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與馬鈴薯y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法

文檔序號:3571531閱讀:319來源:國知局
專利名稱:與馬鈴薯y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)
在過去的十年中,植物病毒和寄住之間的分子間相互作用取得了很大的進(jìn)展。但是病毒侵染是如何在生化和生理水平上影響植物的細(xì)胞,組織乃至整株在植物病毒學(xué)的研究中還是個(gè)缺口。病毒是如何利用它自身的少數(shù)幾個(gè)蛋白來侵染植物并引起癥狀的還有很多方面有待研究。病毒在植物體內(nèi)引起的癥狀是植物在細(xì)胞水平上生理和結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化結(jié)合植物本身的生長發(fā)育的減緩而產(chǎn)生的。通過重組DNA技術(shù)的應(yīng)用從而研究病毒的基因產(chǎn)物在癥狀產(chǎn)生過程中的作用使得我們逐步了解病毒侵染植物的這個(gè)過程。目前的研究手段主要有以下幾個(gè)1病毒突變的方式來確定與癥狀表達(dá)相關(guān)的基因產(chǎn)物和遺傳位點(diǎn),應(yīng)用這個(gè)方法研究病毒的例子很多,但是通過病毒突變的方式研究的結(jié)果更傾向于對病毒的研究,而不是對癥狀產(chǎn)生的生化機(jī)制的研究;II通過轉(zhuǎn)基因的方式在寄主植物中異源表達(dá)病毒基因,通過轉(zhuǎn)基因的方式可以把單個(gè)病毒基因產(chǎn)物的影響和病毒復(fù)制的影響區(qū)分開。 組成型表達(dá)花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus, CaMV)的VI基因會誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生嚴(yán)重的褪綠癥狀,與花椰菜花葉病毒侵染后的癥狀非常相似,通過差異分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)VI基因的擬南芥和花椰菜花葉病毒侵染的擬南芥的幾個(gè)基因在表達(dá)方式的變化上是一致的,有報(bào)道病毒的移動蛋白對寄主植物有重要影響,這些方法為闡明病毒基因產(chǎn)物在癥狀產(chǎn)生和病毒防衛(wèi)反應(yīng)中的作用提供了新的信息,但是還是有相當(dāng)多的一些控制病毒病的因子沒有被發(fā)現(xiàn),通過高通量的方法研究轉(zhuǎn)錄水平的變化可以更全面的研究病毒侵染后寄主的變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供與馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白,名稱為ZmTrm2,來源于玉米(Zea mays L.),是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子;
2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因;3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC,0. 5% SDS的溶液,在65°C下雜交,然后用2XSSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列2由516個(gè)堿基組成,其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1 位-第513位堿基,編碼氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。所述重組載體是在載體PVX或載體BMVpF3-5/13’A/G的多克隆位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的重組載體。擴(kuò)增所述編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍,所述引物對中,一條引物序列如序列表中序列3所示,另一條引物序列如序列表中序列4所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用。序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍;所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子;2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因;3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在載體PVX的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體;所述抑制植物病毒復(fù)制為抑制植物病毒在植物體中的復(fù)制;所述植物病毒為馬鈴薯Y病毒屬病毒;所述病毒病害是由馬鈴薯Y病毒屬病毒引起的病害;所述馬鈴薯Y病毒屬病毒為煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein bandingmosaic virus, TVBMV)或甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV);所述植物為雙子葉植物或單子葉植物;所述單子葉植物為玉米;所述雙子葉植物為煙草。本發(fā)明通過半定量RT-PCR技術(shù)考察了 ZmTrm2在玉米的根、莖、葉、雄蕊、雌蕊、 種子中的分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它能夠在各個(gè)組織和器官中分布,通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) ZmTrm2存在于葉肉細(xì)胞的葉綠體中。半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在玉米葉片上瞬時(shí)沉默 ZmTrm2促進(jìn)了甘蔗花葉病毒的系統(tǒng)侵染,在普通煙上表達(dá)ZmTrm2可以抑制煙草脈帶花葉病毒的復(fù)制。


圖1為半定量RT-PCR檢測ZmTrm2的組織分布。圖2為激光共聚焦顯微鏡觀察ZmTrm2的細(xì)胞內(nèi)亞定位。
圖3為半定量RT-PCR檢測甘蔗花葉病毒的積累水平。圖4為半定量RT-PCR檢測煙草脈帶花葉病毒的積累水平。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、ZmTrm2的獲得一、玉米抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建1、玉米總RNA的提取1)取0. Ig新鮮的玉米葉片,加液氮研磨成粉末狀,移入一滅菌的1.5ml離心管中, 然后加入Iml的Tri-Reagent,劇烈振蕩搖勻或?qū)ml的Tri-Reagent加入到_80°C凍存的 1 X 106原生質(zhì)體中,劇烈振蕩:3min ;冰上放置5min。2)勻漿用IEC臺式冷凍離心機(jī)于4°C、12,OOOg條件下離心IOmin以除去不溶的成分,將上清轉(zhuǎn)入一新的1. 5ml離心管中。3)在室溫下靜置5min,加0. 2ml氯仿,劇烈震蕩15sec,然后在室溫下靜置 2-5min,再于 4°C、12,000 X g 的條件下離心 15min。4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中,加0. 5ml異丙醇,混合(上下顛倒), 使樣品在室溫下靜置15min,4°C、12,000 X g離心lOmin,則RNA會在管的側(cè)壁和底部形成沉淀。5)棄上清,加入75 %的乙醇洗滌沉淀,然后4°C、7,500 X g離心5min (如RNA沉淀懸浮起來,則用12,OOOXg),棄乙醇。6) RNA在室溫下干燥IOmin或在冷凍離心濃縮機(jī)上濃縮5min,加入30 μ 1 DEPC處理的超純水溶解沉淀,-70°C保存?zhèn)溆谩?、從植物總RNA中分離mRNA1)首先對總RNA定量,把定量的總RNA加入1. 5ml的離心管中。注意不要超過試劑盒所要求的量。2)力口 250 μ 1 OBB buffer 禾口 15 μ 1 Oligotex suspension,并且充分混合。3)把混合后的樣品放到70°C的水浴鍋中溫浴3分鐘(破壞RNA的二級結(jié)構(gòu))。4)取出樣品在室溫下放置10分鐘(讓poly (A)和poly⑴充分的雜交)。5) 16,000X g,離心 2 分鐘,沉淀 Oligotex 和 mRNA。棄上清。6)用400 μ 1的0W2緩沖液渦旋重懸Oligotex和mRNA的沉淀,然后轉(zhuǎn)移至分離柱中最大轉(zhuǎn)速離心1分鐘。7)再把離心柱轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml離心管中,加400 μ 1的0W2緩沖液,用最大的轉(zhuǎn)速離心1分鐘。8)再轉(zhuǎn)移離心柱至新的1. 5ml的離心管中,加60 μ 1預(yù)熱(70°C )的OEB緩沖液。 來回抽動3-4次,重懸沉淀。最大離心力離心lmin。9)為了得到更大的產(chǎn)量,再重復(fù)步驟8 一次。2、第一鏈 cDNA 合成1)取3個(gè)滅菌的PCR管,分別標(biāo)記上driver、tester和control,將對應(yīng)的mRNA按照下表的比例混勻。
權(quán)利要求
1.一種蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因,其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3) 中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子;2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因;3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體,其特征在于所述重組載體是在載體PVX或載體 BMVpF3-5/13’ A/G的多克隆位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長或其任一片段的引物對,所述引物對中,一條引物序列如序列表中序列3所示,另一條引物序列如序列表中序列4所示。
7.序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用。
8.序列表中序列1所示的蛋白的編碼基因在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用;所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)序列表中序列2所示的DNA分子;2)在嚴(yán)格條件下與1)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的基因;3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
9.含有序列表中序列1所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在抑制植物病毒復(fù)制或防治植物病毒病害中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的應(yīng)用,其特征在于所述重組表達(dá)載體為在載體PVX的多克隆位點(diǎn)插入序列表中序列1所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體;所述抑制植物病毒復(fù)制為抑制植物病毒在植物體中的復(fù)制;所述植物病毒為馬鈴薯Y病毒屬病毒;所述病毒病害是由馬鈴薯Y病毒屬病毒引起的病害;所述馬鈴薯Y病毒屬病毒為煙草脈帶花葉病毒或甘蔗花葉病毒。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物;所述單子葉植物為玉米;所述雙子葉植物為煙
全文摘要
本發(fā)明公開了與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的玉米蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì);(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì);(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與馬鈴薯Y病毒屬病毒侵染有關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在玉米葉片上瞬時(shí)沉默ZmTrm2促進(jìn)了甘蔗花葉病毒的系統(tǒng)侵染,在普通煙上表達(dá)ZmTrm2可以抑制煙草脈帶花葉病毒的復(fù)制。
文檔編號C07K14/415GK102180955SQ201110066700
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者周濤, 施艷, 曹言勇, 范在豐 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
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