專利名稱：一種具有殺菌防腐功能的小肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
一種具有殺菌防腐功能的小肽及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬源性具有殺菌活性的小肽。本發(fā)明還涉及這 種小肽的制備方法及其在飼料防腐中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用對保護(hù)人類和動物的健康作出了巨大的貢獻(xiàn)。但是近年來， 隨著抗生素的大量應(yīng)用，導(dǎo)致了耐藥菌株的產(chǎn)生，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)禾口綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosaMigula)幾乎對所有抗生素都 有抗性，已成為臨床上一個嚴(yán)重的問題?？股刈鳛椴【种苿┖涂咕L劑添加到飼料 和食品中由來已久。20世紀(jì)50年代開始，隨著抗生素的廣泛使用和人們對食品質(zhì)量和環(huán)境 質(zhì)量的要求不斷提高，抗生素的副作用也就日益表現(xiàn)出來，抗生素作為食品添加劑和防腐 劑面臨著被淘汰的局面。研究發(fā)現(xiàn)動物抗菌肽具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的潛力，是近幾年開發(fā) 的一類新型飼料添加劑，(劉毅和寧正祥，1999 ；邱芳萍等，2002 ；溫劉發(fā)和何建國，2003)， 其優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在抑制微生物的生長非常迅速；抗菌譜廣，不僅對植物病原菌有強(qiáng)抑制 作用，而且對畜禽和水產(chǎn)動物的病原菌也有很強(qiáng)的抑制作用(金豐良等，2005 Jin et al., 2006,2007)；迄今為止，在動物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已達(dá)200多種(Boman et al. ,2003) 目前，國內(nèi)作為添加劑生產(chǎn)應(yīng)用的主要是蠶抗菌肽AD-酵母制劑，大多數(shù)的畜禽 試驗(yàn)也是圍繞這種抗菌肽進(jìn)行的。溫劉發(fā)等(2001b)通過在斷奶仔豬的飼料中用抗菌肽代 替抗生素，對仔豬的腹瀉、生產(chǎn)性能等作了比較。結(jié)果表明，抗菌肽在仔豬斷奶應(yīng)激期間抗 腹瀉效果不比抗生素差，適量的抗菌肽比抗生素促生長的效果要好，但高劑量的抗菌肽則 降低了仔豬的生長，推測造成這一現(xiàn)象的是高劑量的抗菌肽破壞了豬腸道內(nèi)微生物種群的 平衡，降低了豬腸的免疫力。黃永彤等(2004)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對肉雞有促進(jìn)生長和提高免疫 力作用，與中草藥抗生素相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面均無顯著性差異，且在 出欄前3d停喂，抽檢無殘留。溫劉發(fā)等(2001a)通過飲水方式給粵黃雞添加抗菌肽的飼養(yǎng) 試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可促進(jìn)小雞生長和減少排泄物氮含量。陳曉生等(2005a)于肉鴨日 糧中添加液體的蠶抗菌肽AD-酵母制劑發(fā)現(xiàn)，血清代謝激素的活動顯著增強(qiáng)，IGF-I濃度升 高，營養(yǎng)物質(zhì)合成加強(qiáng)，尿素氮濃度顯著降低，體內(nèi)氮排出減少。陳曉生等(2005b)發(fā)現(xiàn)抗 菌肽能使肉鴨的產(chǎn)肉率提高，腹脂率、內(nèi)臟器官比重降低，在適當(dāng)劑量時，使用效果與金霉 素基本一致。陳曉生等(2005c)發(fā)現(xiàn)，添加抗菌肽制劑2ml/kg能有效提高肉鴨生產(chǎn)性能， 尤其是小鴨階段(1 2周齡)效果顯著；23ml/kg添加量均可顯著提高產(chǎn)肉率。從尿素氮 和總蛋白濃度結(jié)果看，添加抗菌肽會使機(jī)體在蛋白質(zhì)合成量變化不大的情況下減少機(jī)體蛋 白質(zhì)的分解代謝，從而促進(jìn)生長。雖然天然抗菌肽作為食品和飼料添加劑具有眾多傳統(tǒng)抗生素所沒有的優(yōu)點(diǎn)，但天 然抗菌肽在動物組織中含量很少，直接從血淋巴中純化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁 瑣，并且在應(yīng)用中表現(xiàn)出單一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌譜窄等缺陷。這些都不利于抗 菌肽在食品和飼料添加劑中的廣泛應(yīng)用。畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)作為近幾年新興的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，已表現(xiàn)出相當(dāng)大的潛力，彌補(bǔ)了原核系統(tǒng)的一些缺陷(Lin 等，2001)。Cregg等(2000)報(bào)道至今已有300多種外源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)， Werten等(1999)已報(bào)道胞內(nèi)的最高表達(dá)量為22g/L ;HasSlacher等(1997)已報(bào)道分泌胞 外的最高表達(dá)量為14.8g/L。利用酵母表達(dá)載體生產(chǎn)有用的蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)顯示出良 好的前景。但是近幾年來，利用畢赤酵母表達(dá)抗菌肽也出現(xiàn)了一些問題，如表達(dá)的外源蛋白 被酵母本身的堿性蛋白酶降解和表達(dá)量低等現(xiàn)象(陳海旭等，2001)。為保持酵母重組抗菌 肽的表達(dá)量和活性，金豐良等(2005，2006，2007)利用分子手段，以動物內(nèi)源性分子為融合 伴侶，改造了酵母表達(dá)載體和酵母菌株，以此酵母系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽，不僅提高了抗菌肽的表 達(dá)量，為國內(nèi)最高水平(22. Og/Ι)，并保持了抗菌肽的殺菌活性，為重組抗菌肽作為飼料添 加劑的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種殺菌活力更強(qiáng)、殺菌譜更廣的具有殺菌防腐功能的小肽。本發(fā)明還提供了上述小肽的制備方法。本發(fā)明還提供了上述小肽的應(yīng)用。本發(fā)明所述的具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD，其氨基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAK AKALGQG。本發(fā)明所述的制備上述具有殺菌防腐功能的小肽的方法，包括以下步驟(1)選擇豬小腸抗菌肽Cecropin P前11個氨基酸序列和惜古比天蠶Cecropin D 的后26個氨基酸序列設(shè)計(jì)具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA ；(2)根據(jù)酵母偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物Pl和P2，(3)進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增殺菌活性肽CP-CD的cDNA ；(4)在適于表達(dá)的載體中克隆CP-⑶的基因；(5)表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-CP-OT在酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)；(6)在適于表達(dá)該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中回收所需的產(chǎn)物。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(2)中所述的設(shè)計(jì)引物Pl 5'-AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'，CTCGAG表示引入的酶切位點(diǎn)為Xho I，Ρ2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGC TGCTGAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3 ‘，GCGGCCGC-3 ‘，GCGGCCG表示引入的酶切位點(diǎn)為 NotI。在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(3)具體為將混合液在94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、40秒，55°C >40秒，72°C、 50秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘，擴(kuò)增完畢后置4°C終止反應(yīng)。所述混合液組成如下含20mM Mg2+ 的 10 X PCR 緩沖液5 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的濃度
各為2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1濃度為10 μ M的引物Pl4μ 1濃度為10 μ M的引物Ρ24μ 1濃度為5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1滅菌水32·5μ1在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(4)中所述的載體為pPICZa A ；在一個更優(yōu)選的 實(shí)施例中，步驟(4)具體包括(a)殺菌活性肽的獲得。為了在殺菌活性肽CP-CD的N-端不引入其它氨基酸序 列，在設(shè)計(jì)Pl和P2引物時，Pl引物引入載體PPICZaA中a-factor信號肽的四個氨基酸 (LeU、GlU、LyS、Arg)，并引入起始密碼子ATG，在P2引物引入Asn編碼，使其C端酰胺化，引 物5'端引入Xho I酶切位點(diǎn)，3'引入Not I酶切位點(diǎn)。(b)將殺菌活性肽的cDNA進(jìn)行Xho I和Not I雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶 切回收的質(zhì)粒PPICZ α A體外連接，構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-CP-OT ；在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(5)具體包括1)酵母細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化用5 10 μ g線性化的pPICZ α A_CP_⑶電擊轉(zhuǎn)化KM71宿 主菌，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有50 μ g/mL Zeocin的YPDS平板，30°C倒置培養(yǎng)2 3天；2)高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選由于KM71本身就是Muts，無論怎樣重組，皆為Muts，不用 進(jìn)行表型確定；3)重組酵母基因組的PCR鑒定挑取高拷貝重組酵母KM71-CP-⑶一株，在YPD上 傳代10次，以分析外源基因在菌體內(nèi)的穩(wěn)定性，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后提取 基因組DNA。以此DNA為模板，使用引物5' AOXl Primer, 3' AOX 1 Primer進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，目的是檢查CP-⑶插入到畢赤酵母AOXl基因后的重組情況；4)CP_⑶的高效表達(dá)陽性克隆在搖瓶中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化的表達(dá)條件為26°C，1. 0% 甲醇，誘導(dǎo)120h。在另一個優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(6)中所述的宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞KM71 ；在一個 更優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟(6)具體包括將宿主細(xì)胞按照10 %的接種量接入三角搖瓶中，28-30°C，220-250rpm培 養(yǎng)18-24h后，按20 %的接種量接入50L發(fā)酵罐，在28-30 °C，450_550r/min，罐壓為 0. 05-0. 08Pa，通風(fēng)量為60_80NL/min，pH = 5. 5-6. 0，溶氧量不低于45%的條件下進(jìn)行發(fā) 酵，在培養(yǎng)24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)72h。然后通入100°C蒸汽 20min對發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，60°C噴霧干燥得到CP-⑶蛋白的粗制品。本發(fā)明所述的具有殺菌防腐功能的小肽的應(yīng)用，是該小肽在制備殺菌性乳豬飼料 的添加劑中的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的小肽的添加比例為基礎(chǔ)飼料重量的1% 5%。本發(fā)明以豬小腸中抗菌肽Cecropin P和惜古比天蠶Cecropin D為藍(lán)本，利用基 因工程的方法篩選出殺菌活力更強(qiáng)、殺菌譜更廣的抗菌肽CP-CD，并在以動物內(nèi)源性分子作 為伴侶的酵母表達(dá)載體中獲得高效表達(dá)。將表達(dá)產(chǎn)物添加到乳豬飼料中，能增強(qiáng)了豬飼料 的抗菌防腐、并增加豬飼料的利用率；抑制了外來病原微生物對豬的侵染，維持了豬腸內(nèi)益 生菌生態(tài)的平衡，提高了豬自身的免疫力。本發(fā)明開發(fā)的綠色、健康、環(huán)保的新型飼料添加劑，可以廣發(fā)應(yīng)用到畜禽的養(yǎng)殖中。
圖1是pPICZ α A物理譜圖；圖2是殺菌活性肽CP-⑶的PCR結(jié)果圖；其中，M為 DL2000Marker I，1 為 CP-CD 為擴(kuò)增片段圖3是重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α ACP⑶的表達(dá)框架；圖4是重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α ACP⑶的構(gòu)建示意圖；圖5是重組酵母ΚΜ71-CP⑶的PCR結(jié)果圖，1，2為陽性重組子，3為質(zhì)?？瞻讓φ?， M 為 DL2000Marker I ；圖6是表達(dá)上清對大腸桿菌的殺菌活性分析；圖7是重組蛋白CP-CD對E. clli K12D31 (A)和S. aureus (B)的活性檢測圖。具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例殺菌活性肽CP-CD在畢赤酵母中的高效表達(dá)1)重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-CP-⑶的構(gòu)建(1) CP-CD序列的擴(kuò)增(a)根據(jù)豬小腸cecropin P(I-Il)的氨基酸序列和惜古比天蠶 CecropinD (12-37)的氨基酸序列設(shè)計(jì)殺菌活性肽的cDNA ；(b)根據(jù)酵母偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物Pl和P2，Pl 5'-AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為Xho I),P2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGC TGCTGAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3'，GCGGCCGC-3'(黑斜體表示引入的酶切位點(diǎn)為 Not I)；由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，使用前用ddH20稀釋至10 μ Μ。(c)進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增重組抗菌肽。以Pl和Ρ2互為模板互為引物，以高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNAPolymerase) 進(jìn)行 PCR，CP-CD 的 PCR 反應(yīng)條件50 μ 1 體系中含有 10 XPCRbuffer (含 20mM Mg2+) 5 μ 1, dNTP mixtures (各 2. 5mM)4y 1，Pl (10 μ Μ) 4 μ 1，P2 (10 μ Μ) 4 μ 1，高保真 DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 32. 5 μ 1 ；將混合液在94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C、40 秒，5540秒，7250秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘，擴(kuò)增完畢后置4°C終 止反應(yīng)。得到 CP-CD cDNA 序列(AAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGC AGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTGTTGATACGTTCGCGAAGGCAAAGGCATTAGGTCAAGGATAA)。PCR 產(chǎn)物用質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，在120bp附近存在單一的目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖2，表明實(shí)驗(yàn)獲得了與預(yù)期相符的特異DNA片段即重組抗菌肽的cDNA。所述混合液組成如下含20mM Mg2+ 的 10 X PCR 緩沖液5 μ 1dNTP 混合物(濃度為 2. 5mM 的 dATP，dTTP, dCTP, dGTP) 4 μ 1濃度為10 μ M的引物Pl4μ 1濃度為10 μ M的引物Ρ24μ 1濃度為5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1滅菌水32. 5 μ 1。(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A_CP_CD的構(gòu)建由于抗菌肽N端對抗菌活性相當(dāng)重要，N端額外添加氨基酸會導(dǎo)致抗菌肽活性顯 著降低(Cabral et al. ,2003 ；Li et al.，2005)。因此在設(shè)計(jì)引物時，上游引物引入載體 pPICZaA中a-factor信號肽的四個氨基酸(Leu、Glu、Lys、Arg)，并引入起始密碼子ATG， 在下游引物引入Asn編碼，使其碳端酰胺化，引物5'端引入Xho I酶切位點(diǎn)，3'引入Not I酶切位點(diǎn)。使CP-⑶基因位于α -factor信號肽下游，插入到載體pPICZ α A相應(yīng)的窗口， CP-⑶序列與載體上的myc序列及6His序列融合，表達(dá)的重組CP-⑶羧基末端將帶有c-myc 表原和6His，而且α-factor可引導(dǎo)CP-CD分泌到細(xì)胞外，而α-factor在引導(dǎo)CP-CD蛋白 分泌過程中，被酵母本身的KEX2酶在Leu Glu Lys Arg (KEX2識別位點(diǎn))處被切下，可以使 表達(dá)的CP-⑶保持天然N端，達(dá)框架如圖3所示。將膠純化回收后CP-⑶PCR產(chǎn)物即重組殺菌活性肽的cDNA進(jìn)行Xho I和Not I雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶切回收的質(zhì)粒PQEUBI體外連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZ α ACP⑶。電擊轉(zhuǎn)化ΚΜ71，在含有25 μ g/mL Zeocin平板上篩選陽性的重組質(zhì)粒。陽 性重組質(zhì)粒的提取，酶切和PCR鑒定均按文獻(xiàn)(Sambrook et al.，1989)進(jìn)行。將酶切和 PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過 程如圖4。(3)重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定在含有25 μ g/mL Zeocin平板上篩選陽性的重組質(zhì)粒pPICZ α ACP⑶，抽提重組質(zhì) 粒DNA，進(jìn)行雙酶切分析，并同時設(shè)空載體做雙酶切對照，酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電 泳檢測。(4)重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定以酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒DNA為模板，分別用pPICZ α A測序引物5' AOXl Primer和3 ‘ AOXl Primer及Pl和P2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時設(shè)空載做對照，比較PCR
產(chǎn)物的差異。(5)重組表達(dá)質(zhì)粒的序列測定取經(jīng)雙酶切和PCR鑒定正確的陽性重組菌株，送上海英俊生物有限公司進(jìn)行序列 測定，測序結(jié)果正確。2)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE分析(1)酵母細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選用5 10 μ g線性化的pPICZ α A-CP-OT電擊轉(zhuǎn)化ΚΜ71宿主菌，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布 在分別含有25 μ g/mL Zeocin和100 μ g/mL Zeocin的YPDS平板。30°C倒置培養(yǎng)2 3天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電擊轉(zhuǎn)化KM71時，使用25 μ g/mL Zeocin的YPDS，轉(zhuǎn)化效率明顯高于100 μ g/mL Zeocin YPDS。KM71在四個平板上都獲得約50 60個左右的轉(zhuǎn)化子。用5 10 μ g線性 化的PPICZ α A空載體電擊轉(zhuǎn)化KM71的結(jié)果相似。(2)重組酵母基因組的PCR鑒定挑取高拷貝重組酵母KM71-CP⑶一株，在YPD上傳代10次，以分析外源基因在菌 體內(nèi)的穩(wěn)定性，然后接種于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后提取基因組DNA。以此DNA為模板，使 用引物5' AOXl Primer, 3' AOXl Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的是檢查CP-⑶插入到畢赤酵 母AOXl基因后的重組情況。以上操作同時用空載體轉(zhuǎn)化的重組酵母作對照，結(jié)果如圖5。(3)甲醇表型對CP-⑶表達(dá)的影響陽性克隆在搖瓶中小量表達(dá)，甲醇誘導(dǎo)120h后，分別取Muts和Mut+甲醇表型重組 菌株的誘導(dǎo)表達(dá)上清，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，表明CP-⑶在Muts菌株中的表達(dá)量 遠(yuǎn)高于Mut+菌株。因而，我們選取Muts重組菌株用做以后表達(dá)及純化的研究。Muts表型菌 株由于AOXl基因的缺失，其代謝甲醇的速度較慢。相應(yīng)，Muts表型菌株在以甲醇為碳源生 長時，需氧量少于Mut+表型菌株。Mut+在高密度生長時，需要通以氧氣以維持生長的需要。 因此Muts表型菌株更適合在實(shí)驗(yàn)室中規(guī)模高密度培養(yǎng)。3)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(1) CP-⑶表達(dá)上清的生物活性檢測將重組酵母CP-⑶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以1. 0% (ν/ν)甲醇誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)后每隔 24h取60yL發(fā)酵上清液置于-20°C保存?zhèn)溆谩闹腥〕?0 μ L發(fā)酵上清液，以E. coli K12D31為指示菌，采用瓊脂孔穴平板擴(kuò)散法測定表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性，用空載體轉(zhuǎn)化做陰性對 照，37°C過夜培養(yǎng)，結(jié)果如圖6所示。4) CP-CD蛋白制品的制備(1)重組抗菌肽CP-⑶的生物活性檢測重組蛋白CP-⑶的凍干粉用滅菌ddH20溶解成1 μ g/ml的溶液，以E. ColiK12D31和 S. aureus為指示菌，采用瓊脂孔穴平板擴(kuò)散法測定表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性，以1 μ g/ml氨芐青 霉素為陽性對照，以滅菌ddH20作為陰性對照，37°C過夜培養(yǎng)，結(jié)果如圖7。(2)重組蛋白的殺菌譜測定將純化的重組抗菌肽CP-⑶用0.01%的乙酸和0.2%牛血清白蛋白1/2倍梯度 稀釋，對其殺菌的廣譜性及最小抑制濃度進(jìn)行了測定，結(jié)果殺菌活性肽CP-CD具有相類似 的抗菌活力和抗菌譜，都具有廣譜抗菌性，不僅對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有廣譜 的抗性，而且對真菌也有一定的抑制作用。CP-CD對大腸桿菌豬霍亂沙門氏菌和豬霍亂沙 門氏菌的MIC分別為1.7μΜ和1.6μΜ。對一些真菌有較強(qiáng)的抑制作用，如灰霉菌(MIC = 14. 0 μ Μ)、青霉菌(MIC = 11. 3 μ Μ)、黑腐菌(MIC = 16. 8 μ Μ)，為殺菌活性肽CP-CD在豬病 害上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。(3)重組蛋白的發(fā)酵將以上步驟中篩選到的具有高拷貝數(shù)且殺菌活力強(qiáng)的重組酵母KM71-CP-⑶菌 株，經(jīng)活化后，按照10%的接種量接入三角搖瓶中，28-300C，220-250rpm培養(yǎng)18_24h后，按 20 %的接種量接入50L發(fā)酵罐，在28-30°C，450_550r/min，罐壓為0. 05-0. 08Pa,通風(fēng)量為 60-80NL/min,pH = 5. 5-6. 0，溶氧量不低于45%的條件下進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)72h。然后通入100°C蒸汽20min對發(fā)酵液進(jìn)行滅菌， 600C噴霧干燥得到CP-⑶蛋白的粗制品。(4)抗菌肽CP-CD制品在乳豬飼料中的應(yīng)用將CP-⑶的蛋白制品添加到乳豬飼料中，添加比例為基礎(chǔ)飼料重量的 5%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種具有殺菌防腐功能的小肽，其特征在于所述的小肽CP CD的氨基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAK AKALGQG。
2.制備如權(quán)利要求1所述的具有殺菌防腐功能的小肽的方法，其特征在于包括以下步驟(1)選擇豬小腸抗菌肽CecropinP前11個氨基酸序列和惜古比天蠶Cecropin D的后 26個氨基酸序列設(shè)計(jì)具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA ；(2)根據(jù)酵母偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物Pl和P2，(3)進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增殺菌活性肽CP-CD的cDNA；(4)在適于表達(dá)的載體中克隆CP-⑶的基因；(5)表達(dá)質(zhì)粒pPICZα A-CP-⑶在酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)；(6)在適于表達(dá)該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中回收所需的產(chǎn)物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的設(shè)計(jì)引物Pl 5' AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAG TGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'，CTCGAG 表示引入的酶切位點(diǎn)為 Xho I，Ρ2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGCTGCT GAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3‘，GCGGCCGC 表示引入的酶切位點(diǎn)為 Not I。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的載體為pPICZα A。
5.如權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于步驟(4)包括(a)殺菌活性肽的獲得。為了在殺菌活性肽CP-CD的N-端不引入其它氨基酸序列，在 設(shè)計(jì)Pl和P2引物時，Pl引物引入載體pPICZaA中a-factor信號肽的四個氨基酸(Leu、 Glu、LyS、Arg)，并引入起始密碼子ATG，在P2引物引入Asn編碼，使其C端酰胺化，引物5 ‘ 端引入Xho I酶切位點(diǎn)，3'引入Not I酶切位點(diǎn)。(b)將殺菌活性肽的cDNA進(jìn)行XhoI和Not I雙酶切，膠純化回收后，與經(jīng)同樣酶切回 收的質(zhì)粒pPICZ α A體外連接，構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α A-CP-OT ；
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞ΚΜ71。
7.如權(quán)利要求2或6所述的方法，其中步驟(6)包括將宿主細(xì)胞按照10%的接種量 接入三角搖瓶中，28-30°C，220-250rpm培養(yǎng)18_24h后，按20%的接種量接入50L發(fā)酵罐， 在 28-30°C，450-550r/min，罐壓為 0. 05-0. 08Pa，通風(fēng)量為 60_80NL/min，pH = 5. 5-6. 0，溶 氧量不低于45%的條件下進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā) 酵表達(dá)72h。然后通入100°C蒸汽20min對發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，60°C噴霧干燥得到CP-⑶蛋白 的粗制品。
8.如權(quán)利要求1所述的具有殺菌防腐功能的小肽在制備殺菌性乳豬飼料的添加劑中 的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的小肽的添加比例為基礎(chǔ)飼料重量的 5%。全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬源性具有殺菌活性的小肽。本發(fā)明還涉及這種小肽的制備方法及其在飼料防腐中的應(yīng)用。所述的具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD，其氨基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAKAKALGQG。所述的制備方法包括設(shè)計(jì)具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA；根據(jù)酵母偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)引物P1和P2；進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增殺菌活性肽CP-CD的cDNA；在適于表達(dá)的載體中克隆CP-CD的基因；表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-CP-CD在酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)；在適于表達(dá)該cDNA片段的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中回收所需的產(chǎn)物。所述的具有殺菌防腐功能的小肽可以應(yīng)用在制備殺菌性乳豬飼料的添加劑中。
文檔編號C07K14/47GK101948522SQ20101025713
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者郭吉余 申請人:廣東海大集團(tuán)股份有限公司