專利名稱：琥珀酰酪蛋白鐵(iii)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種琥拍酰酪蛋白鐵(III) (iron(III) caseinsuccinylate),其特征在于鐵含量在4. 5重量％和7重量％之間并且在水中的溶解率為大約92%以上。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法。
背景技術(shù)：
鐵衍生物在藥品中廣泛使用，用于預(yù)防和治療貧血和妊娠期鐵缺乏、吸收不良綜合征、哺乳期鐵缺乏和生長期鐵缺乏。其中，蛋白琥拍酸鐵(Iron Protein Succinilate) (通常指的是首字母縮寫詞IPS)因其生物利用度和耐受性特性而尤為杰出。
意大利專利IT1150213中描述了 起始于牛奶蛋白而獲得的IPS的化學(xué)、物理學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)以及制劑(被稱為Ironlat)。此外，Ironlat的溶解率在pH>5時(shí)表示為對于含有6. 7%的鐵的絡(luò)合物而言，是部分溶解的；并且對于含有4. 6%的鐵的絡(luò)合物而言，是完全溶解的。
Cremonesi 等人在 International Journal of Clinical PharmacologyTherapy and Toxicology 31卷(1993)40-51頁中指出琥拍酰酪蛋白鐵(III)(起始于琥拍酰酪蛋白而獲得的鐵(III)絡(luò)合物)的化學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，相對于其它鐵衍生物， 該產(chǎn)品(具有等于5%的鐵含量)顯示出更好的胃腸耐受性。
歐洲專利EP939083B1中描述了一種用于生產(chǎn)琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，該方法提供使用特定的撕碎和干燥程序以克服產(chǎn)品中存在不溶性成分的問題。此外，還描述了作為待用原料的食品級(jí)酪蛋白在琥珀酰酪蛋白鐵(III)的生產(chǎn)工藝中的用途。
為了有助于將產(chǎn)品中的微生物污染保持在規(guī)定的極限內(nèi)，在工藝中加入尼泊金甲酯和尼泊金丙酯防腐劑；當(dāng)分析最終產(chǎn)品時(shí)，分別測定以3%和1. 05%的水平存在的尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。防腐劑的這種用途同樣在專利EP1776382B1中有所描述，其介紹了在工藝中濕式造粒與產(chǎn)品的噴霧干燥或冷凍干燥結(jié)合使用以促進(jìn)溶解過程。
專利申請EP319664提出了一種基于琥珀酰酪蛋白鐵(III)的酶促降解的方法以克服在該絡(luò)合物中觀察到的溶解率和粘度的問題，尤其是當(dāng)鐵的特定值超過10%時(shí)。
國際專利申請W02007/065812描述了琥珀酰酪蛋白鐵(III)的制備，在懸浮液中操作的所述制備不僅進(jìn)行琥珀?；磻?yīng)，而且隨后進(jìn)行使用鐵(III)離子的絡(luò)合反應(yīng)，然而并未解決關(guān)于琥珀酰酪蛋白鐵(III)溶解困難的問題。事實(shí)上，該專利申請沒有提供關(guān)于所獲得的絡(luò)合物的溶解的信息，并且沒有測定可能獲得的溶液的粘度。
當(dāng)特定鐵含量超過5%的極限時(shí)，這種溶解問題尤為明顯。
由于水溶液中產(chǎn)品濃度增加而觀察到的粘度增加的現(xiàn)象使得超過預(yù)定濃度時(shí)使用琥珀酰酪蛋白鐵(III)變得困難，或者甚至阻礙了超過預(yù)定濃度時(shí)使用琥珀酰酪蛋白鐵 (III)。
除非使用超過15ml溶液的制劑，否則這些作用的結(jié)合會(huì)將產(chǎn)品的劑量限制到不超過800mg的值,相當(dāng)于每劑大約40mg的鐵(III)。
此外，琥珀酰酪蛋白鐵(III)的水溶液的粘度使得通過過濾和微細(xì)過濾來降低產(chǎn)品中微生物含量的操作復(fù)雜化，并且要求使用大量的防腐劑。
因此，顯而易見的是，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供用于克服琥珀酰酪蛋白鐵(III)(一種高效治療各種形式的鐵缺乏的藥物)溶解問題的簡單方案。發(fā)明內(nèi)容
目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果將食用酪蛋白(所述食用酪蛋白已經(jīng)經(jīng)受旨在除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)和/或提高磷/氮比例(P/N比例)的純化工藝)用作原料，那么在琥珀酰酪蛋白鐵(III)的生產(chǎn)中可以獲得令人吃驚的優(yōu)勢。事實(shí)上，因此有可能獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征不僅在于含有更少雜質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，而且意想不到地在于改善的水中溶解率。這種改善的溶解率使其有可能獲得水溶液和/或懸浮液，所述水溶液和/或懸浮液顯示出比起始于商購的食品級(jí)酪蛋白而獲得的粘度更低的粘度。
關(guān)于酪蛋白，根據(jù)本發(fā)明的表述“蛋白質(zhì)雜質(zhì)”用于表示與各種變體酪蛋白不同的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)借助于采用考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Blue)染色和密度計(jì)分析的一維電泳來測定。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)是與α-SI酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白不同的蛋白質(zhì)。
類似地，關(guān)于琥珀酰酪蛋白鐵(III)，根據(jù)本發(fā)明的表述“蛋白質(zhì)雜質(zhì)”用于表示與各種變體琥珀酰酪蛋白不同的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)借助于采用考馬斯亮藍(lán)染色和密度計(jì)分析的一維電泳來測定。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)是與α-Sl酪蛋白、a-S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和/或假K酪蛋白(pseudo-kappa casein)的琥拍酰產(chǎn)品不同的琥拍酰蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的表述“無機(jī)雜質(zhì)”用于表示硫酸灰分。
術(shù)語“P/N比例”用于表示樣品中存在的以重量計(jì)的磷的量(借助于ICP技術(shù)來測定)和以重量計(jì)的氮的量(通過元素分析來測定)之間的比例。
根據(jù)本發(fā)明，以重量百分比表示的值(重量％)應(yīng)當(dāng)旨在相對于琥珀酰酪蛋白鐵 (III)的總重量或酪蛋白的總重量。
因此，本發(fā)明的目的是琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量％和 7重量％之間并且在水中的溶解率為大約92重量％以上。優(yōu)選地，這種在水中的溶解率被視為在大約11. 5份水中的溶解率。
所述琥珀酰酪蛋白鐵(III)進(jìn)一步含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)的量為大約 15%以下，優(yōu)選大約10%以下和/或P/N比例為大約5%以上，優(yōu)選大約5. 5%以上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，其包含以下步驟
a)將酪蛋白和琥珀酸酐在水里反應(yīng)以獲得琥珀酰酪蛋白，
b)將琥珀酰酪蛋白與三氯化鐵(III)反應(yīng)以獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，
其特征在于根據(jù)步驟a)的所述酪蛋白是純化的酪蛋白，其具有低的蛋白質(zhì)雜質(zhì)和 /或無機(jī)雜質(zhì)含量和/或高的P/N比例。
優(yōu)選地,所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量為15重量％以下,所述無機(jī)雜質(zhì)的含量為1重量％ 以下，并且以重量計(jì)的磷含量與以重量計(jì)的氮含量之間的比例為大約5重量％以上。
更優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量為大約10重量％以下和/或所述無機(jī)雜質(zhì)的含量為大約O. 4重量％以下和/或磷重量含量與氮重量含量之間的比例為大約5. 5%以上。
本發(fā)明所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)是與α -SI酪蛋白、a -S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白和 /或假K酪蛋白不同的蛋白質(zhì)。
通常根據(jù)其制備中應(yīng)用的沉淀技術(shù)來鑒定食用酪蛋白借助于酸化來進(jìn)行酸凝酪蛋白(acid casein)沉淀,使用凝乳酶(rennet)獲得的酪蛋白是酶凝的(presamic),通常也被稱為凝乳酶凝酪蛋白(rennetcasein)。
根據(jù)本發(fā)明，作為原料使用的食用酪蛋白可以是酸凝酪蛋白或酶凝酪蛋白 (presamic casein)。
不管類型(酸凝或酶凝)，這些商購產(chǎn)品通常沒有分析文件；典型的指示參數(shù)是水含量、蛋白質(zhì)含量(通過將倍增因數(shù)應(yīng)用于總氮值來測定)、微生物污染水平和粒度測量。這種特性描述水平完全適合在食品工業(yè)中使用酪蛋白，但是我們目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)琥珀酰酪蛋白鐵(III)的制備需要對該原料進(jìn)行深入的分析評價(jià)。
根據(jù)本發(fā)明用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的、作為原料使用的商購食用酪蛋白和純化的酪蛋白借助于反相HPLC,根據(jù)Bonizzi等人Journal of Chromatography A 1261 卷(2009) 165-168頁(并入本文用于參考)指示的方法進(jìn)行分析。
因此，有可能鑒定三種類型的酪蛋白α -S1、a -S2、β、κ和假κ。
通過一維和二維電泳分析，使用考馬斯亮藍(lán)作為指示劑，伴隨著各種類型的酪蛋白及其衍生自其轉(zhuǎn)錄后修飾(如糖基化和磷酸化)的各種變體的分離，還有可能評價(jià)蛋白質(zhì)雜質(zhì)的存在。
特別地，使用含有14%聚丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE電泳(采用考馬斯亮藍(lán)染色和基于以不同量的BSA構(gòu)建的定標(biāo)線的密度分析)來定量測定蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
根據(jù)歐洲藥典(FarmacopeaEuropea, method Eu. Pharm. 2. 4. 14),使用硫酸灰分方法也可以分析所述酪蛋白和純化的酪蛋白。然后通過ICP技術(shù)來測定其磷(P)含量，并且通過元素分析來測定氮(N)含量，因此將關(guān)于磷所觀測的重量除以關(guān)于氮所觀測的重量并且將結(jié)果乘以100來計(jì)算P/N%比例。下表I顯示針對各種類型的酪蛋白，即商購食用酪蛋白(酸凝和酶凝)和根據(jù)本發(fā)明方法的純化的酪蛋白獲得的結(jié)果。
表I
酪蛋白原料蛋白質(zhì)雜質(zhì)硫酸灰分P/N%酸凝酪蛋白實(shí)施例化合物I和215%1. 6%酶凝酪蛋白實(shí)施例化合物320%9. 2%實(shí)施例4實(shí)施例8A和9A5%0. 4%5. 5%實(shí)施例5實(shí)施例8B9%0. 9%5. 1%實(shí)施例6實(shí)施例8C8%0. 2%5. 6%
權(quán)利要求
1.一種琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量％和7重量％之間并且溶解率為大約92%以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于其含有的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的量為大約15重量％以下,優(yōu)選大約10重量％以下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于其具有的磷/氮比例為大約5重量％以上，優(yōu)選大約5. 5重量％以上。
4.一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法，其包含以下步驟a)將酪蛋白和琥珀酸酐在水里反應(yīng)以獲得琥珀酰酪蛋白，b)將琥珀酰酪蛋白與三氯化鐵(III)反應(yīng)以獲得琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于根據(jù)步驟a)的所述酪蛋白是純化的酪蛋白，其具有的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量為 15重量％以下和/或無機(jī)雜質(zhì)含量為I重量％以下和/或磷/氮比例為大約5%以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量為大約10重量％以下和/或所述無機(jī)雜質(zhì)含量為大約O. 4重量％以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)雜質(zhì)是與α-Sl酪蛋白、a-S2 酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白、假K酪蛋白不同的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述純化的酪蛋白具有的磷/氮比例為大約5重量％以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述純化的酪蛋白是從酸凝酪蛋白或酶凝釀蛋白獲得的。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其包含琥珀酰酪蛋白鐵(III)水溶液的微細(xì)過濾的額外步驟。
10.一種琥珀酰酪蛋白鐵，其能夠通過根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
11.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至3和/或10所述的琥珀酰酪蛋白鐵 (III)和至少一種生理學(xué)上可接受的賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于其是液體或固體形式，優(yōu)選液體形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于所述液體形式為溶液或懸浮液，優(yōu)選水溶液。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于所述組合物是含有大約8重量％的琥珀酰酪蛋白鐵(III)的溶液，所述溶液具有的粘度為大約400mPa·秒以下，優(yōu)選大約 300mPa ·秒以下。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其中相對于所述組合物的總重量，其中含有的琥珀酰酪蛋白鐵(III)的量在5重量％和15重量％之間，優(yōu)選6重量％和12重量％ 之間，更優(yōu)選7重量％和9重量％之間。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其用于口服或腸胃外使用，優(yōu)選用于口服使用。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其用于治療鐵缺乏。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其用于治療貧血、妊娠期鐵缺乏、吸收不良綜合征、哺乳期鐵缺乏和生長期鐵缺乏。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種琥珀酰酪蛋白鐵(III)，其特征在于鐵含量在4.5重量%和7重量%之間，并且在水中的溶解率大約為92%以上。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于制備琥珀酰酪蛋白鐵(III)的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK103025751SQ201080067086
公開日2013年4月3日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者A·斯蒂夫納奇, L·德菲拉, B·平托 申請人:意大發(fā)馬克股份公司