專利名稱：帕曲星b的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種帕曲星B的分離方法。
背景技術(shù)：
1971年Tiberio Bruzzese等人從土壤樣品中分離得到一株鏈霉菌屬生金鏈霉菌 (Streptomyces aureofaciens)，并在該菌的代謝產(chǎn)物中分離出一種七烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，將其命名為帕曲星(partricin)。帕曲星是一種抗真菌和抗原蟲的高效藥，尤其對白色念珠菌具有極高的抑制活性，其抑菌作用是通過抑制真菌細胞膜的合成而實現(xiàn)的。帕曲星主要含有兩種成分，帕曲星A和帕曲星B。生金鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，除帕曲星外，還同時含有大量的四環(huán)素和金霉素等其他種類的抗生素及雜質(zhì)，成分十分復(fù)雜，因此從發(fā)酵產(chǎn)物中提取帕曲星B的工藝繁瑣。目前，現(xiàn)有技術(shù)中對帕曲星B的分離純化主要還是采用傳統(tǒng)的有機溶劑萃取和活性炭吸附等方法。美國專利3，773，925公開了帕曲星B的分離純化過程，該過程利用帕曲星B在不同溶劑中溶解度的差異，多步反復(fù)萃取后，再利用活性炭吸附進行富集純化。該方法的不利之處在于使用了大量溶劑，對環(huán)境造成了很大的壓力，而且該方法不可避免的需要使用活性炭，而活性炭的吸附性能并不穩(wěn)定，即使同一個生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品，生產(chǎn)批次不同，吸附性能也會有差異，從而造成最終產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有分離帕曲星B的方法使用大量溶劑對環(huán)境造成很大的壓力，步驟中不可避免的需要采用活性炭，而活性炭的吸附性能不穩(wěn)定會造成最終產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定的缺陷，提供了一種操作簡單，成本較低，不會產(chǎn)生過多溶劑造成環(huán)境壓力，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的帕曲星B的分離方法。本發(fā)明的帕曲星B的分離方法包括如下步驟(1)將含帕曲星的發(fā)酵液調(diào)pH至3 5，靜置并過濾，將濾餅用極性有機溶劑浸泡，之后過濾取濾液；(2)將濾液調(diào)pH至9 10，之后于25°C 35°C下濃縮至溶液含水體積百分比 30% 35%，靜置，過濾得帕曲星粗品；(3)將帕曲星粗品溶于含水體積百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上樣至苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱，先用含水體積百分比18% 23%的甲醇溶液洗脫除雜，再用含水體積百分比13% 17%的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集HPLC純度彡85%的帕曲星B洗脫液；(4)將收集的帕曲星B洗脫液濃縮至含水體積百分比40% 50%，靜置，過濾得帕曲星B，即可。下面，進一步對本發(fā)明的帕曲星B的分離方法進行詳細介紹
(1)將含帕曲星的發(fā)酵液調(diào)pH至3 5，靜置并過濾，將濾餅用極性有機溶劑浸泡，之后過濾取濾液。其中，所述的含帕曲星的發(fā)酵液為本領(lǐng)域常規(guī)制備帕曲星的微生物菌發(fā)酵液，一般由生金鏈霉菌Mi^ptomyces aureofaciens經(jīng)過本領(lǐng)域常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)獲得。所述的生金鏈霉菌具體菌種沒有特殊限定，常規(guī)能夠生產(chǎn)帕曲星的菌種均可使用，如生金鏈霉菌 Streptomyces aureofaciens NRRL 3878。其中，所述的生金鏈霉菌經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵獲得含帕曲星發(fā)酵液具體菌種不受限定是因為帕曲星是生金鏈霉菌Mi^ptomyces aureofaciens的次級代謝產(chǎn)物，不同的具體菌株雖然在帕曲星的產(chǎn)量、雜質(zhì)的比例上有所不同，但發(fā)酵液的主要成分相對固定，因此不同具體菌種生金鏈霉菌Sti^ptomyces aureofaciens制備的發(fā)酵液均適用本發(fā)明方法。其中，所述的調(diào)pH的試劑為本領(lǐng)域常規(guī)用于調(diào)pH的酸，較佳的為草酸和/或鹽酸，更佳的為草酸。其中，所述的靜置的作用為充分除去發(fā)酵液中的活菌，所述的靜置的時間較佳的為> 2小時，更佳的為2 4小時。其中，所述的極性有機溶劑為本領(lǐng)域常規(guī)所述極性有機溶劑，較佳的為甲醇、乙醇和丙酮中的一種或多種，更佳的為甲醇。其中，所述的極性有機溶劑的用量較佳的為2 4倍濾餅體積。其中，所述的浸泡的作用是充分提取濾餅中的帕曲星。所述的浸泡的時間較佳的為> 2小時，更佳的為2 4小時。其中，所述的浸泡以及過濾操作較佳地還可以重復(fù)操作1 2次，之后合并濾液。(2)將濾液調(diào)pH至9 10，之后于25°C 35°C下濃縮至溶液含水體積百分比 30% ；35%，靜置，過濾得帕曲星粗品。其中，所述的調(diào)pH的試劑為本領(lǐng)域常規(guī)用于調(diào)pH的堿，較佳的為氫氧化鈉和/或
氫氧化鉀。其中，由于步驟(1)中的濾餅含水，導(dǎo)致步驟O)中的濾液中含水量也較大，因而需要進一步濃縮。所述的濃縮的溫度較佳的為30°C。所述的濃縮的終點較佳的為濾液中含水體積百分比33%。其中，所述的靜置作用為使帕曲星充分析出。所述的靜置的溫度較佳的為0°C 5°C，更佳的為4°C。所述的靜置的時間較佳的為> M小時，更佳的為M小時。(3)將帕曲星粗品溶于含水體積百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上樣至苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱，先用含水體積百分比18% 23%的甲醇溶液洗脫除雜，然后再用含水體積百分比13% 17%的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度彡85% (HPLC純度)的帕曲星B洗脫液。其中，所述的溶解帕曲星粗品的甲醇溶液的濃度較佳的為含水體積百分比25%的甲醇溶液。其中，所述的帕曲星粗品的質(zhì)量與甲醇溶液的用量比較佳的為7mg/mL 9mg/mL， 更佳的為8mg/mL。其中，所述的苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱的型號較佳的為匪100、HZ-803或微球 1#。
其中，所述的帕曲星粗品的上樣量較佳的為彡lOmg/mL樹脂。其中，所述的帕曲星粗品的上樣至苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱的吸附流速較佳的為0. 2CV/h 0. 3CV/h，其中所述的CV為本領(lǐng)域常規(guī)計量術(shù)語，全稱為樹脂柱體積，英文名 column volume。其中，所述的洗脫除雜的甲醇溶液的濃度較佳的為含水體積百分比20 %的甲醇溶液。其中，所述的洗脫除雜的甲醇溶液的用量較佳的為2. 5CV 4CV，更佳的為3CV。其中，所述的洗脫帕曲星B的甲醇溶液的濃度較佳的為含水體積百分比15%的甲醇溶液。其中，所述的純度> 85%的帕曲星B洗脫液的檢測可按本領(lǐng)域常規(guī)通過高效液相色譜檢測確定。所述的高效液相色譜檢測可按本領(lǐng)域常規(guī)方法。(4)將收集的帕曲星B洗脫液濃縮至含水體積百分比40% -50%，靜置，過濾得帕曲星B，即可。其中，所述的濃縮的溫度較佳的為20°C 25°C，更佳的為22°C。其中，所述的靜置的溫度較佳的為0 °C 5 °C，更佳的為4°C。其中，所述的靜置的時間較佳的為> 48小時，更佳的為48小時。本發(fā)明中，所述的步驟⑷收集的帕曲星B進一步干燥，即獲得干燥成品。本發(fā)明中，涉及使用的甲醇溶液均可回收利用。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，本發(fā)明中上述的各技術(shù)特征優(yōu)選可以任意組合得到本發(fā)明較佳實例。本發(fā)明的積極進步效果在于本發(fā)明帕曲星B的分離方法操作簡單，成本較低，不會產(chǎn)生過多溶劑造成環(huán)境壓力，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，分離得到的產(chǎn)品的帕曲星B純度達95%以上。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下述實施例中，檢測帕曲星B的高效液相色譜檢測條件為色譜柱Agilent C18 5um 250X4. 6mm;流動相為體積比為40 60的乙腈和醋酸銨水溶液(0. 05mol/L，pH 5.5) 的混合溶液；溫度35°C ；流速0. 8mL/min ；檢測波長378nm。下述實施例中，苯乙烯大孔反相吸附樹脂來源為匪100 蘇州納微科技有限公司HZ803 上海華震樹脂公司微球1# 上海華震樹脂公司下述實施例中的百分比，除特殊說明外，均為體積百分比。制備實施例制備帕曲星發(fā)酵液，使用的菌種為生金鏈霉菌Str印tomyces aureofaciens NRRL 3878 (來源美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心)。CN 102453063 A說明書4/8 頁具體發(fā)酵培養(yǎng)條件為1、斜面培養(yǎng)培養(yǎng)7天；培養(yǎng)基(g/L)可溶性淀粉10. 0，MgSO4 · 7H20 1. 0，NaCl 1.0，(MM)2SO4 2.0， FeSO4 · 7H20 0. 001, KzHPO4 1· 0，CaCO3 2. 0，MnCl2 · 7Η20 0· 001。2、種子培養(yǎng) ，28h,搖床轉(zhuǎn)速240rpm ；培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10. 0、蛋白胨10. 0、酵母粉5. 0。3、發(fā)酵培養(yǎng)121°C滅菌20min，接種量10%，搖瓶裝量100mL/750mL，置于恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床MOrpm搖發(fā)酵7天得到最終發(fā)酵液；培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖40. 0、工業(yè)淀粉20. 0、冷黃豆粉20. 0、蠶蛹粉10. 0、酵母粉 2. 0、蛋白胨 2. 0、NaCl 5.0。實施例1將發(fā)酵得到的含帕曲星B 681 μ g/mL的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置池后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。 將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于冰箱4°C靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92.8%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至少含水體積百分比40%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi))，48h后，過濾得到純度為96. 4%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例2將發(fā)酵得到的含帕曲星B 645yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置池后抽濾，將濾餅用2倍體積的丙酮浸泡池，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 2%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比50%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi))，4他后，過濾得到純度為96. 的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例3將發(fā)酵得到的含帕曲星B 697yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置池后抽濾，將濾餅用2倍體積的無水乙醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85%的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92.4%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi)(4°C )，48h后，過濾得到純度為96. 3%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例4將發(fā)酵得到的含帕曲星B 632yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水30%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 5%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi)(4°C )，48h后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例5將發(fā)酵得到的含帕曲星B 623 μ g/mL的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水35%，此時有一定量的固體析出，然后置于冰箱4°C靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 2%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi)(4°C )，48h后，過濾得到純度為96. 0%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例6將發(fā)酵得到的含帕曲星B 638 μ g/mL的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。 將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于冰箱4°C靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過大孔反相吸附樹脂HZ-803，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15%水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85%的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92.3%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi)(4°C )，48h后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例7將發(fā)酵得到的含帕曲星B 647 μ g/mL的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于冰箱4°C靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過大孔反相吸附樹脂微球1#，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15%水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85%的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92.4%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%，靜置于冰箱冷藏室內(nèi))，4他后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B的針狀結(jié)晶。實施例8將發(fā)酵制得的含帕曲星B 668yg/ml的帕曲星發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 5，靜置池后抽濾，將濾餅用3倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 2，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 3%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，4 后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例9將發(fā)酵制得的含帕曲星B 712yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 5，靜置池后抽濾，將濾餅用3倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 2，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 7%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，4 后，過濾得到純度為96. 5%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例10將發(fā)酵得到的含帕曲星B 657yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置池后抽濾，將濾餅用2. 5倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 8，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含27%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 3%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，48h后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例11將發(fā)酵得到的含帕曲星B 616yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到4. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2. 5倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)PH到9. 8，在30°C下緩慢濃縮至含水33 %，此時有一定量的固體析出， 然后置于4°C冰箱靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含30% 水的甲醇溶液溶解，并將出現(xiàn)的少量沉淀過濾掉，濾液通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含 20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15%水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85% 的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 1 %。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，48h后，過濾得到純度為96. 0%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例12將發(fā)酵得到的含帕曲星B 673yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到5. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 4，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含13 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 5%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，48h后，過濾得到純度為96. 3%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例13將發(fā)酵得到的含帕曲星B 664yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到5. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)pH到9. 4，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置24h，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含17 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92.0%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，48h后，過濾得到純度為96. 1 %的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例14將發(fā)酵得到的含帕曲星B 651yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置2h后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡2h，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操CN 102453063 A說明書8/8 頁
作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)PH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 7%。將帕曲星B收集液在25°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，4 后，過濾得到純度為96. 2%的帕曲星B針狀結(jié)晶。實施例15將發(fā)酵得到的含帕曲星B 678yg/ml的發(fā)酵液用草酸調(diào)pH到3. 0，靜置池后抽濾，將濾餅用2倍體積的甲醇浸泡池，浸泡后過濾取濾液，并將濾餅重復(fù)前述浸泡、過濾操作一次，合并兩次濾液。將濾液調(diào)PH到9. 0，在30°C下緩慢濃縮至含水33%，此時有一定量的固體析出，然后置于4°C冰箱靜置Mh，使帕曲星從母液中充分析出，將析出物抽濾收集后，用含25%水的甲醇溶液溶解，并通過匪100樹脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液預(yù)洗除雜，再用含15 %水的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集純度大于85 %的帕曲星B (HPLC檢測)，混合后純度為92. 5%。將帕曲星B收集液在22°C下緩慢濃縮至含水體積百分比45%后，置于4°C冰箱靜置，4 后，過濾得到純度為96. 0%的帕曲星B針狀結(jié)晶。
權(quán)利要求
1.一種帕曲星B的分離方法，其特征在于其包括如下步驟(1)將含帕曲星的發(fā)酵液調(diào)PH至3 5，靜置并過濾，將濾餅用極性有機溶劑浸泡，之后過濾取濾液；(2)將濾液調(diào)pH至9 10，之后于25°C 35°C下濃縮至溶液含水體積百分比30% 35%，靜置，過濾得帕曲星粗品；(3)將帕曲星粗品溶于含水體積百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上樣至苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱，先用含水體積百分比18% 23%的甲醇溶液洗脫除雜，再用含水體積百分比13% 17%的甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集HPLC純度彡85%的帕曲星B洗脫液；(4)將收集的帕曲星B洗脫液濃縮至含水體積百分比40% 50%，靜置，過濾得帕曲星 B即可。
2.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于所述的含帕曲星的發(fā)酵液由生金鏈霉菌Sti^ptomyces aureofaciens經(jīng)過本領(lǐng)域常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的分離方法，其特征在于所述的生金鏈霉菌為生金鏈霉菌 Streptomyces aureofaciens NRRL 3878。
4.如權(quán)利要求1 3任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述的調(diào) PH試劑為草酸和/或鹽酸；和/或所述的靜置的時間為> 2小時，較佳的為2 4小時。
5.如權(quán)利要求1 4任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述的極性有機溶劑為甲醇、乙醇和丙酮中的一種或多種；和/或所述的極性有機溶劑的用量為2 4倍濾餅體積；和/或所述的浸泡的時間為> 2小時，較佳的為2 4小時；和/或所述的浸泡以及過濾操作還重復(fù)操作1 2次，之后合并濾液。
6.如權(quán)利要求1 5任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟O)中，所述的調(diào) PH試劑為氫氧化鈉和/或氫氧化鉀；和/或所述的濃縮的溫度為30°C ；和/或所述的濃縮的終點為濾液中含水的體積百分比為33% ；和/或所述的靜置的溫度為0°C 5°C，較佳的為4°C ；和/或所述的靜置的時間為> 24小時，較佳的為M小時。
7.如權(quán)利要求1 6任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述的溶解帕曲星粗品的甲醇溶液的濃度為含水體積百分比25%的甲醇溶液；和/或所述的帕曲星粗品與甲醇溶液的用量比為7mg/mL 9mg/mL，較佳的為8mg/mL ；和/或所述的苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱的型號為匪100、HZ-803或微球1# ；和/或所述的帕曲星粗品的上樣量為 (lOmg/mL樹脂；和/或所述的帕曲星粗品的上樣至苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱的吸附流速為 0. 2CV/h 0. 3CV/h0
8.如權(quán)利要求1 7任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述的洗脫除雜的甲醇溶液的濃度為含水體積百分比20%的甲醇溶液；和/或所述的洗脫除雜的甲醇溶液的用量為2. 5CV 4CV，較佳的為3CV ；和/或所述的洗脫帕曲星B的甲醇溶液的濃度為含水體積百分比15%的甲醇溶液；和/或所述的純度> 80%的帕曲星B洗脫液的檢測通過高效液相色譜檢測確定。
9.如權(quán)利要求1 8任一項所述的分離方法，其特征在于所述步驟(4)中，所述的濃縮的溫度為20°C 25°C，較佳的為22°C ；和/或所述的靜置的溫度為0°C 5°C，較佳的為 40C ；和/或所述的靜置的時間為彡48小時，較佳的為48小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了帕曲星B的分離方法，包括如下步驟將含帕曲星的發(fā)酵液調(diào)pH，靜置并過濾，將濾餅用極性有機溶劑浸泡，過濾取濾液；將濾液調(diào)pH，25℃～35℃下濃縮至含水30％～35％，靜置、過濾得帕曲星粗品；將該粗品溶于含水25％～30％的甲醇溶液，上苯乙烯大孔反相吸附樹脂柱，用含水18％～23％的甲醇溶液洗脫除雜，再用含水13％～17％甲醇溶液洗脫帕曲星B，收集HPLC純度≥85％的帕曲星B洗脫液；將收集的帕曲星B洗脫液濃縮至含水40％～50％，靜置，過濾得帕曲星B即可；百分比為體積百分比。該方法操作簡單，成本較低，溶劑少，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，分離得到的產(chǎn)品的帕曲星B純度達95％以上。
文檔編號C07H1/06GK102453063SQ20101051433
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者劉海英, 盧亮, 李繼安 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院