專利名稱：一種應用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應用PH-區(qū)帶精制逆流色譜從元胡粗提物中分離高純度去氫紫堇堿 的方法。
背景技術(shù)：
元胡為罌粟科(Popaveraceae)植物延胡索的干燥塊莖，是浙八味中的一種。在 傳統(tǒng)中國醫(yī)藥中，延胡索被認為可活血，行氣和減輕所有類型的疼痛。元胡的主要活性成分 為生物堿，去氫紫堇堿為元胡季銨堿中的一種，現(xiàn)代藥理研究表明，去氫紫堇堿可以提高小 鼠的耐缺氧能力，改善微循環(huán)，治療心肌缺血，另有研究表明，去氫紫堇堿還可用于治療潰 瘍和冠心病。目前，去氫紫堇堿的分離主要有柱層析(張曉麗，曲揚，侯家鳴，等.延胡索的化 學成分[J]，沈陽藥科大學學報，2008，25(7) :537-540)，但分離效率低且有死吸附；也有 用制備型高效液相色譜進行分離(楊杰，白雪，肖海濤，等.延胡索中去氫紫堇堿對照品的 制備及含量測定[J]，時珍國醫(yī)國藥，2009，20 (4) :1000-1002)，但上樣量小且有死吸附；另 外還有應用標準高速逆流色譜進行分離(S. Q. Tong, J. Z, Yan, J. Z, Lou. J. Liq. Chromatogr. & Related Tech. 2005, 28 (18): 2979-2989)，但上樣量太小。pH_ 區(qū)帶精 制逆流色譜(pH-zone-refining counter-current chromatography)是在標準高速逆流色 譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特殊逆流色譜分離制備技術(shù)，與標準高速逆流色譜相比，其突出的特 點是在固定相中加入了保留酸(或堿)，在流動相中加入了洗脫堿(或酸)，樣品中各組分依 據(jù)其酸堿性及疏水性的不同而實現(xiàn)分離，目標組分以矩形峰被洗脫出來，而雜質(zhì)則被富集 在矩形峰邊緣，并且不同組分被洗脫出來伴隨著PH值的變化。pH-區(qū)帶精制逆流色譜繼承 了標準高速逆流色譜高效，對固定相無污染，樣品回收率高等優(yōu)點，同時具有分離容量大、 組分被高度濃縮等優(yōu)點。目前，PH-區(qū)帶精制逆流色譜已廣泛的用于生物堿、肽類及其衍生 物、異構(gòu)體等的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法，該 方法工藝簡單，分離效率高。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種應用PH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法，所述的方法包括以下步驟
(1)在分液漏斗中分別加入氯仿、甲醇、水以體積比為1.5 3:1 1. 5:1組成的溶劑 體系，充分振搖后靜置分層，取上相加入終濃度為10 20mM (優(yōu)選IOmM)的無機酸作為固 定相，下相加入終濃度為10 20mM (優(yōu)選IOmM)的堿作為流動相；
(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量為25 60ml/g元胡的乙 醇粗提物，溶解后制得樣品溶液；
(3)取固定相注滿逆流色譜儀的分離柱，隨后注入樣品溶液，待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，在750 850r/min轉(zhuǎn)速下，以1. 5 2. 5ml/min的流速持續(xù)注入流 動相，以波長190 400nm的紫外檢測器檢測，用自動部分收集器收集洗脫液，薄層層析跟 蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集；
(4)將步驟(3)中收集得到的洗脫液通過薄層層析和高效液相進行檢測，合并與去氫紫 堇堿標準品Rf值及保留時間相同且去氫紫堇堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收 溶劑，得到去氫紫堇堿。所述步驟(3)中，所述樣品溶液的進樣的體積通常小于分離柱柱體積的30%。所述步驟(2)中，元胡的乙醇粗提物還可以用固定相和未堿化的下相溶解，所述的 方法包括以下步驟
(1)在分液漏斗中分別加入氯仿、甲醇、水以體積比為1.5 3:1 1. 5:1組成的溶劑 體系，充分振搖后靜置分層，取上相加入終濃度為10 20mM的無機酸作為固定相，下相加 入終濃度為10 20mM的堿作為流動相；
(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相和未堿化的下相溶解，所述的固定相加入量為25 60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未堿化的下相加入量為0 50ml/g元胡的乙醇粗提物， 溶解后制得樣品溶液；0是指未堿化的下相的加入量無限接近于0但不為0 ；
(3)取固定相注滿逆流色譜儀的分離柱，隨后注入樣品溶液，待進樣完成后，開啟速度 控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，在750 850r/min轉(zhuǎn)速下，以1. 5 2. 5ml/min的流速持續(xù)注入流 動相，以波長190 400nm的紫外檢測器檢測，用自動部分收集器收集洗脫液，薄層層析跟 蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集；
(4)將步驟(3)中收集得到的洗脫液通過薄層層析和高效液相進行檢測，合并與去氫紫 堇堿標準品Rf值及保留時間相同且去氫紫堇堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收 溶劑，得到去氫紫堇堿。所述的元胡的乙醇粗提物按如下方法制得取元胡藥材粉碎，用60 98%乙醇回 流提取1 5次，合并各次的提取液，抽濾后濾液減壓濃縮至浸膏狀，用酸溶液捏溶至捏溶 液PH值為2 3，靜置10 30小時，取上清液過濾除去沉淀；濾液用氯仿萃取1 5次，收 集合并氯仿層，合并的氯仿層用質(zhì)量濃度為1 3%氫氧化鈉溶液萃取，取氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物。所述的酸溶液為質(zhì)量濃度為1 2%的鹽酸水溶液或1 2%的硫酸水溶液。所述乙醇的體積用量通常以元胡藥材的質(zhì)量計為10 20L/kg。本發(fā)明所述步驟(1)中所述的溶劑體系中氯仿、甲醇和水的體積比優(yōu)選為2:1:1。本發(fā)明所述步驟(1)中，所述的無機酸優(yōu)選為鹽酸或硫酸，最優(yōu)選鹽酸。所述步驟(1)中，所述的堿優(yōu)選為三乙胺或二乙胺，最優(yōu)選為三乙胺。所述步驟(3)中，所述注入樣品溶液可以通過進樣圈注入樣品溶液或通過泵泵入 樣品溶液。所述步驟(4)中，所述的高效液相色譜的檢測條件為YMC ODS C18 column (4. 6X 250讓，5 μ m)；柱溫30°C ；流動相乙腈_0. 03mol/L磷酸二氫鈉水溶液(32:68，ν/ ν)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；檢測波長:345nm ；進樣量:20μ 1。所述步驟(3)和(4)中，所述薄層層析的展開劑為氯仿、甲醇以體積比8:1混合的 溶劑。本發(fā)明實施例中采用半制備型逆流色譜儀(分離柱的柱體積為250ml)，逆流色譜儀由恒流泵、主機(分離柱)、紫外檢測器、記錄儀等組成。所述步驟(3)中，所述轉(zhuǎn)速優(yōu)選810r/min，流動相流速優(yōu)選為2ml/min。本發(fā)明的有益效果在于通過pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿，工藝簡單， 回收率高，分離得到的去氫紫堇堿純度高，對元胡藥材的充分利用有重要作用。
具體實施例方式下面以具體實施例來對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
實施例1
取元胡藥材1500g粉碎后用22. 5L的70%乙醇回流提取30分鐘，按同樣方法提取 3次，合并3次的提取液，抽濾后濾液減壓濃縮至浸膏狀，用2%鹽酸溶液捏溶至捏溶液pH值 為3，靜置15h，抽濾，濾液用4X400mL氯仿萃取，合并氯仿層并用2%氫氧化鈉溶液萃取，取 氯仿層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿，得元胡粗提物10. 440g。將氯仿、甲醇和水按照體積比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上 相加入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為 IOmM作為流動相；稱取元胡粗提物208mg，用8ml固定相和8ml未堿化的下相溶解，得到樣 品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。首 先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離柱， 待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為810r/min，設(shè)置流動相的流速 為2ml/min，開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色譜 圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿甲 醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到22mg去氫紫堇堿，純度為98%，回收 率為87%。高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例2
取元胡藥材2800g粉碎后用42L的80%乙醇回流提取60分鐘，按同樣方法提取3次， 合并3次的提取液，抽濾后減壓濃縮至浸膏狀，用2%鹽酸溶液捏溶至捏溶液pH值為3，靜置 20h,抽濾，濾液用4X SOOmL氯仿萃取，合并氯仿層并用2%氫氧化鈉溶液萃取，取氯仿層，用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿，得元胡粗提物17. lg。將氯仿、甲醇和水按照體積比1.5:1. 5:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分 層，上相加入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃 度為IOmM作為流動相；稱取元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未堿化的下相溶解，得到樣品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。首 先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離柱， 待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為800r/min，設(shè)置流動相的流速 為2ml/min，開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色譜 圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿甲 醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到1 Img去氫紫堇堿，純度為97. 4%，回 收率為58. 1%。高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例3
將氯仿、甲醇和水按照體積比3:1. 5:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上 相加入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為 IOmM作為流動相；稱取實施例2中提取得到的元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未堿 化的下相溶解，得到樣品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。首 先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離柱， 待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為810r/min，設(shè)置流動相的流速 為2ml/min，開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色譜 圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿甲 醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到15mg去氫紫堇堿，純度為98. 1%，回 收率為79. 8%ο高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例4
將氯仿、甲醇和水按照體積比3:1:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上相加 入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為IOmM 作為流動相；稱取實施例2中提取得到的元胡粗提物222mg，用8ml固定相和8ml未堿化的 下相溶解，得到樣品溶液。
采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。 首先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離 柱，待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為810r/min，設(shè)置流動相的流 速為2ml/min，開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色 譜圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿 甲醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到15mg去氫紫堇堿，純度為99. 3%，回 收率為74. 6%ο高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例5
將氯仿、甲醇和水按照體積比1.5:1:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上 相加入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為 IOmM作為流動相；稱取實施例2中提取得到的元胡粗提物205mg，用8ml固定相和8ml未堿 化的下相溶解，得到樣品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。 首先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離 柱，待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為810r/min，設(shè)置流動相的流 速為2ml/min，開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色 譜圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿 甲醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到12mg去氫紫堇堿，純度為99. 5%，回 收率為64. 8%ο高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例6
將氯仿、甲醇和水按照體積比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上相加 入鹽酸，使鹽酸的終濃度為20mM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為20mM 作為流動相；稱取實施例2中提取得到的元胡粗提物222mg，用13. 3ml固定相溶解，得到樣 品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。首
8先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過泵注入分離柱，待 進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為850r/min，設(shè)置流動相的流速為 2. 5ml/min,開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色譜 圖并用自動部分收集器按4分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿甲 醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到18mg去氫紫堇堿，純度為94. 4%，回 收率為85. 1%。高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。 實施例7
將氯仿、甲醇和水按照體積比2:1:1配置于分液漏斗中，充分振搖后靜置分層，上相加 入鹽酸，使鹽酸的終濃度為IOmM作為固定相，下相加入三乙胺，使三乙胺的終濃度為IOmM 作為流動相；稱取實施例2中提取得到的元胡粗提物200mg，用5ml固定相和IOml未堿化 的下相溶解，得到樣品溶液。采用半制備型逆流色譜儀對元胡粗提物進行分離，分離柱的柱體積為250ml。首 先將固定相以30ml/min的流速注滿分離柱，然后將上述樣品溶液通過進樣圈注入分離柱， 待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為750r/min，設(shè)置流動相的流速 為1. 5ml/min,開始泵入流動相，以波長254nm的紫外檢測器檢測，通過色譜工作站記錄色 譜圖并用自動部分收集器按5分鐘/試管的速度接收洗脫液，用薄層層析(展開劑為氯仿 甲醇=8:1，ν/ν)跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集。收集得到的洗脫液通過薄層層析(展開劑為氯仿甲醇=8:1，ν/ν)和高效液相進 行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值(&= 0. 5)及保留時間(20. 4min)相同且去氫紫堇 堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到16mg去氫紫堇堿，純度為95. 3%，回 收率為84. 8%ο高效液相條件=YMC ODS C18柱(4. 6 X 250mm)；流動相乙腈-0. 03mol/L磷酸二 氫鈉(32:68，v/v)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；柱溫:30°C ；檢測波長345nm;進樣量 20 μ 1。
權(quán)利要求
一種應用pH 區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟(1)在分液漏斗中分別加入氯仿、甲醇、水以體積比為1.5～3:1～1.5:1組成的溶劑體系，充分振搖后靜置分層，取上相加入終濃度為10～20mM的無機酸作為固定相，下相加入終濃度為10～20mM的堿作為流動相；(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相溶解，所述的固定相加入量為25～60ml/g元胡的乙醇粗提物，溶解后制成樣品溶液；(3)取固定相注滿逆流色譜儀的分離柱，隨后注入樣品溶液，待進樣完成后，開啟速度控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，在750～850r/min轉(zhuǎn)速下，以1.5～2.5ml/min的流速持續(xù)注入流動相，以波長190～400nm的紫外檢測器檢測，用自動部分收集器收集洗脫液，薄層層析跟蹤檢測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集；(4)將步驟(3)中收集得到的洗脫液通過薄層層析和高效液相進行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值及保留時間相同且去氫紫堇堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到去氫紫堇堿。
2.如權(quán)利要求1所述的應用PH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法，其特征在 于所述的方法包括以下步驟(1)在分液漏斗中分別加入氯仿、甲醇、水以體積比為1.5 3:1 1. 5:1組成的溶劑 體系，充分振搖后靜置分層，取上相加入終濃度為10 20mM的無機酸作為固定相，下相加 入終濃度為10 20mM的堿作為流動相；(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相和未堿化的下相溶解，所述的固定相加入量為25 60ml/g元胡的乙醇粗提物，所述的未堿化的下相加入量為0 50ml/g元胡的乙醇粗提物， 溶解后制成樣品溶液；(3)取固定相注滿逆流色譜儀的分離柱，隨后注入樣品溶液，待進樣完成后，開啟速度 控制器，使分離柱正轉(zhuǎn)，在750 850r/min轉(zhuǎn)速下，以1. 5 2. 5ml/min的流速持續(xù)注入流 動相，以波長190 400nm的紫外檢測器檢測，用自動部分收集器收集洗脫液，TLC跟蹤檢 測至洗脫液中無去氫紫堇堿組分，停止收集；(4)將步驟(3)中收集得到的洗脫液通過薄層層析和高效液相進行檢測，合并與去氫紫 堇堿標準品Rf值及保留時間相同且去氫紫堇堿純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收 溶劑，得到去氫紫堇堿。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的元胡的乙醇粗提物按如下方法制 得取元胡藥材粉碎，用60 98%乙醇回流提取1 5次，合并各次的提取液，抽濾后濾液 減壓濃縮至浸膏狀，用酸溶液捏溶至捏溶液的PH值為2 3，靜置1(Γ30小時，取上清液過 濾除去沉淀；濾液用氯仿萃取廣5次，收集合并氯仿層，合并的氯仿層用質(zhì)量濃度為1 3% 氫氧化鈉溶液萃取，取氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿，得元胡的乙醇粗提物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的酸溶液為質(zhì)量濃度為1 2%的鹽酸水 溶液或1 2%的硫酸水溶液。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述樣品溶液的進樣的 體積小于分離柱柱體積的30%。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的溶劑體系中氯仿、甲醇和水的體積比為2:1:1。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述的無機酸為鹽酸。
8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述的堿為三乙胺。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述注入樣品溶液可以 通過進樣圈注入樣品溶液或通過泵泵入樣品溶液。
10.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(4)所述的高效液相色譜的檢測 條件為YMC ODS C18 column (4. 6 X 250mm，5 μ m)；柱溫30°C ；流動相乙腈 _0. 03mol/L 磷酸二氫鈉水溶液(32:68，ν/ν)，等度洗脫；流速0. 6ml/min ；檢測波長345nm ；進樣量 20 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離去氫紫堇堿的方法(1)氯仿、甲醇、水充分振搖后靜置分層，取上相加入終濃度為10～20mM的無機酸作為固定相，下相加入終濃度為10～20mM的堿作為流動相；(2)取元胡的乙醇粗提物用固定相或者固定相和未堿化下相的混合溶液溶解制成樣品溶液；(3)取固定相注滿逆流色譜儀的分離柱，注入樣品溶液，使分離柱正轉(zhuǎn)，在750～850r/min轉(zhuǎn)速下，以1.5～2.5ml/min的流速持續(xù)注入流動相，收集洗脫液，薄層層析和高效液相進行檢測，合并與去氫紫堇堿標準品Rf值及保留時間相同且純度大于90%的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到去氫紫堇堿。本發(fā)明工藝簡單，回收率高，分離得到的去氫紫堇堿純度高，對元胡藥材的充分利用有重要作用。
文檔編號C07D455/03GK101973990SQ20101051263
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者于青, 李亞琴, 童勝強, 顏繼忠 申請人:浙江工業(yè)大學