專利名稱：一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性物質(zhì)的分離純化方法，尤其涉及一種從鵝血中分離免疫球蛋 白IgY(AFc)的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是鴨鵝等水禽飼養(yǎng)的主要國(guó)家，年飼養(yǎng)總量達(dá)到43億只，占世界總量的75% 以上。水禽血液是食品加工過(guò)程的下腳料，部分加工成熟血塊食用，大部分被當(dāng)廢料直接排 到自然界中，不僅浪費(fèi)了寶貴的生物資源，而且對(duì)環(huán)境造成了一定的污染。動(dòng)物血液是重要 的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)來(lái)源，目前我國(guó)已部分利用了豬血、牛血等畜血資源制備血粉、提取蛋白 及其他生物活性成分，而水禽血液尚未得到充分利用。鵝血是一種高蛋白資源，蛋白含量高 達(dá)19%，含有大量球蛋白，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗癌等多種功能，已經(jīng)越來(lái)越引起人們的 關(guān)注。鵝血中免疫球蛋白包括IgM、IgA和υ -鏈免疫球蛋白。υ -鏈免疫球蛋白在鵝體 液中以IgY和IgY(AFc)兩種形式存在，是鵝抗感染免疫的最主要抗體。IgY的分子量為 180kDa,由兩條重鏈(67kDa)和兩條輕鏈(23kDa)組成，重鏈包括一個(gè)可變區(qū)和四個(gè)恒定區(qū) (CHl 4)，沒有鉸鏈區(qū)。IgY(AFc)的分子量為130kDa，也由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，輕 鏈與IgY相同，但重鏈分子量?jī)H37 42kDa，與IgY重鏈相比缺失了兩個(gè)末端恒定區(qū)(CH3 和CH4)。由于IgY(AFc)分子結(jié)構(gòu)的特殊性，免疫原性較低，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。經(jīng) 文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，邱翔等(西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30 (3) 331-333)采用辛酸-硫酸銨沉淀 法、硫酸銨沉淀和DEAE纖維素層析法從鴨血漿中提取IgY，并進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)辛酸_硫酸 銨法簡(jiǎn)便、快速，所獲得的IgY純度較高，但未報(bào)道具體數(shù)值。卜春文(食品科技，2004，(5) 79-81,85)從鵝血中提取IgY，收率達(dá)85%以上。以上兩篇文獻(xiàn)均未有效分離IgY( Δ Fe)。 日本專利(專利號(hào)JP2002030100A，
公開日2002. 1.29)采用免疫親和法從家禽的卵黃中提 取IgY ( Δ Fe)。因此，關(guān)于從鵝血等水禽血液中分離純化得到高純度的IgY (AFc),未見有 文獻(xiàn)報(bào)道。鵝血中脂肪含量高，通過(guò)降低溫度和靜置，去除分層的脂肪，并結(jié)合二氧化硅吸 附，可以有效去除血液中的脂肪。辛酸沉淀法是免疫球蛋白蛋白質(zhì)分離的有效方法，且辛 酸用量少，去除容易?；旌夏Ｊ轿綄游鍪墙陙?lái)發(fā)展起來(lái)的新型層析技術(shù)，其功能配基 同時(shí)兼有疏水基團(tuán)和離子交換基團(tuán)，配基密度通常比較高，吸附容量大，可以通過(guò)靜電相吸 來(lái)強(qiáng)化吸附或靜電排斥來(lái)協(xié)助解吸，特別適合于大規(guī)模的分離純化。本發(fā)明將混合模式吸 附層析與辛酸沉淀兩種分離方法有效結(jié)合，用混合模式吸附劑直接處理辛酸沉淀的上清 液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗體選擇性的特性，建立起一種從鵝血中分離 IgY ( δ Fe)免疫球蛋的經(jīng)濟(jì)高效方法，可以推廣應(yīng)用到其它水禽血液的處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從鵝血中分離免疫球蛋白
3IgY(AFc)的方法。從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法包括如下步驟1)配置0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為 9 1的比例混合均勻，用離心機(jī)以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，得到血漿，4 8°C靜置5 12小時(shí)，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末進(jìn)一步脫脂，二氧化硅粉末 的加入量為300 1000mg/ml血漿，室溫?cái)嚢?0 60分鐘，過(guò)濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4 5)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 100μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置2 4小時(shí)，用離心機(jī)以8000-10000rpm轉(zhuǎn)速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后， 上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰 對(duì)應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固體產(chǎn)品。所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4_巰乙基吡啶或2_巰甲基咪唑 為功能配基的層析介質(zhì)。所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，PH值為 5 7。所述的洗脫緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3 4. 5。本發(fā)明針對(duì)鵝血等水禽血液資源的綜合開發(fā)，通過(guò)辛酸沉淀與混合模式吸附層析 的有機(jī)結(jié)合，用于鵝血中免疫球蛋白IgY(AFc)的分離純化。采用混合模式吸附劑直接處 理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗體選擇性，提高分離 效率，簡(jiǎn)化分離步驟，得到一個(gè)經(jīng)濟(jì)高效的提取免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。本發(fā)明的優(yōu) 點(diǎn)在于1)快速，成本低廉；2)工藝簡(jiǎn)單，易于放大；3)過(guò)程處理量大，分離效率高；4)免疫 球蛋白IgY(AFc)的純度高。


附圖是本發(fā)明混合模式吸附層析分離鵝血漿免疫球蛋白的電泳譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。將新鮮抗凝血液離 心去除紅細(xì)胞，經(jīng)過(guò)脫脂處理，得到脫脂血漿；用辛酸法沉淀去除部分雜蛋白，得到上清液； 將上清液通過(guò)混合模式吸附層析柱進(jìn)行分離，得到免疫球蛋白IgY(AFc)。通過(guò)本發(fā)明分離 得到的免疫球蛋白IgY(AFc)純度大于95%。從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法 包括如下步驟1)配置0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為 9 1的比例混合均勻，用離心機(jī)以2500 3000rpm轉(zhuǎn)速離心10 20分鐘，得到血漿，4 8°C靜置5 12小時(shí)，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末進(jìn)一步脫脂，二氧化硅粉末 的加入量為300 1000mg/ml血漿，室溫?cái)嚢?0 60分鐘，過(guò)濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4 5)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 100μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置2 4小時(shí)，用離心機(jī)以8000-10000rpm轉(zhuǎn)速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后， 上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰 對(duì)應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固體產(chǎn)品。所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4_巰乙基吡啶或2_巰甲基咪唑 為功能配基的層析介質(zhì)。所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，PH值為 5 7。所述的洗脫緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3 4. 5。以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述實(shí)施例1取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機(jī)以2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細(xì)胞，4°C靜置5小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按照每 毫升血漿加入二氧化硅300mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入5ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入600 μ 1辛酸， 攪拌均勻，4°C靜置2小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為7. 0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑1cm) 中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀 緩沖液(PH7. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4. 0)，收集洗脫組分，脫鹽， 冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY ( Δ Fe)，電泳分析純度為96. 8 %。實(shí)施例2取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離 心機(jī)以3000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，除去紅細(xì)胞，8°C靜置12小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按 照每毫升血漿加入二氧化硅lOOOmg，室溫?cái)嚢?0分鐘，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血 漿，加入15ml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 5)混合均勻，得到稀釋血漿20ml，加入 600 μ 1辛酸，攪拌均勻，4°C靜置4小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到 上清液19. 6ml。上清液用0.45 μ m濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為5.0，取2ml作為進(jìn)樣樣品。層 析柱(內(nèi)徑Icm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸氫二 鈉_磷酸二氫鉀緩沖液(PH5. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0)，收集 洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為97. 2%。實(shí)施例3取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機(jī)以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，4°C靜置8小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按照每 毫升血漿加入二氧化硅300mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入20ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿25ml，加入2500 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液 23.8ml。上清液用0.45 μ m濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為6.0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑1cm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸氫二鈉-磷酸 二氫鉀緩沖液(PH6. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 5)，收集洗脫組 分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為95. 6%。實(shí)施例4取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機(jī)以2500rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，除去紅細(xì)胞，4°C靜置5小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按照每 毫升血漿加入二氧化硅500mg，室溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加入 5ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入300 μ 1辛酸， 攪拌均勻，4°C靜置4小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為6. 0，取2ml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑1cm) 中填充5ml以MEP Hypercel為功能配基的混合模式介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸氫二 鈉_磷酸二氫鉀緩沖液(PH6. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4. 0)，收集 洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為95. 8%。實(shí)施例5取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機(jī)以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，4°C靜置10小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按照 每毫升血漿加入二氧化硅600mg，室溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入5ml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入500 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液 9. 5ml。上清液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為5. 0，取Iml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi) 徑1cm)中填充5ml以4-巰乙基吡啶為功能配基的纖維素介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸 氫二鈉_磷酸二氫鉀緩沖液(PH5. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH3. 0)， 收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為96. 3%。實(shí)施例6取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機(jī)以3000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，除去紅細(xì)胞，8°C靜置15小時(shí)，除去上層的脂肪，然后按照 每毫升血漿加入二氧化硅800mg，室溫?cái)嚢?0min，過(guò)濾得到脫脂血漿。取5ml血漿，加入 IOml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4. 5)混合均勻，得到稀釋血漿15ml，加入600 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時(shí)，待雜蛋白沉淀完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液 15.2ml。上清液用0.45-濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值為7.0，取2ml作為進(jìn)樣樣品。層析柱(內(nèi)徑 Icm)中填充5ml以2-巰甲基咪唑?yàn)楣δ芘浠睦w維素介質(zhì)，平衡緩沖液為20mM的磷酸氫 二鈉_磷酸二氫鉀緩沖液(PH7. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4. 5)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為98. 0%。
權(quán)利要求
一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法，其特征在于包括如下步驟1)配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為9∶1的比例混合均勻，用離心機(jī)以2500～3000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，得到血漿，4～8℃靜置5～12小時(shí)，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化硅粉末進(jìn)一步脫脂，二氧化硅粉末的加入量為300～1000mg/ml血漿，室溫?cái)嚢?0～60分鐘，過(guò)濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸 乙酸鈉緩沖液(pH4～5)按照體積比為1～4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30～100μl/ml稀釋血漿，4～8℃靜置2～4小時(shí)，用離心機(jī)以8000 10000rpm轉(zhuǎn)速離心20～30分鐘，取上清液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液；3)調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液的pH至5～7，用0.45μm濾膜過(guò)濾后，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫緩沖液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度＞95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)固體產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4-巰乙基吡啶或2-巰甲 基咪唑?yàn)楣δ?配基的層析介質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀緩沖液，PH值為5 7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特征在 于所述的洗脫緩沖液為檸檬酸_檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3 4. 5。全文摘要
本發(fā)明公開了一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法。具體步驟如下1)制備脫脂血漿，取新鮮血液，離心，除去紅細(xì)胞，進(jìn)行脫脂，得脫脂血漿。2)辛酸沉淀，向血漿中加入辛酸達(dá)到一定濃度，沉淀去除雜蛋白，離心分離，取上清液。3)柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。4)脫鹽和干燥，將收集液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)。本發(fā)明所開發(fā)方法的特色在于設(shè)計(jì)了一條新的分離工藝，可以從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)，方法的關(guān)鍵在于從辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY(ΔFc)，具有操作步驟簡(jiǎn)單，分離純化因子高的優(yōu)點(diǎn)，可以推廣應(yīng)用于其它水禽血液的處理。
文檔編號(hào)C07K1/22GK101899110SQ20101022868
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者姚善涇, 林東強(qiáng), 童紅飛 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)