專(zhuān)利名稱(chēng)：用于在出血性紊亂的治療和預(yù)防性處理中進(jìn)行非靜脈內(nèi)施用的白蛋白融合凝血因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含用于在出血性紊亂的治療和預(yù)防性處理中進(jìn)行非靜脈內(nèi)施用的白蛋白融合凝血因子的藥物制劑以及通過(guò)將凝血因子與白蛋白融合而提高其在非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收(in vivo recovery)的方法。
背景技術(shù)：
用于人類(lèi)治療和預(yù)防用途的若干重組治療性多肽在市面上有售?；颊咄ǔＪ芤嬗谥亟M活性成分的特異作用模式，但目前所有市售的凝血因子均是通過(guò)靜脈內(nèi)給藥施加的， 這常常導(dǎo)致注射位置的感染并且是患者通常希望避免的一個(gè)措施，尤其是治療凝血過(guò)程有缺陷的兒童時(shí)。Balance等(W0 01/79271)描述了眾多的不同治療多肽的融合多肽，當(dāng)它們與人血清白蛋白融合時(shí)預(yù)計(jì)將具有增加的體內(nèi)功能半壽期和延長(zhǎng)的儲(chǔ)存期。文中描述了一長(zhǎng)串潛在的融合配偶體，但幾乎對(duì)所有這些多肽都沒(méi)有用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示各自的白蛋白融合蛋白確實(shí)保持了生物學(xué)活性并且具有改善的特性。在此份名單中作為例子提及的治療多肽是因子IX和FVII/FVIIa。此外還描述了 FIX和FVII/FVIIa的融合，其中在白蛋白和FIX或 FVII/FVIIa之間有肽接頭。不過(guò)，沒(méi)有披露當(dāng)非靜脈內(nèi)施加相應(yīng)的凝血因子時(shí)白蛋白融合體可改善治療性處理。因子VII和因子VIIaFVII是分子量50kDa的單鏈糖蛋白，它作為406個(gè)氨基酸的無(wú)活性酶原由肝細(xì)胞分泌入血流中。FVII通過(guò)Argl52-Ilel53處單一肽鍵的蛋白水解轉(zhuǎn)變?yōu)樗幕钚孕问揭蜃覸ila，此水解導(dǎo)致形成了兩條多肽鏈，N-末端輕鏈(MkDa)和C-末端重鏈Q(jìng)8kDa)，它們通過(guò)一個(gè)二硫橋連接在一起。與其它維生素K-依賴(lài)性凝血因子相反，在活化期間沒(méi)有活化肽被裂解下來(lái)。因子VII的活化裂解可在體外完成，例如通過(guò)因子X(jué)a，因子IXa，因子 Vila，因子X(jué)lla，因子七激活蛋白酶(FSAP)和凝血酶。Mollerup等(Biotechnol. Bioeng. (1995)48 =501-505)報(bào)告了在重鏈的Arg290和/或Arg315處也發(fā)生某些裂解。因子VII以500ng/ml的濃度存在于血漿中。約或5ng/ml的因子VII是作為激化的因子VIIa存在。已發(fā)現(xiàn)因子VII的終末血漿半衰期是大約4小時(shí)，而因子VIIa的是大約2小時(shí)。通過(guò)施加超生理水平濃度的因子Vila，可繞開(kāi)對(duì)因子VIIIa和因子DCa的需要而完成止血。因子VII之CDNA的克隆(US 4，784，950)使得有可能研發(fā)活化的因子VII作為藥品。1988年因子VIIa首次被成功施用。從那時(shí)起，因子VIIa的適應(yīng)癥量穩(wěn)步增長(zhǎng)，顯示了其成為通用止血?jiǎng)﹣?lái)阻止出血的潛能(Erhardtsen，2002)。不過(guò)，因子VIIa約2小時(shí)的短終末半衰期和減少的體內(nèi)回收限制了它的應(yīng)用。人的FIX人的FIX是維生素K-依賴(lài)型多肽族的一個(gè)成員，它是分子量為57kDa的單鏈糖蛋白，以415個(gè)氨基酸的無(wú)活性酶原形式由肝細(xì)胞分泌至血流中。它包含位于多肽N-末端Gla結(jié)構(gòu)域的12個(gè)Y-羧基-谷氨酸殘基。這些Gla殘基需要維生素K用于它們的生物合成。 在Gla結(jié)構(gòu)域后面有兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域，一個(gè)活化肽和胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FIX的進(jìn)一步翻譯后修飾包括羥基化(Asp 64)，N-(Asnl57和Asnl67)以及0-型糖基化(Ser53, Ser61, Thr 159, Thrl69 和 Thrl72)、硫酸化(Tyrl55)和磷酸化(Serl58)。FIX通過(guò)在Argl45-Alal46和Argl80_Vall81處水解活化肽而轉(zhuǎn)變成它的活性形式因子IXa，所述水解導(dǎo)致形成了兩條多肽鏈，即N-末端輕鏈(ISkDa)和C-末端重鏈 QSkDa)，它們通過(guò)一個(gè)二硫橋連接在一起。因子IX的活化裂解可在體外通過(guò)例如因子X(jué)Ia 或因子VIIa/TF來(lái)完成。因子IX以5-10 μ g/ml的濃度存在于人的血漿中。已發(fā)現(xiàn)人的因子IX的終末血菜半衰期是約15至18小時(shí)(White GC et al. 1997. Recombinant factor IX. Thromb Haemost. 78 :261-265 ；Ewenstein BM et al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B.Transfusion 42:190—197)。B型血友病是由因子IX的無(wú)功能或缺失引起的，其用來(lái)自血漿的因子IX濃縮物或重組形式的因子IX治療。由于B型血友病患者常常接受至少兩周一次(biweekly)的預(yù)防性施用因子IX以避免自發(fā)的出血，因此人們希望通過(guò)延長(zhǎng)因子IX產(chǎn)品之半壽期來(lái)延長(zhǎng)兩次施用之間的時(shí)間間隔并避免靜脈內(nèi)施用因子IX。因子 VIII (FVIII)FVIII是分子質(zhì)量約^OkDa的血漿糖蛋白，產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物的肝臟中。它是導(dǎo)致血液凝固的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵組分。此級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的一步是因子IXa(FIXa)結(jié)合FVIII 一起將因子X(jué)(FX)轉(zhuǎn)變成活化形式FXa。FVIII在此步中作為輔助因子，與鈣離子和磷脂一起為FMa活性所必需。最常見(jiàn)的血友病紊亂是由功能性FVIII缺乏引起的，稱(chēng)為A型血友病。A型血友病治療中的一個(gè)重要進(jìn)展是分離到了編碼人FVIII之完整2，351個(gè)氨基酸序列的cDNA克隆(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 4，757，006)以及提供了人FVIII基因DNA序列和用于其產(chǎn)生的重組方法。對(duì)測(cè)定自克隆cDNA的人FVIII的推斷一級(jí)氨基酸序列進(jìn)行分析顯示它是從較大的前體多肽加工而來(lái)的異二聚體。所述異二聚體由約SOkDa的C-末端輕鏈以金屬離子依賴(lài)型締合結(jié)合約210kDa的N-末端重鏈片段組成。(參閱綜述Kaufman，Transfusion Med. Revs. 6 :235(1992)).通過(guò)由凝血酶對(duì)蛋白鏈進(jìn)行蛋白水解性裂解使此異二聚體發(fā)生生理激活。凝血酶將重鏈裂解成90kDa的蛋白質(zhì)，然后裂解成MkDa和44kDa片段。凝血酶還將SOkDa的輕鏈裂解成72kDa的蛋白質(zhì)。正是后一蛋白質(zhì)和兩個(gè)重鏈片段(上述MkDa和 44kDa)通過(guò)鈣離子結(jié)合在一起，組成了活性的FVIII。當(dāng)72kDa和MkDa蛋白質(zhì)進(jìn)一步被凝血酶、活化蛋白C或FXa裂解時(shí)會(huì)發(fā)生失活。在血漿中，此FVIII復(fù)合物通過(guò)與50倍過(guò)量的VWF蛋白質(zhì)(“VWF")聯(lián)合而得以穩(wěn)定，后者看起來(lái)抑制了如上所述的FVIII的蛋白水解性破壞。FVIII的氨基酸序列被組織入三個(gè)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域330個(gè)氨基酸的三重A結(jié)構(gòu)域、 980個(gè)氨基酸的單一 B結(jié)構(gòu)域和150個(gè)氨基酸的雙重C結(jié)構(gòu)域。B結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性，且提供了此蛋白質(zhì)內(nèi)25個(gè)潛在天冬酰胺(N)-連接之糖基化位點(diǎn)中的18個(gè)。B 結(jié)構(gòu)域顯然在凝結(jié)中無(wú)功能并且可被缺失，而B(niǎo)結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII分子仍然具有促凝血
4活性。Von Willebrand 因子(vWF)VWF是存在于哺乳動(dòng)物血漿中的多聚粘附糖蛋白，它具有多重生理學(xué)功能。在初期止血時(shí)，VWF充當(dāng)血小板表面上特異受體和胞外基質(zhì)組分諸如膠原蛋白之間的中介物。此夕卜，VffF用作促凝劑FVIII的載體和穩(wěn)定蛋白。VWF以觀13個(gè)氨基酸的前體分子的形式合成于內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中。該前體多肽，前原VWF，由22個(gè)殘基的單一肽、741個(gè)殘基的原肽和在成熟血漿VWF中發(fā)現(xiàn)的2050個(gè)殘基的多肽組成(Fischer et al.，F(xiàn)EBS Lett. 351 345-348，1994)。在分泌入血漿時(shí)，VWF以具有不同分子大小的不同種類(lèi)形式循環(huán)。這些VWF 分子由2050個(gè)氨基酸殘基的成熟亞基的寡聚體和多聚體組成。VWF通?？梢砸粋€(gè)二聚體至由50-100個(gè)二聚體組成的多聚體形式發(fā)現(xiàn)于血漿中(Ruggeri et al. Thromb. Haemost. 82 576-584，1999)。人的VWF在人體循環(huán)中的體內(nèi)半衰期是大約12至20小時(shí)。在人類(lèi)中最頻繁的遺傳性出血紊亂是維勒布蘭德氏病(von Willebrand' s disease, VWD)，它可用包含血漿或重組來(lái)源的VWF的濃縮物通過(guò)替代療法進(jìn)行治療。VWF可按例如EP 05503991中所述由人的血漿制備。在專(zhuān)利EP0784632中描述了用于分離重組VWF的方法。已知VWF在體內(nèi)穩(wěn)定FVIII，起調(diào)節(jié)FVIII之血漿水平的關(guān)鍵作用，并因此是控制初級(jí)和次級(jí)止血的重要因子。此外還已知在對(duì)VWD患者靜脈內(nèi)施用含VWF的藥物制劑后， 可觀察到在M小時(shí)內(nèi)內(nèi)源FVIII :C增加至1至3個(gè)單位每ml，證明了 VWF對(duì)FVIII的體內(nèi)穩(wěn)定作用。直至今日，A型血友病和VWD的標(biāo)準(zhǔn)治療仍包括頻繁的靜脈內(nèi)輸注FVIII制劑和 VWF濃縮物。B型血友病的治療需要兩周一次施用因子IX，并且在用FVIIa治療抑制型患者時(shí)，利用每周多次施用FVIIa來(lái)避免出血。這些替代療法通常是有效的，不過(guò)，在例如經(jīng)歷預(yù)防性治療的嚴(yán)重A型血友病患者中，由于因子VIII約12小時(shí)的短血漿半衰期，不得不每周約3次靜脈內(nèi)(i. V.)施用因子VIII。已經(jīng)高于非血友病之FVIII活性的水平時(shí)，例如，F(xiàn)VIII水平提高至約0，OlU/ ml時(shí)，嚴(yán)重的A型血友病被轉(zhuǎn)變成中度的A型血友病。在預(yù)防性治療中，設(shè)計(jì)劑量給藥形式以使FVIII活性的波谷水平不降到低于非血友病個(gè)體內(nèi)之FVIII活性的2-3%的水平。經(jīng)由靜脈內(nèi)施用凝血因子是不方便的、有痛苦并且承擔(dān)著感染的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是因?yàn)檫@大部分是由患者自己或被診斷患A型血友病的孩子的父母在家庭治療中完成的。此夕卜，頻繁的靜脈內(nèi)注射不可避免的導(dǎo)致了疤痕產(chǎn)生，妨礙了未來(lái)的輸注。由于嚴(yán)重血友病的預(yù)防性治療在生命的早期就開(kāi)始了，對(duì)于孩子經(jīng)常在小于2歲時(shí)，所以對(duì)如此小的患者每周3次注射FVIII到靜脈內(nèi)就更困難了。在有限的一段時(shí)間內(nèi)，植入端口系統(tǒng)可能是一個(gè)備選方案。盡管可能發(fā)生重復(fù)感染并且在體育運(yùn)動(dòng)時(shí)端口可能造成不方便這些事實(shí)，它們通常仍然被認(rèn)為相較于靜脈內(nèi)注射而言是更可選的。因此對(duì)于避免靜脈內(nèi)輸注凝血因子存在很大的醫(yī)療需求。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及在出血性紊亂的治療和預(yù)防性處理中適于非靜脈內(nèi)施用、包含白蛋白融合凝血因子的藥物制劑以及通過(guò)將其與白蛋白融合而在凝血因子的非靜脈內(nèi)施用后增加體內(nèi)回收的方法。
優(yōu)選凝血因子是維生素-K依賴(lài)型凝血因子及其片段和變體。更優(yōu)選的是FVIIa 和FIX及其片段和變體。此外非限制性地優(yōu)選白蛋白-融合的FVIII和vWF、纖維蛋白原、 因子II、因子X(jué)、因子X(jué)III、凝血酶、凝血酶原和蛋白C。優(yōu)選含白蛋白融合凝血因子的制劑通過(guò)皮下施用。不過(guò)所有其它非靜脈內(nèi)施用形式也包括在內(nèi)，例如肌肉內(nèi)或皮內(nèi)施用。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，凝血因子可經(jīng)由可被蛋白酶裂解的肽接頭與白蛋白融
I=I O本發(fā)明的要旨具體而言通過(guò)維生素K-依賴(lài)型多肽因子VII和白蛋白得以證明。本發(fā)明還涉及其它的凝血因子。本發(fā)明還涉及編碼白蛋白融合凝血因子的cDNA。編碼各自凝血因子的cDNA被遺傳性地與編碼人血清白蛋白的cDNA序列融合，并且可通過(guò)編碼可被蛋白酶裂解的居間肽接頭的寡核苷酸連接。本發(fā)明還涉及將包含所述融合cDNA序列的重組表達(dá)載體用于非靜脈內(nèi)施用。這可以是例如經(jīng)由肌肉內(nèi)注射包含編碼白蛋白融合凝血因子之cDNA的表達(dá)載體進(jìn)行的基因治療。發(fā)明詳述“白蛋白融合(的)凝血因子”在本發(fā)明的意義上意指人白蛋白與凝血因子的遺傳性融合體，其中所得的融合多肽的血漿半衰期相較于相同類(lèi)型但非融合型的凝血因子而言有所延長(zhǎng)，并且其中非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收相較于相同但非融合型的凝血因子在非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收而言有所增加。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括白蛋白融合的凝血因子，其中非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收相較于相同但非融合型的凝血因子在非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收而言增加了至少 10 %，優(yōu)選至少25 %，更優(yōu)選超過(guò)50 %，更優(yōu)選超過(guò)100 %，還更優(yōu)選超過(guò)200 %?！胺庆o脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收”意指在非靜脈內(nèi)施用后可在血漿中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)活性凝血因子的量。非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收可利用本領(lǐng)域眾所周知的測(cè)定相應(yīng)凝血因子生物學(xué)活性的分析性凝結(jié)相關(guān)檢驗(yàn)確定為例如“曲線(xiàn)下的面積”，或者“血漿水平峰值”?！绑w內(nèi)回收”在本發(fā)明的意義上是意指在施用所述產(chǎn)品后不久在血液或血漿中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)品量。因此， 為了探測(cè)體內(nèi)回收，通常在施用所述產(chǎn)品后例如15分鐘、或60分鐘或2小時(shí)或4小時(shí)或8 小時(shí)或12小時(shí)或20小時(shí)測(cè)定其血漿含量。“凝結(jié)相關(guān)檢驗(yàn)”在本發(fā)明的意義上是測(cè)定凝結(jié)過(guò)程中相關(guān)的酶活性或輔助因子活性或能測(cè)定內(nèi)在或外在凝結(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)已被激活的任何檢驗(yàn)?！澳Y(jié)相關(guān)”檢驗(yàn)因此可以是直接的凝結(jié)檢驗(yàn)，類(lèi)似aPTT，PT，或者凝血酶產(chǎn)生檢驗(yàn)。不過(guò)，其它的檢驗(yàn)，類(lèi)似例如應(yīng)用于特異凝血因子的顯色檢驗(yàn)也包括在內(nèi)。所述檢驗(yàn)或相應(yīng)試劑的例子是利用相應(yīng)凝血因子缺乏血漿(Dade Behring)的Pathromt in SL (aPTT 檢驗(yàn)，Dade Behring)或 Thrombore 1 S (凝血酶原時(shí)間測(cè)定，Dade Behring)，利用例如凝血因子缺乏血漿的凝血酶產(chǎn)生檢驗(yàn)試劑盒CTechnoclone，Thrombinoscope)，顯色檢驗(yàn)法，象Biophen因子 IX(Hyphen BioMed) ,Staclot FVIIa-rTF(Roche Diagnostics GmbH) ,CoateS t 因子 VIII :C/4 (Chromogenix)，或其它。作為測(cè)定生物學(xué)活性凝血因子的替代，還可測(cè)定相應(yīng)凝血因子的抗原的量。優(yōu)選通過(guò)類(lèi)似ELISA檢驗(yàn)的技術(shù)測(cè)定抗原水平。
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“凝血因子”在本發(fā)明的意義上是可有助于初級(jí)或次級(jí)止血的任何多肽?！澳蜃印卑ǖ痪窒抻?，由因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X(jué)， 因子X(jué)I，因子X(jué)II，因子X(jué)III，因子I，因子11(凝血酶原)，蛋白C，蛋白S，GAS6或蛋白Z組成的多肽以及它們的活化形式。此外，有效的凝血因子可以是野生型多肽或可以包含突變。 糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可隨所選定宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞環(huán)境特性而變化。 當(dāng)提到特定氨基酸序列時(shí)，所述序列的翻譯后修飾也包含在本申請(qǐng)中。白蛋白用于此處時(shí)，“白蛋白”總體上指白蛋白多肽或氨基酸序列，或具有白蛋白的一種或更多種功能活性(例如生物學(xué)活性)的白蛋白片段或變體。特別是，“白蛋白”指人的白蛋白或其片段，尤其是本文中以SEQ ID No :1所示的成熟形式的人白蛋白或來(lái)自其它脊椎動(dòng)物的白蛋白或其片段，或者這些分子的類(lèi)似物或變體或者其片段。白蛋白融合蛋白質(zhì)中的白蛋白部分可包含如上所述的全長(zhǎng)HA序列，或者可能包含它的能穩(wěn)定或延長(zhǎng)治療活性的一個(gè)或多個(gè)片段。這樣的片段可以是10個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或者可能包含來(lái)自HA序列的約15，20，25，30，50，或更多個(gè)連續(xù)氨基酸或者可能包含 HA的部分或全部特定結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的變體，或天然或人造的。 本發(fā)明融合蛋白的治療多肽部分也可以是如本文所述之相應(yīng)治療多肽的變體。術(shù)語(yǔ)“變體” 包括插入、缺失和取代，其或者保守的或不保守，或天然或人造，其中所述變化基本上不改變賦予所述治療多肽之治療活性的活性位點(diǎn)或活性結(jié)構(gòu)域。特別是，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白可包含天然存在的人白蛋白多態(tài)變體和人白蛋白片段。白蛋白可來(lái)自任何脊椎動(dòng)物，尤其是任何哺乳動(dòng)物，例如人、牛、綿羊或豬。非哺乳動(dòng)物白蛋白包括但不局限于母雞和鮭魚(yú)。白蛋白連接多肽的白蛋白部分可來(lái)自與治療多肽部分來(lái)源不同的動(dòng)物。一般而言，白蛋白片段或變體會(huì)是至少10個(gè)，優(yōu)選至少40個(gè)，最優(yōu)選超過(guò)70個(gè)氨基酸長(zhǎng)。白蛋白變體優(yōu)選由以下部分組成或包含以下部分白蛋白的至少一個(gè)完整結(jié)構(gòu)域或所說(shuō)結(jié)構(gòu)域的片段，例如結(jié)構(gòu)域1 (SEQ ID NO :1的氨基酸1-194)，2 (SEQ ID N0:1的氨基酸 195-387)，3 (SEQ ID NO 1 的氨基酸 388-585)，1+2 (SEQ ID NO 1 的 1-387)，2+3 (SEQ ID NO :1 的 195-585)或 1+3 (SEQ ID NO 1 的氨基酸 1-194+SEQ ID NO 1 的氨基酸 388-585)。 每個(gè)結(jié)構(gòu)域自身是由兩個(gè)同源亞結(jié)構(gòu)域即1-105，120-194，195-291，316-387，388-491和 512-585 組成，具有包含殘基 Lysl06 至 Glull9，Glu292 至 Val315 以及 Glu492 至 Ala511 的柔性亞結(jié)構(gòu)域間連接區(qū)域。本發(fā)明之白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含HA的至少一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或它們的保守修飾。本發(fā)明包括作為凝血因子融合配偶體的白蛋白所有片段或變體，只要它們使得治療性融合蛋白在血漿中的半衰期相較于非融合型凝血因子而言延長(zhǎng)至少25%即可。“白蛋白融合(的)凝血因子"用于此申請(qǐng)中意指包含非活化及活化形式的相應(yīng)凝血因子的多肽?！鞍椎鞍兹诤夏蜃印庇糜诒景l(fā)明時(shí)包括分別具有天然凝血因子和白蛋白之氨基酸序列的蛋白質(zhì)。還包括具有輕微修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，例如，包含 N-末端氨基酸缺失或添加的已修飾N-末端，只要那些蛋白質(zhì)基本上保持各自凝血因子的生物學(xué)活性即可。以上定義中的“白蛋白融合凝血因子”還包括可能在不同個(gè)體之間存在的天然等位基因變異。以上定義中的"白蛋白融合凝血因子”進(jìn)一步包括各自凝血因子的變體和白蛋白的變體。這樣的變體在一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基上與野生型序列不同。所述差異的例子可包括N-和/或C-末端截短了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如，1至10個(gè)氨基酸殘基)，或N-和/或C-末端添加了一個(gè)或多個(gè)額外的殘基，例如在N-末端添加了甲硫氨酸殘基，以及保守性的氨基酸取代，即，在具有相似特性的氨基酸組內(nèi)進(jìn)行取代，例如(1) 小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)極性氨基酸，(4)堿性氨基酸，(5)疏水氨基酸，(6)芳香族氨基酸。所述保守取代的例子如下表所示。表 1
(1)丙氨酸 Wl
~~(2)天冬氨酸~~Wm 135天冬酰胺~~谷氨酰胺
(3b)絲氨酸蘇氨酸
~~(4)精氨酸組氨酸賴(lài)氨酸
~(5)異亮氨酸亮氨酸甲硫氨酸繳氨酸
~~(6)苯丙氨酸~Wm""ISl本發(fā)明融合蛋白的體內(nèi)半壽期，通常以終末半壽期或半壽期測(cè)定，常常比非融合多肽的體內(nèi)半壽期長(zhǎng)至少約25%，優(yōu)選至少約50%，更優(yōu)選超過(guò)100%。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中的接頭區(qū)域包含待施用的凝血因子序列或其變體，它應(yīng)使得所表達(dá)融合蛋白的新抗原特性(由于在治療性抗原內(nèi)出現(xiàn)人蛋白質(zhì)中不存在的肽而形成新的潛在免疫原表位)的風(fēng)險(xiǎn)降低。此外在凝血因子是酶原(例如，需要蛋白水解激活) 的情況下，肽接頭裂解的動(dòng)力學(xué)將更接近地反應(yīng)酶原的凝結(jié)相關(guān)活化動(dòng)力學(xué)。因此，在所述優(yōu)選實(shí)施方案中，酶原和相應(yīng)的接頭以相當(dāng)?shù)膭?dòng)力學(xué)被活化和相應(yīng)地裂解。因此，本發(fā)明還特別涉及酶原和白蛋白的融合蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，接頭肽包含針對(duì)一個(gè)以上蛋白酶的裂解位點(diǎn)。這可通過(guò)可在同一位置被不同蛋白酶裂解的接頭肽或通過(guò)提供兩個(gè)或更多個(gè)不同裂解位點(diǎn)的接頭肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。這在下述情況下是有利的，即其中治療性融合蛋白必須通過(guò)蛋白水解性裂解被激活以達(dá)到酶活性，以及不同蛋白酶可能有助于此活化步驟時(shí)。例如FIX的活化即是如此， 它可通過(guò)FXIa或通過(guò)FVIIa/組織因子(TF)完成。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是治療性融合蛋白，其中的接頭可被蛋白酶裂解，激活凝血因子，從而保證接頭的裂解與凝結(jié)發(fā)生位置處凝血因子的活化相關(guān)聯(lián)。依照本發(fā)明的其它優(yōu)選治療性融合蛋白是其中一旦被激活即可被作為治療性融合蛋白一部分的凝血因子裂解所述接頭的那些融合蛋白，這樣也保證了融合蛋白的裂解與凝血事件相關(guān)聯(lián)。
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依照本發(fā)明的其它優(yōu)選治療性融合蛋白是其中所述接頭可被蛋白酶所裂解的那些融合蛋白，所述蛋白酶自身直接或間接被作為治療性融合蛋白一部分的凝血因子的活性所激活，這樣也保證了融合蛋白的裂解與凝血事件相關(guān)聯(lián)。最優(yōu)選的一類(lèi)治療性融合蛋白是其中接頭可被FXIa和/或被FVIIa/TF裂解且凝血因子是FIX的那些融合蛋白。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用含白蛋白融合凝血因子的藥物組合物進(jìn)行非靜脈內(nèi)施用。施用模式優(yōu)選皮下的，但包括所有的血管外施用途徑。還包括經(jīng)由上皮表面的施用 (例如，在皮膚上)。特別的臨床應(yīng)用是通過(guò)貼片施用，這種局部的施用需要經(jīng)由皮膚吸收， 不過(guò)它可以是相當(dāng)顯著的，不僅是對(duì)表面磨損處也對(duì)完整無(wú)損的皮膚如此，它可能包括滴眼劑和鼻子處的應(yīng)用。經(jīng)由上皮表面的施用包括吸入，這是合適的，因?yàn)樘貏e大的表面被蛋白質(zhì)所覆蓋，導(dǎo)致快速吸收而避免了經(jīng)過(guò)肝臟。在上皮表面的施用包括保持在嘴里或舌頭下的劑型，即口腔的或舌下的劑型，可能甚至如口香糖。由于嘴里的PH相對(duì)中性(與酸性的胃環(huán)境形成對(duì)照)，這對(duì)于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)諸如FVIII是積極的。也可考慮陰道和甚至直腸施用，因?yàn)榱鞒鲋蹦c的某些靜脈直接進(jìn)入大循環(huán)。通常這對(duì)于不能經(jīng)由口服途徑攝入物質(zhì)的患者最有幫助，譬如年幼的孩子。皮內(nèi)注射(在皮膚內(nèi))會(huì)是更侵入性的施用方式，但仍適于無(wú)需專(zhuān)門(mén)人才幫助或甚至實(shí)施的治療。皮內(nèi)施用后是皮下注射(剛好在皮下下)。通常吸收相當(dāng)充分并且可通過(guò)溫暖或按摩注射區(qū)域增加吸收?；蛘呖蓪?shí)現(xiàn)血管收縮，產(chǎn)生相反的行為，即減少吸收但延長(zhǎng)效果。還更侵入性的血管外的施用包括肌肉內(nèi)遞送(進(jìn)入身體的肌肉內(nèi))。這可能通過(guò)繞開(kāi)脂肪組織提供了好處，但通常比皮下注射更痛苦，尤其是對(duì)特征在于缺乏凝血系統(tǒng)的患者而言，為了通過(guò)注射得到改善，但存在組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致出血。本發(fā)明的凝血因子以治療有效劑量施用于患者，意指足夠產(chǎn)生預(yù)期效果、阻止或減輕待治療疾病或指征之嚴(yán)重性或蔓延的劑量，但未到達(dá)產(chǎn)生無(wú)法忍受的不利副作用的劑量。確切劑量取決于許多因素，諸如指征、劑型、施用方式，并且必須針對(duì)每一種相應(yīng)指征在預(yù)臨床和臨床試驗(yàn)中確定。本發(fā)明的凝血因子可用于治療家族性和獲得性A型和B型血友病病例、家族性或獲得性von Willebrand病、所有類(lèi)型的創(chuàng)傷(鈍的或穿透性的，導(dǎo)致從單一器官、骨頭部分或從多發(fā)性創(chuàng)傷處嚴(yán)重出血)中的出血、外科手術(shù)時(shí)的出血包括圍手術(shù)期或手術(shù)后的出血、心臟手術(shù)導(dǎo)致的出血包括經(jīng)歷體外循環(huán)的患者和小兒科心臟手術(shù)中的血稀釋、大腦內(nèi)出血、蛛網(wǎng)膜下出血、硬腦膜下或硬腦膜上出血、由于血液丟失和血液稀釋造成的出血、通過(guò)非血漿體積取代導(dǎo)致受影響患者中凝血因子水平下降、由于彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和消耗性凝血病、凝血細(xì)胞功能紊亂、損耗和凝血病造成的出血，由于肝硬化、肝功能障礙和暴發(fā)性肝衰竭、肝病患者的肝活組織檢查造成的出血，肝臟和其它器官移植后的出血，來(lái)自胃靜脈曲張和胃潰瘍出血、婦科出血例如功能失調(diào)性子宮出血(DUB)、胎盤(pán)的過(guò)早剝離、低出生體重孩子的室周出血、產(chǎn)后出血、新生兒的致命危急狀況，與燒傷相關(guān)的出血，與淀粉樣變性病相關(guān)的出血，與血小板紊亂相關(guān)的造血干細(xì)胞移植，與惡性腫瘤相關(guān)的出血，與出血性病毒相關(guān)的感染，與胰腺炎相關(guān)的出血。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如本申請(qǐng)書(shū)所述編碼白蛋白融合凝血因子的多核苷酸的使用。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"通常指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它們可以是未修飾的 RNA或DNA或者已修飾的RNA或DNA。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA。用于此處時(shí)，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"還包括含有一個(gè)或多個(gè)被修飾堿基和/或不常見(jiàn)堿基例如肌苷的DNAs或RNAs。應(yīng)當(dāng)理解，為了滿(mǎn)足本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用的目的，可對(duì)DNA 和RNA進(jìn)行各種修飾。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"用于此處時(shí)包含了所述的化學(xué)、酶促或代謝性修飾形式的多核苷酸，以及病毒和細(xì)胞特征性的DNA和RNA化學(xué)形式，包括例如簡(jiǎn)單的和復(fù)雜的細(xì)胞。技術(shù)人員應(yīng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，給定的多肽可以由不同的多核苷酸編碼。這些“變體”包括在本發(fā)明中。優(yōu)選的，本發(fā)明的多核苷酸是純化的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“純化的”多核苷酸指基本上沒(méi)有其它核酸序列的多核苷酸，例如但不局限于其它的染色體的和染色體外的DNA和RNA。 純化的核苷酸可純化自宿主細(xì)胞?？捎眉夹g(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法獲得純化的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。除此以外，本發(fā)明的另一方面是包含本發(fā)明多核苷酸的質(zhì)粒或載體的使用。優(yōu)選的，所述質(zhì)?；蜉d體是表達(dá)載體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述載體是適用于人基因治療的轉(zhuǎn)移載體。糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可隨選定的宿主細(xì)胞和所述宿主細(xì)胞環(huán)境特性而變化。當(dāng)提及特定的氨基酸序列時(shí)，所述序列的翻譯后修飾也包含在本申請(qǐng)中。術(shù)語(yǔ)"重組"意指例如所述變體是通過(guò)遺傳工程技術(shù)在宿主生物體內(nèi)產(chǎn)生的。本發(fā)明的FVIII或VWF變體經(jīng)常是重組變體。所推薦變體的表達(dá)在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)高水平產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)需要將上述修飾的cDNA連同合適的調(diào)控元件一起在重組表達(dá)載體中裝配成有效的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，所述表達(dá)載體可依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在各種表達(dá)系統(tǒng)中增殖。有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可來(lái)自以動(dòng)物細(xì)胞作為其天然宿主的病毒或來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞的染色體DNA。優(yōu)選的，可使用來(lái)自猿猴病毒(Simian VirUS)40、腺病毒、BK多形瘤病毒、人巨細(xì)胞病毒或勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)片段的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合，或者包括動(dòng)物細(xì)胞中強(qiáng)組成型轉(zhuǎn)錄基因例如肌動(dòng)蛋白或GRP78的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子組合。為了達(dá)到穩(wěn)定的高水平的從cDNAs至mRNA的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄單元應(yīng)在其 3’ -近端部分包含編碼轉(zhuǎn)錄終止聚腺苷酸化序列的DNA區(qū)。優(yōu)選的，此序列來(lái)自猿猴病毒 40 (Simian Virus40)早期轉(zhuǎn)錄區(qū)、兔β _珠蛋白基因或人組織纖溶酶原激活劑基因。然后將cDNAs整合入適于本發(fā)明之白蛋白融合凝血因子表達(dá)的合適宿主細(xì)胞系的基因組中。優(yōu)選此細(xì)胞系應(yīng)是脊椎動(dòng)物來(lái)源的動(dòng)物細(xì)胞系，以保證正確的折疊、Gla-結(jié)構(gòu)域合成、二硫鍵形成、天冬酰胺連接糖基化、0-連接糖基化和其它翻譯后修飾以及向培養(yǎng)基的分泌。其它翻譯后修飾的例子是新生多肽鏈的羥基化和蛋白水解加工。可使用的細(xì)胞系的例子是猴COS-細(xì)胞、小鼠L-細(xì)胞、小鼠C127-細(xì)胞、倉(cāng)鼠BHK-21細(xì)胞、人胚腎293細(xì)胞和倉(cāng)鼠CHO-細(xì)胞?？梢匀舾刹煌绞綄⒕幋a相應(yīng)cDNAs的重組表達(dá)載體引入動(dòng)物細(xì)胞系中。例如， 可從基于不同動(dòng)物病毒的載體建立重組表達(dá)載體。這其實(shí)例有基于桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒(優(yōu)選牛乳頭瘤病毒)的載體。
還可將編碼相應(yīng)DNAs的轉(zhuǎn)錄單元與另一重組基因一起引入動(dòng)物細(xì)胞中，所述的另一重組基因可在這些細(xì)胞中用作顯性的選擇標(biāo)記以方便分離特異的細(xì)胞克隆，它們已將所述重組DNA整合入其基因組中。此類(lèi)型的顯性選擇標(biāo)記基因的例子是Tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，賦予抗遺傳霉素(geneticin) (G418)的抗性；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，賦予抗潮霉素的抗性；以及嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，賦予抗嘌呤霉素的抗性。編碼這種選擇標(biāo)記的重組表達(dá)載體可以駐留于與編碼預(yù)期蛋白質(zhì)之cDNA相同的同一載體上，或者它可編碼于同時(shí)引入并整合入宿主細(xì)胞基因組的分開(kāi)的載體上，在不同轉(zhuǎn)錄單元之間常常產(chǎn)生緊密的物理連鎖?？膳c預(yù)期蛋白質(zhì)之cDNA —起使用的其它類(lèi)型選擇標(biāo)記基因是基于編碼二氫葉酸還原酶(dhfr)的各種轉(zhuǎn)錄單元。將此類(lèi)基因引入缺少內(nèi)源dhfr-活性的細(xì)胞、優(yōu)選CHO-細(xì)胞(DUKX-Bll，DG-44)后，它使它們能在缺少核苷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所述培養(yǎng)基的例子是無(wú)次黃嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham's F12。這些dhfr-基因可與凝血因子cDNA轉(zhuǎn)錄單元一起引入以上類(lèi)型的CHO-細(xì)胞中，其或者連接于同一載體上或者位于不同載體上，由此建立產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的dhfr-陽(yáng)性細(xì)胞系。若在細(xì)胞毒性dhfr-抑制劑氨甲蝶呤存在下培養(yǎng)以上細(xì)胞系，則將形成抗氨甲蝶呤的新細(xì)胞系。由于被連接的dhfr和預(yù)期蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單元的擴(kuò)增數(shù)量，這些細(xì)胞系可以增長(zhǎng)速率產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。當(dāng)在濃度逐步增加的氨甲蝶呤(I-IOOOOnM)中增殖這些細(xì)胞系時(shí)，可獲得以很高速率產(chǎn)生預(yù)期蛋白質(zhì)的新細(xì)胞系。產(chǎn)生預(yù)期蛋白質(zhì)的以上細(xì)胞系可大規(guī)模培養(yǎng)于懸浮培養(yǎng)物中或各種固體支持物上。這些支持物的例子是基于葡聚糖或膠原蛋白基質(zhì)的微載體，或中空纖維形式或各種陶瓷材料的固相支持物。當(dāng)在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中或微載體上生長(zhǎng)時(shí)，可作為分批培養(yǎng)物或灌注培養(yǎng)物形式進(jìn)行以上細(xì)胞系的培養(yǎng)，在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)連續(xù)生產(chǎn)條件培養(yǎng)基。因此，依照本發(fā)明，以上細(xì)胞系很適合于開(kāi)發(fā)工業(yè)生產(chǎn)方法用于生產(chǎn)預(yù)期的重組蛋白質(zhì)。所述重組蛋白質(zhì)當(dāng)積聚于以上類(lèi)型的分泌細(xì)胞的培養(yǎng)基中時(shí)，可通過(guò)多種生化和層析方法進(jìn)行濃縮和純化，包括利用預(yù)期蛋白質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基中其它物質(zhì)之間在大小、電荷、疏水性、溶解性、特異親和力等方面差異的方法。所述純化的一個(gè)例子是使重組蛋白質(zhì)吸附在固定于固相支持物上的單克隆抗體上。吸附后，用基于以上特性的各種層析技術(shù)進(jìn)一步純化所述蛋白質(zhì)。優(yōu)選將本發(fā)明之修飾的生物學(xué)活性白蛋白融合凝血因子純化至大于或等于80 % 的純度，更優(yōu)選大于或等于95%的純度，尤其優(yōu)選的是相對(duì)于污染的大分子、尤其是其它蛋白質(zhì)和核酸而言大于99. 9%純的藥用純態(tài)，并且沒(méi)有感染劑和熱源劑。優(yōu)選的，本發(fā)明之分離或純化的改良生物學(xué)活性白蛋白融合凝血因子是基本上無(wú)其它多肽的，除非在準(zhǔn)備施用與其它治療蛋白質(zhì)之組合的時(shí)候。本發(fā)明中所述的白蛋白融合凝血因子可配制入藥物制劑中供治療用途。已純化的蛋白質(zhì)可溶于常規(guī)的生理上相容的水性緩沖液中，其中可任選的加入藥用賦形劑以得到藥物制劑。這樣的藥用載體和賦形劑以及合適的藥用劑型是本領(lǐng)域眾所周知的(參閱例如 “Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”， Frokjaer et al.，Taylor & Francis (2000)或"Handbook of Pharmaceutical excipients，，，3rd edition，Kibbe et al.，Pharmaceutical Press (2000))。特別是，包含本發(fā)明之多月太變體的藥物組合物可配制成凍干的或穩(wěn)定可溶的形式?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種程序?qū)⒍嚯淖凅w凍干。在使用之前通過(guò)加入一種或多種藥用可接受稀釋劑諸如注射用無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽溶液使凍干的制劑重新溶解。通過(guò)任何藥用合適的非靜脈內(nèi)施用方式將組合物制劑遞送給個(gè)體。有多種遞送系統(tǒng)是已知的并且可用于經(jīng)由任何方便途徑施加組合物。優(yōu)選配制本發(fā)明組合物用于皮下， 肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦內(nèi)，肺內(nèi)，鼻內(nèi)或經(jīng)皮膚給藥，最優(yōu)選依常規(guī)方法用于皮下的、肌肉內(nèi)或經(jīng)皮膚給藥。所述劑型可通過(guò)輸注或通過(guò)大劑量推注連續(xù)施加。某些劑型包括慢釋放系統(tǒng)。將本發(fā)明的白蛋白融合凝血因子以治療有效劑量施用于患者，意指足夠產(chǎn)生預(yù)期效果、阻止或減輕待治療疾病或指征之嚴(yán)重性或蔓延并且未到達(dá)產(chǎn)生無(wú)法忍受的不利副作用的劑量。確切劑量取決于許多因素，諸如指征、劑型、施用方式，并且必須在針對(duì)每一相應(yīng)指征的預(yù)臨床和臨床試驗(yàn)中確定。本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)施用或與其它治療制劑聯(lián)合施用。這些制劑可摻入作為同一藥物的一部分。圖注圖ι :300 μ g/kg rViIa-FP 禾口NovoSeven 后 FVII =Ag血漿濃度的時(shí)間進(jìn)程(匯集；η = 3/時(shí)間點(diǎn)；線(xiàn)性尺度)圖2 :300 μ g/kg rViIa-FP 禾口NovoSeven 后 FVII =Ag血漿濃度的時(shí)間進(jìn)程(匯集；η = 3/時(shí)間點(diǎn)；對(duì)數(shù)-線(xiàn)性尺度)圖3 610 μ g/kg Γ Χ-FP和Ber inin 后FIX =Ag血漿濃度的時(shí)間進(jìn)程(匯集；η =5/時(shí)間點(diǎn)；線(xiàn)性尺度)圖4 610 μ g/kg rix-FP和Ber inin 后fix =Ag血漿濃度的時(shí)間進(jìn)程(匯集；η =5/時(shí)間點(diǎn)；對(duì)數(shù)-線(xiàn)性尺度)
實(shí)施例實(shí)施例1 大鼠中皮下施加rVIIa-FP的生物利用度評(píng)估第一個(gè)實(shí)施例中概述的實(shí)驗(yàn)的目的是為了評(píng)估血管外注射是否可能是用 rVIIa-FP(人)進(jìn)行改良治療的一個(gè)選擇。作為血管外治療的典型代表而言選擇皮下注射。為了比較rVIIa-FP與參比制劑NovoSeven 的適合性，進(jìn)行表2中所詳細(xì)設(shè)計(jì)的非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。在對(duì)大鼠單次靜脈內(nèi)/皮下注射等摩爾劑量的rVIIa-FP(如WO 2007/090584中第30至31頁(yè)所述產(chǎn)生的pFVII-937)和NovoSeven 后測(cè)定血菜水平的時(shí)間進(jìn)程。對(duì)NovoSeven 而言劑量是300 μ g/kg。rVIIa-FP的劑量是基于根據(jù)OD測(cè)量值O80-320nm)所確定的蛋白質(zhì)濃度。在校正FP的白蛋白部分后，施加了 300 μ g(FVIIa) / kg的劑量。此時(shí)，兩種產(chǎn)品均以就治療有效組分FVIIa而言相同的劑量施加。選擇大鼠作為此研究的動(dòng)物物種，因?yàn)樗砹诉m于此類(lèi)型研究的特征清楚且頻繁使用的物種。大鼠 (CD品系)由Charles River (Sulzfeld, Germany)提供，在實(shí)驗(yàn)期間稱(chēng)重約200g。將大鼠保持在標(biāo)準(zhǔn)的住房條件下。經(jīng)短期麻醉，從眼窩后吸取血液樣品，用檸檬酸鈣抗凝得到10 至20%的檸檬酸鹽血液，加工成血漿并貯存于_20°C待測(cè)定FVII血漿水平。取樣時(shí)間點(diǎn)詳見(jiàn)表2。通過(guò)夾心ELISA，利用綿羊抗-FVII IgG (Cedarlane/Biozol)作為捕獲抗體，而POD綴合的綿羊-FVII IgG(Cedarlane/Biozol)作為探測(cè)抗體，測(cè)定人FVII的血漿濃度。用標(biāo)準(zhǔn)的人血漿作為參照。rVIIa-FP的發(fā)酵、純化和激活在其它地方有描述。靜脈內(nèi)注射rViia-FP產(chǎn)生的初始血漿水平相較于用相同劑量NovoSeven 處理而言高大約60% (表3，

圖1)。只針對(duì)用rVIIa-FP進(jìn)行皮下處理的組，在血漿中探測(cè)到FVII。注射后約8小時(shí)時(shí)觀察到峰濃度并且在處理后1至2天再次達(dá)到基線(xiàn)。對(duì)于用相同劑量NovoSeven 進(jìn)行皮下處理的組，盡管以與rVIIa-FP相同之FVIIa劑量注射 NovoSeven ,但在整個(gè)觀察期間血漿水平均保持在檢測(cè)極限之下(圖2)。表2:處理組
權(quán)利要求
1.一種藥物制劑，其中包含白蛋白融合凝血因子，用于在出血性紊亂的治療和預(yù)防性處理中進(jìn)行非靜脈內(nèi)施用。
2.權(quán)利要求1的藥物制劑，其中所述凝血因子選自因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X(jué)，因子X(jué)I，因子X(jué)II，因子X(jué)III，因子I，因子II (凝血酶原)， 蛋白C，蛋白S，GAS6或蛋白Z以及它們的活化形式。
3.權(quán)利要求1至2的藥物制劑，其中所述凝血因子選自因子IX，因子VII，因子VIII， von Willebrand因子以及它們的活化形式。
4.權(quán)利要求1至3的藥物制劑，其中所述凝血因子是因子VII或FVIIa。
5.權(quán)利要求1至4的藥物制劑，其中所述出血性紊亂選自下述組中家族性或獲得性A 型和B型血友病、所有類(lèi)型的創(chuàng)傷(鈍的或穿透性的，導(dǎo)致從單一器官、骨頭部分或從多發(fā)性損傷處嚴(yán)重出血)中的出血、外科手術(shù)時(shí)的出血(包括圍手術(shù)期或手術(shù)后的出血)、心臟手術(shù)導(dǎo)致的出血(包括經(jīng)歷體外循環(huán)的患者和小兒科心臟手術(shù)中的血液稀釋)、大腦內(nèi)的出血、蛛網(wǎng)膜下出血、硬腦膜下或硬腦膜上出血、由于血液丟失和血液稀釋造成的出血、通過(guò)非血漿容積取代導(dǎo)致受影響患者中凝血因子水平下降、由于彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和消耗性凝血病造成的出血、凝血細(xì)胞功能紊亂、損耗和凝血病，由于肝硬化、肝功能障礙和暴發(fā)性肝衰竭、肝病患者的肝活組織檢查造成的出血，肝臟和其它器官移植后的出血，來(lái)自胃靜脈曲張的出血和胃潰瘍出血、婦科出血例如功能失調(diào)性子宮出血(DUB)、胎盤(pán)的過(guò)早剝離、低出生體重孩子的室周出血、產(chǎn)后出血、新生兒的致命危急狀況的出血，與燒傷相關(guān)的出血，與淀粉樣變性病相關(guān)的出血，與血小板紊亂相關(guān)的造血干細(xì)胞移植，與惡性腫瘤相關(guān)的出血，與出血性病毒相關(guān)的感染，與胰腺炎相關(guān)的出血。
6.權(quán)利要求1至5的藥物制劑，其中所述非靜脈內(nèi)施用是皮下的、經(jīng)皮的或肌肉內(nèi)的施用。
7.權(quán)利要求1至6的藥物制劑，其中所述非靜脈內(nèi)施用是皮下施用。
8.權(quán)利要求1至7的藥物制劑，其中所述凝血因子經(jīng)由肽接頭與白蛋白連接。
9.權(quán)利要求8的藥物制劑，其中所述肽接頭是可蛋白水解性裂解的。
10.用于通過(guò)將凝血因子與白蛋白融合而提高凝血因子在非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收的方法。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述凝血因子選自因子IX，因子VII，因子VIII，von Willebrand因子，因子V，因子X(jué)，因子X(jué)I，因子X(jué)II，因子X(jué)III，因子I，因子II (凝血酶原)， 蛋白C，蛋白S，GAS6，或蛋白Z以及它們的活化形式。
12.權(quán)利要求10和11的方法，其中所述凝血因子選自因子IX，因子VII，因子VIII或 von Willebrand因子以及它們的活化形式。
13.權(quán)利要求10至12的方法，其中所述凝血因子是因子VII或因子Vila。
14.權(quán)利要求10至13的方法，其中所述凝血因子經(jīng)由肽接頭與白蛋白連接。
15.權(quán)利要求10至14的方法，其中所述肽接頭是可蛋白水解性裂解的。
16.權(quán)利要求10至15的方法，其中所述非靜脈內(nèi)施用是皮下的、經(jīng)皮的或肌肉內(nèi)的施用。
17.權(quán)利要求10至16的方法，其中所述非靜脈內(nèi)施用是皮下施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在出血性紊亂的治療和預(yù)防性處理中用于非靜脈內(nèi)施用的、包含白蛋白融合凝血因子的藥物制劑以及通過(guò)將凝血因子與白蛋白融合而提高其在非靜脈內(nèi)施用后的體內(nèi)回收的方法。
文檔編號(hào)C07K14/75GK102470182SQ201080036694
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者U·克龍塔勒爾 申請(qǐng)人:德國(guó)杰特貝林生物制品有限公司