水性或油性溶液。
適于吸入給藥的藥物組合物包括可以由各種類型的壓力定量氣溶膠、噴霧器或吹藥器產(chǎn)生的微粒粉塵劑或霧劑。適合陰道給藥的藥物組合物可以以陰道栓、棉球、乳脂、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧制劑存在。適合腸胃外給藥的藥物組合物包括水和非水無菌注射液以及水和非水無菌懸浮液，所述注射液可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使該劑型與目標(biāo)受試者的血液基本上等滲的溶質(zhì)；所述懸浮液可以含有懸浮劑和增稠劑。用于注射用溶液劑的賦形劑包括例如水、乙醇、多元醇、丙三醇和植物油。所述組合物可以置于單位劑量或多劑量的容器內(nèi)，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以儲(chǔ)藏于冷凍干燥(凍干的)的條件下，僅需添加無菌液體載體，例如注射用水，就可以立即使用?？捎脽o菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨時(shí)的注射溶液劑和懸浮液。藥物組合物可包括防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味齊U、鹽(本發(fā)明的物質(zhì)本身就可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式提供)、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。除本發(fā)明的分子外，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有一種或多種其它治療活性劑。在某些實(shí)施方式中，活性藥物濃縮物的劑型可以包括藥學(xué)上可接受的等滲劑、緩沖劑和藥學(xué)上可接受的表面活性劑。或者，所述劑型可以包括活性成分和磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、吐溫80或吐溫20 (降低攪動(dòng)誘導(dǎo)的聚集風(fēng)險(xiǎn)的表面活性劑)和水(USP/Ph.Eur)，任選地可將pH調(diào)整到約6.0-7.0，如6.5左右?；钚运幬餄饪s物可以被凍干或不被凍干。其它劑型可以包括緩沖劑三水乙酸鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑氯化鈉、調(diào)節(jié)pH的乙酸和注射用水。本發(fā)明組合物的劑量范圍較寬,其劑量范圍取決于治療的疾病或失調(diào)、治療的個(gè)體的年齡和狀況等，而且醫(yī)生將最終決定所使用的合適劑量。該劑量可適當(dāng)?shù)刂貜?fù)使用。如果產(chǎn)生副反應(yīng)，則可根據(jù)日常臨床實(shí)踐減少劑量或該劑量的頻率。對(duì)于哺乳動(dòng)物特別是人類給藥，預(yù)期的活性劑的日劑量為I μ g/kg體重至IOmg/kg體重,通常為10 μ g/kg體重至lmg/kg體重。在任何情況下，醫(yī)生將決定最適合個(gè)體的實(shí)際劑量，該劑量取決于各種因素，包括個(gè)體的年齡、體重、性別和應(yīng)答等。上述劑量是一般情況的示例。當(dāng)然，也有使用較高劑量或較低劑量的實(shí)例，并且這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子可以用在醫(yī)藥學(xué)上，如用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。因此，在第四方面，本發(fā)明提供一種供醫(yī)藥學(xué)上使用的本發(fā)明的特異性結(jié)合分子。在第五方面，本發(fā)明提供一種用于治 療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的本發(fā)明的特異性結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的這方面還包括治療受試者的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，通常是需要被治療的受試者，所述方法包括向受試者給藥本發(fā)明的特異性結(jié)合分子。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的特異性結(jié)合分子在制備用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途，或還涉及本發(fā)明的特異性結(jié)合分子在制備治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。所述治療方法可以用于人類受試者或動(dòng)物受試者，而且本發(fā)明同樣涉及在人類藥品和/或動(dòng)物藥品中的用途。本發(fā)明的特異性結(jié)合分子優(yōu)選以“治療有效量”向個(gè)體給藥，該量足以顯示出對(duì)個(gè)體的益處。本文中使用的“治療”包括能夠?qū)θ祟惢蚍侨祟悇?dòng)物優(yōu)選為哺乳動(dòng)物有益的任何方案。治療可以是針對(duì)現(xiàn)存的病癥或可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。在本發(fā)明的這個(gè)方面，本發(fā)明的特異性結(jié)合分子可以用于治療由T細(xì)胞介導(dǎo)的各種不同疾病。在本文中，“T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病”是指T細(xì)胞在發(fā)病或疾病或病癥的發(fā)展中能夠發(fā)揮作用的任何疾病或病癥。T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病通常是由異常的T細(xì)胞活化引起的。相應(yīng)地，可以通過阻止Anx-Al的活性而阻止T細(xì)胞的活化來治療這種疾病，本文中已經(jīng)證明這可以通過單克隆抗體VJ-4B6起作用。通常，本發(fā)明中治療的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是Thl細(xì)胞起作用的疾病。T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病包括但不局限于移植物抗宿主疾病、移植排斥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、HIV和/或AIDS、牛皮癬、流產(chǎn)和一些自身免疫疾病。根據(jù)本發(fā)明可治療的自身免疫疾病包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、艾迪生氏病(Addison’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、硬皮癥、多肌炎、糖尿病且特別是某些形式的糖尿病(例如，青少年糖尿病)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、尋常型天皰瘡、炎性腸病、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、貝賽特氏癥(Behfefs disease)
和舍格倫式綜合癥(Sjiigren's disease)。典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)
性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、動(dòng)脈硬化、HIV、AIDS或牛皮癬。更典型地，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥。

本文中限定的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病還包括流產(chǎn)。本文中限定的治療可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。因此本發(fā)明的特異性結(jié)合分子可以用來預(yù)防流產(chǎn)。已知的是失控的Thl應(yīng)答與流產(chǎn)有關(guān)，并且增加的Th2應(yīng)答有助于懷孕。典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中，認(rèn)為是滑膜中T細(xì)胞識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞且與抗原呈遞細(xì)胞相互作用。這些細(xì)胞一旦被活化，就會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子和效應(yīng)物分子；細(xì)胞因子的連續(xù)放大生產(chǎn)會(huì)形成“細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)”，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的活化和誘導(dǎo)炎性過程，使軟骨和骨頭的退化和吸收達(dá)到最高。隨著時(shí)間的推移，會(huì)出現(xiàn)骨腐蝕，軟骨損壞，以及完全喪失關(guān)節(jié)的完整性。最終，可能會(huì)影響多個(gè)器官系統(tǒng)。在另一種實(shí)施方式中，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是多發(fā)性硬化癥(MS)。在另一種實(shí)施方式中，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是動(dòng)脈硬化。炎癥在冠狀動(dòng)脈疾病和動(dòng)脈硬化的其它臨床表現(xiàn)中起著關(guān)鍵的作用。免疫細(xì)胞控制早期的粥樣硬化病變，它們的效應(yīng)物分子加速了病變的進(jìn)程，并且炎癥的活化可以引起急性冠狀動(dòng)脈綜合癥。適應(yīng)性免疫高度地參與了動(dòng)脈粥樣化的形成，因?yàn)橐呀?jīng)表明它與代謝危險(xiǎn)因子相互作用以啟動(dòng)、傳播和活化動(dòng)脈樹中的病變。在另一實(shí)施方式中，T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。鑒于Anx-Al促進(jìn)Thl細(xì)胞分化的能力，本發(fā)明也可以用于例如限制失控的保護(hù)性細(xì)胞(Thl)對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體的應(yīng)答和通過抑制Thl分化和促進(jìn)Th2分化來治療細(xì)胞外感染(Th2應(yīng)答)。
本發(fā)明的第二方面和后續(xù)方面的優(yōu)選特征是對(duì)第一方面中的特征所做的適應(yīng)性改變。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種針對(duì)具有圖2所示的氨基酸序列的全長(zhǎng)人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子。所述特異性結(jié)合分子的一個(gè)實(shí)例為單克隆抗體VJ-4B6，該抗體是由2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為N0.10060301的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有單克隆抗體VJ-4B6的CDRs的特異性結(jié)合分子，所述單克隆抗體VJ-4B6的CDRs具有下述氨基酸序列:VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKG`
VHCDR3 為 WGLGYYFDY在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有單克隆抗體VJ-4B6的Vh和/或\區(qū)域的特異性結(jié)合分子，圖11和圖13分別顯示了所述區(qū)域。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供雜交瘤細(xì)胞系VJ-4B6-E5-B10-D4，該細(xì)胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為N0.10060301。單克隆抗體VJ-4B6是由圖3A所述的方法產(chǎn)生的。簡(jiǎn)單地說，將cDNA編碼的具有圖2A所示序列的全長(zhǎng)人類Anx-Al克隆到表達(dá)載體中，并確認(rèn)其細(xì)胞表面的表達(dá)。將吸附到金微粒的載體DNA通過幾次皮內(nèi)應(yīng)用后給藥小鼠。鼠細(xì)胞接受了免疫載體并表達(dá)了 cDNA編碼的蛋白，從而刺激了免疫應(yīng)答。然后，將鼠淋巴細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。然后，進(jìn)行特異性測(cè)試，克隆雜交瘤和并產(chǎn)生單克隆抗體。因此，用于產(chǎn)生單克隆抗體VJ-4B6的方法使用了被Anx-Al的cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠在細(xì)胞表面表達(dá)整個(gè)分子，因此，該蛋白以與體內(nèi)存在形式相同的形式即以它的四級(jí)天然結(jié)構(gòu)存在。這種產(chǎn)生抗體的方法與產(chǎn)生其它市售Anx-Al抗體的方法不同，所述其他市售抗體是通過用Anx-Al肽或變性全長(zhǎng)蛋白免疫小鼠而產(chǎn)生的。本發(fā)明的抗體特別可用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥?，F(xiàn)在將參照下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，下述實(shí)施例僅是為了說明的目的。在實(shí)施例中，參考了多個(gè)附圖，其中:圖1A是膜聯(lián)蛋白-1結(jié)構(gòu)的帶狀圖，該圖顯示了四個(gè)膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列和N-末端結(jié)構(gòu)域。圖1B是膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列(repeat)和生物活性序列膜聯(lián)蛋白_1肽Ac.2-26位置的示意圖。圖1C顯示了肽Ac.2-26的氨基酸序列，該序列是Anx-Al乙酰化的N-末端肽片段。圖2A顯示了人類膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-003的(i )氨基酸序列和(ii )核苷酸序列。圖2B顯示了人類膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-002的氨基酸序列。圖2C顯示了人類膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-004的氨基酸序列。圖2D顯示了人類膜聯(lián)蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-006的氨基酸序列。圖3顯示了 VJ-4B6的生成。(A)用于分離和產(chǎn)生VJ-4B6的方法的示意圖；(B)柱狀圖顯示了用VJ-4B6對(duì)被膜聯(lián)蛋白-1的cDNA (綠線；右手峰)或無關(guān)的對(duì)照cDNA (紅線；左手峰)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行染色的結(jié)果。圖4顯示了 VJ-4B6的確認(rèn)。(A)用VJ-4B6 (50ng/ml)對(duì)透化的人類外周血單核細(xì)胞(PBMC)或多形單核細(xì)胞(￡olymorph Mononuclear Cells) (PMN)進(jìn)行染色。(B)用VJ-4B6 (50ng/ml)對(duì)透化的小鼠淋巴細(xì)胞或駐留的腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色。在所有的試驗(yàn)中，細(xì)胞都用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，然后在FACS緩沖液中用0.02%的皂苷使細(xì)胞透化。在4°C下，將細(xì)胞與生物素化的VJ-4B6培養(yǎng)過夜，然后，用鏈霉親和素-FITC綴合的抗體(稀釋度1:200)染色I(xiàn)小時(shí)。在所有的圖中，左手峰代表對(duì)照，而右手峰代表VJ-4B6。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖5顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3_誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3(ly g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。18-20小時(shí)后，用3H-胸苷(IyCi)脈沖細(xì)胞12小時(shí)，然后用細(xì)胞收集器處理，以測(cè)量3H-胸苷整合的水平。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖6顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3/⑶28誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3 (I μ g/ml)和抗-CD28(1 μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和AnxAl-/-(B)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。18-20小時(shí)后，用3H-胸苷(IyCi)脈沖細(xì)胞12小時(shí)，然后用細(xì)胞收集器處理，以測(cè)量3H-胸苷整合的水平。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖7顯示了 VJ-4B6抑制抗-CD3-誘導(dǎo)的IL-2生成。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3 (I μ g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。20-24 小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，并用ELISA分析上清液以得到IL-2的水平。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖8顯示的是VJ-4B6抑制抗-CD3/CD28-誘導(dǎo)的IL-2生成。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3 (I μ g/ml)和抗-CD28(1 μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和AnxAl-/-(B)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。20-24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，并用ELISA分析上清液以得到IL-2的水平。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖9顯示了 VJ-4B6抑制抗-CD3-誘導(dǎo)的CD25/CD69上調(diào)。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3 (I μ g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。18-20小時(shí)后，收集細(xì)胞，并用抗-⑶25FITC和抗-⑶69PE給細(xì)胞染色。用FACScalibur流式細(xì)胞儀獲得樣品并用FlowJo軟件分析樣品。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖10顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3/⑶28-誘導(dǎo)的⑶25/⑶69上調(diào)。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養(yǎng)板上的抗-⑶3 (I μ g/ml)和抗-⑶28 (I μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中的T細(xì)胞。18-20小時(shí)后，收集細(xì)胞，并用抗-⑶25FITC和抗-⑶69PE給細(xì)胞染色。用FACScalibur流式細(xì)胞儀獲得樣品并用FlowJo軟件分析樣品。顯示的數(shù)據(jù)來自單一實(shí)驗(yàn)，并代表其它兩組有相似結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。圖11顯示了 VJ-4B6的輕鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖12顯示了 VJ-4B6的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，并標(biāo)注出了⑶Rs。突出了⑶R1，⑶R2，⑶R3和恒定區(qū)的起點(diǎn)。根據(jù)Kabat標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行編號(hào)和⑶Rs的確定。圖13顯示了 VJ-4B6的重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。圖14顯示了 VJ-4B6的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，并標(biāo)注出了⑶Rs。突出了⑶R1，⑶R2，⑶R3和恒定區(qū)的起點(diǎn)。根據(jù)Kabat標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行編號(hào)和⑶Rs的確定。在重鏈可變區(qū)中，殘基26-29雖然不是Kabat定義的高變區(qū)的一部分，卻是Chothia(Chothia andLesk, 1987)定義的 CDR 環(huán)的一部分。插入位置 52、52a、82、82a、82b、82c、100 和 IOOa 用52a, 82abc, IOOa 表不。圖15顯示了 VJ-4B6抑制EAE的發(fā)育。用CFA中的M0G35_55使C57BL/6小鼠免疫，并在以后的22天中每天進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以獲得EAE信號(hào)。從免疫后的第6天開始，每六天給小鼠腹腔內(nèi)注射 IOOng 的 IgG(A)或 5 (B)、50 (C) IOOng(D)的 VJ-4B6 (溶于 100 μ I 的 PBS 中)。結(jié)果表示為平均值 ±SEM(n=6/ 組)。*ρ〈0.05，_ρ〈0.001。圖16顯示了 VJ-4B6降低與EAE的發(fā)育相關(guān)的體重減少。用CFA中的M0G35_55使C57BL/6小鼠免疫，并在以后的22天中每天進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以獲得體重的增加/減少。從免疫后的第6天開始，每六天給小鼠腹腔注射IOOng的IgG㈧或5 (B)、50 (C) IOOng(D)的VJ-4B6 (溶于 100 μ I 的 PBS 中)。結(jié)果表示為平均值 ± SEM (η=6/ 組)。*ρ〈0.05，_ρ〈0.001。圖17顯示的是VJ-4B6降低了 CIA的發(fā)育。用CFA中的?？苿?dòng)物類型II膠原使DBA/1小鼠免疫。在初次免疫后的第21天，小鼠通過完全CFA中的200 μ g類型II膠原增強(qiáng)免疫(s.c.)，并在以后的2 0天中每天進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以獲得疾病指征。從小鼠增強(qiáng)免疫的那天開始，每六天給小鼠腹腔注射IOOng的VJ-4B6 (溶于100 μ I的PBS中)。結(jié)果表示為平均值土 SEM (η=6/ 組)。_ρ〈0.001。實(shí)施例1-VJ-4B6特異性抑制含有膜聯(lián)蛋白_1的T細(xì)胞中的T細(xì)胞活化材料和方法小鼠(圖4Β、5、6、7、8、9和10中使用的小鼠)Balb/C 小鼠來自 B&K Universal (Grimston, England) AnxAl+小鼠來自發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室，該小鼠在無菌條件下出生于B&K Universal。這些研究中使用的所有小鼠的年齡都在6-8周齡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是根據(jù)英國內(nèi)政部規(guī)定(Guidance on the Operation ofAnimals, Scientific Procedures Actl986)和歐洲聯(lián)盟條款的規(guī)定進(jìn)行的。小鼠T細(xì)胞的提取(圖4B、5、6、7、8、9和10中使用的細(xì)胞)脾臟和淋巴結(jié)(腋窩淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸淋巴結(jié))取自6至8周齡的小鼠，并如前人所述地用注射器柱塞和50 μ m細(xì)胞濾網(wǎng)(BD)使組織溫和降解而制備。用Ficoll將細(xì)胞懸液分層，以獲得單核細(xì)胞，然后收集細(xì)胞并用RPMI培養(yǎng)基(Gibco)洗滌。T細(xì)胞增殖試驗(yàn)(圖5和圖6中的數(shù)據(jù))將純化的淋巴結(jié)T細(xì)胞(IO5細(xì)胞/ml)在96孔板中用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3(克隆 145-2Cll;eBioscience)或抗-CD3 和抗-CD28 (克隆 37.51; eBioscience)刺激。18-20小時(shí)后，將培養(yǎng)物用I μ Ci的[3H]-胸昔(Amersham Pharmacia Biotech)脈沖12小時(shí)，并用自動(dòng)閃爍計(jì)算器測(cè)量整合后的放射性。
IL-2的產(chǎn)生(圖7和圖8中的數(shù)據(jù))將純化的淋巴結(jié)T細(xì)胞(IO5細(xì)胞/ml)在96孔板中用包被在培養(yǎng)板上的抗-CD3(克隆 145-2C11; eBioscience)或抗-CD3 和抗-CD28 (克隆 37.51; eBioscience)刺激。20-24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，并按照制造商的說明書使用鼠IL-2ELISA試劑盒(eBioscience)分析上清液，以得到IL_2的含量。流式細(xì)胞術(shù)分析(圖9和圖10)將細(xì)胞在FACS緩沖液(含有1%FCS和0.02%NaN2的PBS)中重懸。將淋巴細(xì)胞以IxlO6Ail的密度在ΙΟΟμ I的FACS緩沖液中染色，并用CellQuest 軟件(BectonDickinson)在FACScalibur流式細(xì)胞儀中捕獲。使用的抗體為抗-CD25FITC(克隆PC61, eBioscience)和PE-綴合的抗-CD69 (克隆H1.2F3)。在4 °C下將細(xì)胞在含有抗-CD16/32的FACS緩沖液中預(yù)培養(yǎng)30分鐘以排除非特異性結(jié)合，然后用合適濃度的綴合抗體在4°C標(biāo)記30分鐘。標(biāo)記后，洗滌并分析細(xì)胞。設(shè)定正向散射和側(cè)向散射以排除紅細(xì)胞和死細(xì)胞，每個(gè)樣品至少分析2X IO4個(gè)淋巴細(xì)胞。在所有實(shí)驗(yàn)中，被染色的細(xì)胞都用FACScalibur流式細(xì)胞儀捕獲并用FlowJo軟件進(jìn)行分析。用流式細(xì)胞術(shù)分析確認(rèn)VJ-4B6 (圖4)將人類PBMC和PMN或小鼠的脾細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞先在含有4%多聚甲醛的FACS緩沖液中重懸10分鐘，隨后在含有4%多聚甲醛和0.02%皂苷的FACS緩沖液中重懸15分鐘。將細(xì)胞與50ng/ml的生物素化VJ-4B6在4°C培養(yǎng)12小時(shí)。然后用鏈霉親和素-FITC (稀釋度1:200eBioscience)將細(xì)胞在室溫下培養(yǎng)I小時(shí)。標(biāo)記后，洗滌并分析細(xì)胞。設(shè)定正向散射和側(cè)向散射以排除紅細(xì)胞和死細(xì)胞，每個(gè)樣品至少分析2X IO4個(gè)淋巴細(xì)胞。在所有實(shí)驗(yàn)中，被染色的細(xì)胞都用FACScalibur流式細(xì)胞儀捕獲并用Flowjo軟件進(jìn)行分析。人類外周血白細(xì)胞(圖4A中使用的細(xì)胞)獻(xiàn)血者為20-35歲的健康男性和女性，他們的血液測(cè)試結(jié)果是HIV、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒均呈陰性。進(jìn)一步篩選標(biāo)準(zhǔn)是在過去的四周里沒有經(jīng)歷明顯的感染，發(fā)燒、過敏癥狀、異常的血液細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝臟酶的增加或任何藥物治療。從健康的志愿者中收集新鮮的靜脈血，并將其立刻轉(zhuǎn)移到含有3.2%檸檬酸鈉的試管中(1:10稀釋)。然后，使用密度梯度法將細(xì)胞分離:將3ml的Ficoll Histopaque-10771置于3ml的FicollHistopaque-11911上層(都來源于Sigma)，以實(shí)現(xiàn)分層，并將6ml血液(用RPMI培養(yǎng)基1:1稀釋)置于Histopaques上層。在室溫下以1500RPM離心30分鐘后，使用無菌滴管將PBMCs和PMNs從合適的層中吸出，并用RPMI洗滌三次。統(tǒng)計(jì)分析所有的統(tǒng)計(jì)分析都是用Prism軟件進(jìn)行的(GraphPad software)。所有的數(shù)值都用平均值土 SE表示。統(tǒng)計(jì)分析是通過Student’ s t檢驗(yàn)或適當(dāng)?shù)膯蜗駻NOVA評(píng)估的。P〈0.05的概率被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果新的抗AnxAl抗體是由圖3A中所示的遺傳免疫方法產(chǎn)生的(GenovacGmbH, Germany)。測(cè)試了來自幾只被免疫小鼠的血清，并用AnxAlcDNA對(duì)三個(gè)IgG識(shí)別細(xì)胞的結(jié)果呈陽性的小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將這 些小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。三個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆中僅有一個(gè)可以成功地被亞克隆和擴(kuò)增。這些雜交瘤細(xì)胞被稱作VJ-4B6-E5-B10-D4。從雜交瘤細(xì)胞純化的IgG2b碎片識(shí)別轉(zhuǎn)染有AnxAlcDNA的細(xì)胞(圖3B，綠線；右手峰)，但不識(shí)別轉(zhuǎn)染有無關(guān)cDNA的細(xì)胞(圖3B，紅線；左手峰)。為了確認(rèn)VJ-4B6的特異性，通過FACS分析已知表達(dá)不同蛋白水平的透化人類和小鼠細(xì)胞中的AnxAl表達(dá)。如圖4A所示，與人類PBMC相比，人類PMN的VJ-4B6染色結(jié)果是高度陽性的(圖4A，右手峰，分別為右欄和左欄)。這與先前觀察到(D’Acquisto et al,結(jié)果未公布)的PMN與PBMC相比顯著地表達(dá)更高的AnxAl水平是一致的。同樣地，與脾細(xì)胞相比，用VJ-4B6染色的小鼠巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的AnxAl表達(dá)水平(圖4B，右手峰，分別為右欄和左欄)?？傮w來說，這些結(jié)果顯示了 VJ-4B6可識(shí)別人類AnxAl和小鼠AnxAl。然后，測(cè)試了 VJ-4B6對(duì)T細(xì)胞活化的作用和特異性。為了這個(gè)目的，先用ΑηχΑ1+/+或AnxAl+小鼠的T細(xì)胞測(cè)量了 VJ-4B6對(duì)抗-CD3誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的作用(以3H-胸苷整合的平均值為指標(biāo))。圖5顯示了 ΑηχΑΓ/+和AnxAl+的T細(xì)胞用抗-⑶3刺激后，3H-胸苷整合的增加(分別為圖5Α和圖5Β)。在刺激后的培養(yǎng)物中加入VJ-4B6引起了 ΑηχΑ1+/+的T細(xì)胞中3H-胸苷整合的濃度依賴性抑制，但對(duì)AnxAl+的T細(xì)胞中3H-胸苷整合沒有影響。用抗-⑶3和抗-⑶28刺激的T細(xì)胞也出現(xiàn)類似的結(jié)果(分別為圖6Α和·6Β)。為了進(jìn)一步確認(rèn)這些結(jié)果，測(cè)試了 VJ-4B6對(duì)T細(xì)胞活化的其它傳統(tǒng)標(biāo)記即白細(xì)胞介素-2 (IL-2)的產(chǎn)生和⑶25/⑶69上調(diào)的作用。用抗-⑶3單獨(dú)刺激或用抗-⑶3和抗-⑶28刺激T細(xì)胞可產(chǎn)生大量的IL-2 (分別為圖7和圖8)。VJ-4B6的添加以濃度依賴性方式顯著地抑制了 ΑηχΑ1+/+Τ細(xì)胞中IL-2的產(chǎn)生，但對(duì)AnxAl+的T細(xì)胞中IL-2的產(chǎn)生沒有影響。對(duì)于⑶25/⑶69上調(diào)也得到了相似的結(jié)果。用抗-⑶3單獨(dú)刺激或用抗-⑶3和抗-⑶28刺激T細(xì)胞活化誘導(dǎo)⑶25/⑶69雙陽性T細(xì)胞的百分比顯著提高(分別為圖9和圖10中從左起第二欄)。在VJ-4B6存在下的刺激可以濃度依賴性方式顯著抑制ΑηχΑ1+/+Τ細(xì)胞中⑶25/⑶69的誘導(dǎo)，而不影響AnxAl+的T細(xì)胞中⑶25/⑶69的誘導(dǎo)。這些結(jié)果共同表明VJ-4B6顯著抑制T細(xì)胞增殖、IL_2的產(chǎn)生和由抗-⑶3或由抗-⑶3和抗-⑶28引起的信號(hào)誘導(dǎo)的⑶25/⑶69的上調(diào)。另外，由于在AnxAl+T細(xì)胞中它的作用消失，因此這種作用應(yīng)特別地歸因于VJ-4B6與AnxAl的中和。這與發(fā)明人先前觀察到的活化的T細(xì)胞釋放合適的T細(xì)胞活化所需的內(nèi)源性AnxAl+的結(jié)果相一致(D，Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007;D，Acquisto et al., Eur.J.1mmunol.37:3131—3142，2007)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明VJ-4B6以濃度依賴性方式抑制了抗-⑶3誘導(dǎo)的⑶25和⑶69(T細(xì)胞活化的標(biāo)記)的上調(diào)。在IL-2的產(chǎn)生和T細(xì)胞增殖上也觀察到了相似的抑制作用。更重要的是，在膜聯(lián)蛋白-1-缺乏的T細(xì)胞中沒有觀察到這種作用，這說明這種抑制是特異性的且抗體并沒有引起任何不利的毒性作用。實(shí)施例2-VJ-4B6的測(cè)序本實(shí)施例的目的是從雜交瘤細(xì)胞中克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)域的基因和確定互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)的DNA序列和定位以及其他特征?？贵w可變區(qū)的克隆和測(cè)序利用Qiagen RNeasy迷你試劑盒(Cat No:74104)從I小瓶雜交瘤細(xì)胞中制備總RNA。用50 μ L水洗脫RNA并在1.2%瓊脂糖凝膠上檢查。Vh和VK(可變的kappa輕鏈)的cDNAs是用逆轉(zhuǎn)錄酶和IgG和kappa恒定區(qū)域的引物制備的。使用一大組信號(hào)序列引物，可通過PCR擴(kuò)增出第一條鏈cDNAs。將擴(kuò)增的DNAs用硅膠純化，并克隆到載體pGem T Easy (Promega)中。篩選得到的Vh和Vk的克隆以確定其中含有合適大小的插入物。通過自動(dòng)DNA測(cè)序在兩個(gè)方向上測(cè)定選定克隆的DNA序列。參照其它抗體序列確定序列中互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)的定位(Kabat EA et al.，1991)。結(jié)果VJ-4B6 輕鏈 識(shí)別了單ー Vk序列。圖11顯示了 VJ-4B6Vk的DNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。圖12顯示了推導(dǎo)出的蛋白序列，并標(biāo)注了 CDRs。兩個(gè)單獨(dú)擴(kuò)增步驟中的九個(gè)克隆(七個(gè)是獨(dú)立的)得到了相同的V區(qū)域序列。由雜交瘤融合伴侶產(chǎn)生的非生產(chǎn)性的異常Vk序列也在多個(gè)克隆中出現(xiàn)，并且還有ー個(gè)序列中有缺失的克隆。VJ-4B6 重鏈識(shí)別了單ー Vh序列。圖13顯示了 VJ_4B6Vh的DNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。在九個(gè)單獨(dú)的克隆中發(fā)現(xiàn)了相同的V區(qū)域序列。有兩個(gè)克隆產(chǎn)生的序列中都有一個(gè)單堿基對(duì)的改變，有ー個(gè)克隆產(chǎn)生的序列中有ー個(gè)單堿基對(duì)的缺失和ー個(gè)單堿基對(duì)的改變，還有一個(gè)克隆產(chǎn)生的序列中有兩個(gè)單堿基對(duì)的改變。這五個(gè)單堿基對(duì)的變化中的每ー個(gè)僅發(fā)生在一個(gè)克隆中。剩下的五個(gè)克隆有相同的序列。圖14顯示了推導(dǎo)出的蛋白序列，并標(biāo)注了CDRs。參考文獻(xiàn)Chothia C and Lesk AM.Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J Mol Biol.196:901-17,1987.
Kabat EAj Wu TTj Perry HMj Gottesman KSj Foeller C.Sequences of proteins ofImmunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991實(shí)施例3-VJ-4B6的體內(nèi)免疫抑制作用為了測(cè)試VJ-4B6的體內(nèi)免疫抑制作用，我們選擇了兩種傳統(tǒng)的免疫疾病模型:M0G33_55誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髄炎(EAE ;多發(fā)性硬化的小鼠模型)和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA ;風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型)。方法實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髄炎。0天時(shí)用溶于PBS的300 y g的M0G35_55以及等體積的含有300 u g熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)H37Ra的CFA組成的300 U I的乳劑對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫。小鼠身體兩側(cè)均注射乳剤，然后在0天和2天時(shí)腹腔內(nèi)注射溶于100 V-1生理鹽水中的百日咳桿菌毒素(B.pertussis toxin) (500ng/100 u I)。姆天觀察小鼠，以得到EAE指征和體重的減少量。將疾病嚴(yán)重性分為6個(gè)等級(jí):0=沒有疾??；1=尾部部分遲緩；2=尾部全部遲緩；3=正位反射受損；4=局部后肢_瘓；5=全部后肢_瘓；6=動(dòng)物瀕臨死亡或死亡。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。將乳化在弗氏完全佐劑(complete Freund’ s adjuvant)(CFA;Hooke labs)中的200 u g膠原類型II皮下注射到6_8只雄性DBA/1小鼠(8_12周大)的尾部。在初次免疫后的第21天，給小鼠皮下注射200 Ug用IFAOtooke labs)乳化的膠原類型II以增強(qiáng)免疫(s.c.)。使用兩種臨床參數(shù)監(jiān)測(cè)小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)病的指征，所述參數(shù)為爪腫脹和臨床評(píng)分。爪腫脹是通過用器官血量測(cè)量?jī)x(plethysmometer)測(cè)量受影響的后爪的厚度來評(píng)估的。臨床評(píng)分是通過制造商推薦的標(biāo)準(zhǔn)(http://hookelabs.com/protocols/ciaInductionDBAl/ciaInduction_DBAl.html)評(píng)估的。將四肢進(jìn)行分級(jí)，以得出12只動(dòng)物中每只動(dòng)物的最高可能得分。結(jié)果如前人所述(Paschalidiset al., J Neuroinflammation.2009; 6:33)地用M0G33_55/CFA對(duì)雄性C57/BL6小鼠進(jìn)行免疫。從用M0G33_55/CFA免疫后的第六天開始，每六天給小鼠腹膜內(nèi)(1.p.)注射 VJ-4B6(5、50 和 100ng/100 u I), IgG 對(duì)照(IOOng /yl)或PBS載體(對(duì)照)。如圖15所示，與對(duì)照小鼠相比，用5、50和IOOng的VJ-4B6處理的小鼠顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的劑量依賴性減少的疾病指征(分別為圖15B、C和D)，然而，注射對(duì)照IgG卻沒有作用(圖15A)。每種治療的曲線下面積(AUC)和相對(duì)于對(duì)照(27.29AUC)的抑制百分比如下 JgGlOOng, 24.17AUC, 11.4% ；VJ-4B65ng, 15.04AUC，44.8% ；VJ-4B650ng,
5.87AUC,78.5% ；VJ-4B6100ng,7.04AUC,74.2%。對(duì)EAE動(dòng)物模型的研究已經(jīng)表明疾病的急性期與體重的減輕同步發(fā)生，這可能是由于食欲不振和流體攝入不足。處理過的小鼠的重量測(cè)量與臨床評(píng)分的嚴(yán)重度相關(guān)，并顯示了與對(duì)照小鼠相比從第18天開始的VJ-4B6處理過的小鼠中劑量依賴性減少的體重減輕，但是IgG處理過的小鼠則沒有這種現(xiàn)象(圖16)。為了確認(rèn)治療潛在的V J-4B6作為體內(nèi)免疫抑制劑，我們?cè)贑l A模型中測(cè)試了它的作用。如前人所述地用CFA中的?？苿?dòng)物類型II膠 原對(duì)雄性DBA/1小鼠進(jìn)行免疫(D’Acquisto et al.，Blood.2007; 109 (3): 1095-102)。從注射膠原增強(qiáng)免疫那天開始，每六天給小鼠腹腔內(nèi)注射VJ-4B6 (100ng/100 yl)或PBS載體(對(duì)照)。與針對(duì)EAE所得到的數(shù)據(jù)一致的是，與對(duì)照小鼠(AUC83.50)相比，注射VJ-4B6顯著地減少了(AUC26.75; 67.9%)疾病指征的發(fā)展(圖17)。
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權(quán)利要求
1.種特異性結(jié)合分子，該特異性結(jié)合分子針對(duì)具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生。
2.種特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子具有如權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合分子的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，或與每個(gè)各自的⑶Rs至少有70%同一性的氨基酸序列。
3.據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子具有互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)各自具有如下所述的氨基酸序列，其中VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPG⑶YTNYNEKFKG VHCDR3 為 WGLGYYFDY 或與它們具有至少70%同一性的氨基酸序列。
4.據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述特異性結(jié)合分子是抗體或該抗體的片段。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述抗體是單克隆抗體。
6.據(jù)權(quán)利要求5所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述單克隆抗體是人源化的。
7.據(jù)權(quán)利要求4所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述片段為Fab、F(ab’)2或Fv片段或scFv分子。
8.據(jù)權(quán)利要求1-5和7中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子包括具有圖11和/或圖13所示的氨基酸序列的多肽。
9.據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子是由2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為N0.10060301的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。
10.種雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生針對(duì)具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產(chǎn)生的特異性結(jié)合分子。
11.據(jù)權(quán)利要求10所述的雜交瘤細(xì)胞系，所述雜交瘤細(xì)胞系是于2010年6月3日保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，登記號(hào)為N0.10060301的雜交瘤細(xì)胞系。
12.種藥物組合物，所述藥物組合物包括如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子。
13.據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括另一種治療活性劑。
14.據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子用于藥物。
15.據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子，所述特異性結(jié)合分子用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。
16.據(jù)權(quán)利要求15所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病選自由移植物抗宿主疾病、移植排斥、動(dòng)脈粥樣硬化、HIV、AIDS、牛皮癬、流產(chǎn)和自身免疫疾病所組成的組。
17.據(jù)權(quán)利要求16所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述自身免疫疾病選自由風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、艾迪生氏病、格雷夫斯病、硬皮癥、多肌炎、糖尿病、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、尋常型天皰瘡、炎性腸病、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、貝賽特氏癥和舍格倫式綜合癥所組成的組。
18.據(jù)權(quán)利要求17所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述自身免疫疾病選自由風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)和全身性紅斑狼瘡(SLE)所組成的組。
19.據(jù)權(quán)利要求18所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述自身免疫疾病為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或多發(fā)性硬化癥(MS)。
20.據(jù)權(quán)利要求16所述的特異性結(jié)合分子，其中，所述T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病選自由動(dòng)脈粥樣硬化、HIV、AIDS和牛皮癬所組成的組。
21.利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子在制備用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。
22.種在有需要的受試者中治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者給藥權(quán)利要求1 -9中任意一項(xiàng)所述的特異性結(jié)合分子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合分子，該特異性結(jié)合分子針對(duì)具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-A1蛋白而產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及這種特異性結(jié)合分子在治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/18GK103097414SQ201180038556
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者F·達(dá)奎斯托, M·佩雷蒂 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)瑪麗皇后和威斯特-弗爾德學(xué)院