專利名稱：：一種促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物材料、再生醫(yī)學(xué)與藥學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及到一種能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞與材料的相互作用是生物材料研究中的一個重要的基礎(chǔ)研究。細(xì)胞黏附于生物材料表面作為細(xì)胞對材料的第一步響應(yīng)，并影響細(xì)胞后續(xù)的鋪展、生長、遷移、凋亡等細(xì)胞行為，分為特異性黏附與非特異性黏附。特異性黏附是通過細(xì)胞膜上整合素與細(xì)胞外基質(zhì)上的配體發(fā)生選擇性的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。整合素是細(xì)胞表面與細(xì)胞骨架相結(jié)合的一系列跨膜蛋白，它是由α，、β亞基組成的異二聚體。整合素通過胞內(nèi)細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)分子的結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞的分化、遷移、凋亡等行為。整合素在多種類型細(xì)胞中有表達(dá)。配體可以有多種，其中最常見的配體包含RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列。該序列也是細(xì)胞外基質(zhì)上纖維連接蛋白(fibronectin)中的一段序列，是整合素在細(xì)胞外基質(zhì)上可以識別的最小序列。1984年，Pierschbacher和Ruoslahti(Pierschbacher,M.D.；Ruoslahti，E.，1984Nature,30930-33)用人工方法合成含有RGDS(精氨酸-甘氨酸_天冬氨酸_絲氨酸)的短肽。固定了RGDS的生物材料表面可以促進(jìn)細(xì)胞在其上的黏附、生長和分化。Kessler等認(rèn)為，環(huán)狀的帶有RGD的多肽比線型的RGD系列多肽在體內(nèi)更穩(wěn)定，禾口整合素的結(jié)合活性更高。(Haubner，R.；Schmitt,W.；Holzemann,G.；Goodman,S.L.；Jonczyk,A.；Kessler,H.,1996J.Am.Chem.Soc.,1187881-7891)但目前的環(huán)狀的RGD系列多肽只是與細(xì)胞的整合素發(fā)生特異性作用，含有環(huán)狀RGD的試劑的親和效率仍然有待提尚ο細(xì)胞在培養(yǎng)板等表面多表現(xiàn)為非特異性黏附。Geiger課題組的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞與外界材料初始接觸的過程是受到一層較厚的含透明質(zhì)酸的細(xì)胞外被膜(PCC)所介導(dǎo)的非特異性黏附(Cohen，Μ.Joester,D.；Geiger,B.；Addadi，L.，2004ChemBioChem51393-1399)。PCC在生理?xiàng)l件下荷負(fù)電。帶有PCC的細(xì)胞與材料初始接觸以后才可能實(shí)現(xiàn)整合素介導(dǎo)的特異性黏附。可以利用細(xì)胞的這一特質(zhì)，開發(fā)出利用與細(xì)胞透明質(zhì)酸外膜帶有相反電荷的物質(zhì)來促進(jìn)細(xì)胞的初始黏附，并強(qiáng)化細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生特異性黏附等后續(xù)的細(xì)胞行為。本發(fā)明即利用了這種協(xié)同效應(yīng)。為了顯著誘導(dǎo)細(xì)胞在材料表面的黏附，本發(fā)明設(shè)計(jì)了以帶有RGD的環(huán)五肽作為主體，接上功能化的側(cè)鏈。通過生理?xiàng)l件下荷正電的側(cè)鏈來誘導(dǎo)細(xì)胞的透明質(zhì)酸外膜發(fā)生細(xì)胞的初始非特異性黏附，再通過帶有RGD的環(huán)五肽來誘導(dǎo)細(xì)胞的整合素與多肽的結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的特異性黏附。這樣的雙重誘導(dǎo)作用可以顯著有效地提高細(xì)胞的黏附率。功能化的端基，可以使多肽固定在材料表面或進(jìn)一步連接藥物分子。這樣的多肽分子，可以在生物材料的表面修飾與整合素靶向藥物上可得到廣泛的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可顯著高效地誘導(dǎo)細(xì)胞黏附、以用于材料改性的含多肽或進(jìn)一步含有功能基團(tuán)的多肽連接分子(后面有時也簡稱為多肽)。本發(fā)明提出的多肽分子包含至少兩個部分，一部分可以促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附，另外一部分可以促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附。其中，可促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附的多肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽序列；可促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附的部分為含有荷正電荷的多肽。對于含有多肽的連接分子還包含可以進(jìn)一步連接其它分子或表面的功能基團(tuán)。本發(fā)明特別設(shè)計(jì)了以帶有RGD的環(huán)五肽作為主體，接上功能化的側(cè)鏈。通過側(cè)鏈來誘導(dǎo)細(xì)胞的透明質(zhì)酸外膜發(fā)生細(xì)胞的初始非特異性黏附，再通過帶有RGD的環(huán)五肽來誘導(dǎo)細(xì)胞的整合素與多肽的結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的特異性黏附。這樣的雙重誘導(dǎo)作用可以利用兩種不同黏附類型之間的協(xié)同效應(yīng)顯著有效地提高細(xì)胞的黏附率。功能化的端基，可以使多肽固定在材料表面或進(jìn)一步連接其它分子。這樣的多肽適用于誘導(dǎo)并促進(jìn)大多數(shù)細(xì)胞的黏附。作為此類多肽分子的特殊形式，本發(fā)明設(shè)計(jì)了以下化學(xué)結(jié)構(gòu)(但并不限于下述具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式)，^-X1D\X2-I-X3)X4G^/1『其中，η為1-20之間的自然數(shù)。X1可以是帶苯環(huán)的右旋氨基酸，例如D-苯丙氨酸(D-Phenylalanine，Phe,f),D-色氨酸(D-Tryptophan，簡稱Trp或w)，D_酪氨酸(Tyrosine，簡稱Tyr或y)。(本發(fā)明的簡稱除非特殊說明以外，符合生物化學(xué)對于氨基酸的常規(guī)簡寫方式；此外，根據(jù)生物化學(xué)的慣例，不常見的D型氨基酸采用小寫字母的單字符表示，而常見的L-型氨基酸采用大寫字母的單字符表示；以下同)X2是帶有側(cè)鏈的氨基酸，可以是賴氨酸(Lysine，Lys,K)，天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D)或谷氨酸(Glutamicacid,Glu,Ε)X3可以是賴氨酸或精氨酸。X4可以是含有巰基(-SH)，氨基(-NH2),或羧基(-C00H)功能化基團(tuán)的分子。X2與X3之間和/或X3與X4之間可以通過酰胺鍵連接，也可以通過另外的分子連接。其結(jié)構(gòu)式包括但不限于下述中的任何一種<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>或<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>或<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明還提供上述多肽分子的合成方法，具體步驟如下(1)首先利用Fmoc固相合成的方法在二氯三苯甲基樹脂上，通過逐步接肽及脫除保護(hù)基條件的選擇，合成帶有不同保護(hù)基團(tuán)的含有RGD的并帶有側(cè)鏈的線型多肽，連接側(cè)鏈的同時接上巰基、氨基或羧基功能化基團(tuán)；(2)用三氟乙酸(TFA)將線型多肽從樹脂上切割下來；(3)通過甘氨酸的羧基與天冬氨酸的氨基的縮合反應(yīng)，使得線型多肽中的一部分在二甲基亞砜的溶液中發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成帶保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀多肽；(4)最后，使用三氟乙酸將環(huán)狀多肽的保護(hù)基團(tuán)去除得到的產(chǎn)物通過制備級高效液相色譜純化，真空干燥。本發(fā)明還提供上述多肽分子的應(yīng)用。例如，在金表面的活性修飾，其方法是將所述的多肽分子，溶解于水中，滴加于干凈的金表面，在4(T6°C環(huán)境中反應(yīng)1215小時，形成金表面的生物活性修飾。又如，該多肽分子可固定于聚合物表面，其方法是將所述的多肽分子，按一定比例大單體混合于水中，在紫外光照射下，誘發(fā)大單體聚合，完成多肽分子在聚合物中的固定；或者修飾前大單體分子鏈中包含NHS或碳碳雙鍵，多肽分子端基的雙鍵可通過紫外光引發(fā)聚合。本發(fā)明的多肽分子與現(xiàn)有的用于材料改性的多肽分子相比有以下幾個特點(diǎn)(1)此類多肽可誘導(dǎo)細(xì)胞在材料表面初始接觸，增加細(xì)胞在材料表面的黏附能力(2)此類多肽可誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞的整合素與材料表面發(fā)生特異性結(jié)合，并有效促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步伸展，生長等細(xì)胞行為。(3)此類多肽在生物體內(nèi)具有比線型多肽更高的穩(wěn)定性與生物活性。(4)此類多肽可在非常溫和的條件下固定于金等基質(zhì)材料的表面，提高材料的細(xì)胞黏附性。(5)此類多肽可通過光引發(fā)固定于特定的聚合物表面，提高聚合物的生物相容性及生物活性。(6)此類多肽可通過熱引發(fā)固定于特定的聚合物表面，提高聚合物的生物相容性及生物活性。(7)此類多肽可作為帶有靶頭的連接分子，用于整合素靶向的藥物和藥物載體的合成。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一類多肽，至少包含兩部分結(jié)構(gòu)，一部分可以促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附，另外一部分可以促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附。其中，促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附的部分含有可與細(xì)胞膜上整合素(Integrin)結(jié)合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，尤其是包含RGD的環(huán)型肽鏈；可促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附的部分主要為可與細(xì)胞外被膜(pericellularcoat,PCC)發(fā)生作用的線型肽鏈，同時側(cè)鏈的末端還可以包含可用于進(jìn)一步功能化修飾的基團(tuán)，使此多肽可進(jìn)一步連接其他物質(zhì)或被固定于材料表面，例如金、聚乳酸-聚乙交酯(PLGA)等表面，可大大提高材料的生物相容性及有利于細(xì)胞黏附性?？捎糜谏锊牧系母男砸约白鳛楹铣砂邢蛩幬飼r使用的連接靶頭。圖1為合成多肽RGD-K的1HNMR核磁圖。圖2為合成多肽RGD-K的MOLDI-TOFMS圖。圖3為合成多肽RGD-K的HPLC的純化圖。圖4為鼠成纖維NIH3T3細(xì)胞分別在固定了RGD-K環(huán)狀多肽的金表面、未固定多肽的金表面、玻璃及培養(yǎng)板(TCP)上的熒光顯微鏡圖。實(shí)驗(yàn)條件為在材料表面加入濃度5XIO5的NIH3T3細(xì)胞，培養(yǎng)基為胎牛血清(FBS)的DMEM。在37°C下5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3小時。取出后用PBS輕輕沖洗去未黏附的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘后用PBS沖洗。隨后用Triton-X100破膜10分鐘。接著用Phalloidin-TRITC和DAPI進(jìn)行細(xì)胞骨架及細(xì)胞核的染色。染色后的細(xì)胞通過熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在上述材料表面的黏附情況。具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限于這些實(shí)施例實(shí)施例1簡稱為RGD-K的環(huán)肽/直鏈肽雜合多肽分子(1)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)式可見圖1，采用氨基酸殘基單字符后，結(jié)構(gòu)式可表示為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>合成步驟包括1)直鏈多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol]-Arg(Pbf)-GIy-OH的合成直鏈多肽的合成是在二氯三苯甲基樹酯上用9-芴-甲氧基?；?Fmoc)的方法來合成。首先將一定量的樹酯用無水的二氯甲烷浸泡20分鐘，加入預(yù)先溶解在無水二氯甲烷中的Fmoc保護(hù)甘氨酸，及N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，室溫反應(yīng)2小時。隨后用醇與樹酯上未反應(yīng)的活性位點(diǎn)反應(yīng)15分鐘，進(jìn)行封端。反應(yīng)完畢后，用二甲基亞砜(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇清洗樹酯，并真空干燥樹酯，稱取樹酯反應(yīng)前后的質(zhì)量差，求出第一個氨基酸在樹酯上負(fù)載量為。加入20%的哌啶/DMF溶液，反應(yīng)15分鐘，以去除甘氨酸上氨基的Fmoc保護(hù)基，用DMF洗滌干凈樹酯，取小量樹酯進(jìn)行茚三酮反應(yīng)顯藍(lán)色，證明Fmoc已被脫除，露出甘氨酸上的游離氨基。將Fmoc-Arg(Pbf)-OH用DMF溶解后，加入苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)及DIPEA混合均勻后，滴加入上述樹酯中，進(jìn)行氨基與羧基的縮聚反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用DMF洗滌干凈并加入20%哌啶/DMF溶液脫除Fmoc保護(hù)基，然后用DMF洗滌干凈樹酯，取小量樹酯進(jìn)行茚三酮反應(yīng)顯藍(lán)色，證明Fmoc已被脫除，露出精氨酸上的游離氨基。此時，樹酯上連接的多肽序列為NH2-Arg(Pbf)-Gly-resin。按照上述反應(yīng)步驟與配比，依次加入Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Lys(Pbf)-0H,Fmoc-Lys(Pbf)-OH,Fmoc-Lys(Pbf)-OH,3-Tritylmercapto-Propionicacid。每次縮聚反應(yīng)結(jié)束后，都必須進(jìn)行茚三酮檢測，以確保反應(yīng)已完全。至此，樹酯上的連接的序列為Aloc-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol]-Arg(Pbf)-Gly-resin。上訴逐步接肽反應(yīng)結(jié)束后，將樹酯用無水DCM充分洗滌干凈后，在Ar氛圍下，滴加PhSiH3AM(PPh3)4/DCM的混合溶液，反應(yīng)15分鐘脫除樹酯上賴氨酸的Aloc保護(hù)基，DMF洗滌后，進(jìn)行茚三酮檢測。最后依次進(jìn)行Fmoc-D-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH與樹酯上多肽的縮合反應(yīng)。去除了天冬氨酸上Fmoc保護(hù)基后，樹酯上直鏈多肽序列NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-resin的合成已經(jīng)完成。2)直鏈多肽的切割將上述連有直鏈多肽的樹酯真空干燥后加入5%的TFA/DCM，攪拌反應(yīng)一小時，過濾后收集濾液。濾液用DCM沉淀后，離心收集到直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OHoMOLDI-TOFMSm/z=2312.3[M+H"]3)部分序列的環(huán)化將帶保護(hù)基團(tuán)的直鏈多肽溶解于DMF中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基_氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)及DIPEA，室溫反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑旋蒸干后，用水沉淀，離心收集沉淀物，冷凍干燥得到帶保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽。M0LDI-T0FMS:m/z=2293.5[M+H+]4)保護(hù)基的去除將混合切割劑(95%(v/v)TFA，2.5%(ν/ν)水，2.5%(ν/ν)茴香硫醚)IOmL滴加入上述冷凍干燥后的帶保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽中，反應(yīng)3小時脫除所有保護(hù)基。旋蒸去大部分溶劑后，無水乙醚沉淀，離心收集沉淀，真空干燥得粗產(chǎn)物(0.24g,0.22mmol,M0LDI-T0FMS:m/z=1077.7[M+H+]4)環(huán)肽/直鏈肽雜合多肽的純化將上述粗產(chǎn)物用制備級HPLC純化，得到白色的純品，純度為98%。MALDI-T0FMS:m/z=1077.07for[M+H]1HNMR(500MHz,DMSO)δinppm=8.30-7.55(NHofthepeptidebackbone),7.44-7.43(NHε-Arg),7.3-7.14(aromat,CH-D-Phe)，6.78(NH2-Arg),4.45-4.05(CH2α-Asp,CH2α-D-PheCH2α-Arg,CH2α-Gly,CH2α-Lys,CH2ε-Lys),3.78&3·24(CH2α-Gly)，3.10-3.07(CH2δ-Arg,CH2ε-Lys)，2.96(CH20-D—Phe)，2.85-2.65(CH2ε-Lys,CH20-D-Phe,CH2aMpa,CH20-Asp)，2·45—2.2(CH20-Mpa，CH20-Asp),1.82-1.65(CH20-Arg,CH20-Lys,CH25-Lys),1.51-1.21(CH/-Lys,CH20-Arg,CH2γ-Arg,CH25-Lys,CH2γ-Lys)。實(shí)施例2多肽分子(2)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<image>imageseeoriginaldocumentpage9</image>直鏈多月太NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-[Lys(Boc)]20-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)椋現(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,重復(fù)Fmoc-Lys(Boc)-OH的縮M&M20^,3-Tritylmercapto-Propionicacid,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc_Asp(OtBu)_0H。直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化并去除保護(hù)基后的環(huán)肽/直鏈肽雜合多肽經(jīng)制備級HPLC純化后得到最終白色純品的純度為98%。MALDI-T0FMS:m/z=2949.89for[M+H]+。實(shí)施例3多肽分子(3)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>直鏈多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Tyr-Lys[-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)椋現(xiàn)moc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH3-TrityImercapto-Propionicacid,Fmoc-D-Tyr-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化并去除保護(hù)基后的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后得到最終白色純品的純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1177.07for[M+H]+。實(shí)施例4多肽分子(4)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>直鏈多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Trp-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-0H,Fmoc-Lys(boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OPbf,Fmoc-D-Trp-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1158.47for[M+H]+。實(shí)施例5多肽分子(5)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>直鏈多月太NH2-Asp(OtBu)-D-Trp-Lys[-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OPbf,Fmoc-D-Trp-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH。得到的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1230.2for[M+H]+。實(shí)施例6:多肽分子(6)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>直鏈多月太NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時,加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OHFmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-D-Trp-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH0得至Ij的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1354.38for[M+H]+。實(shí)施例7多肽分子(7)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>首先合成直鏈多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-(CH2)5_Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH0其步驟與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-(CH2)5-OH(Fmoc保護(hù)的氨基己酸)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-0H,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-0H。得到的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1459.4for[M+H]+。實(shí)施例8:多肽分子(8)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>直鏈多月太NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-(CH2CH2O)4-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH的合成與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(CH2CH2O)4-OPbf,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH0得到的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMSm/z=1530.38for[M+H]+。實(shí)施例9多肽分子(9)的合成，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>首先合成直鏈多肽NH2-Asp(OtBu)-D-Phe-Lys[-(CH2)5_Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-(CH2CH2O)4-thiol(Trt)]-Arg(Pbf)-Gly-OH。其步驟與實(shí)例1中直鏈多肽的合成步驟類似，只是側(cè)鏈的反應(yīng)時，加入的氨基酸的序列變?yōu)镕moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH,Aloc-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-(CH2)5-OH(Fmoc保護(hù)的氨基己酸)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-0H,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Lys(boc)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-(CH2CH2O)4_0Pbf，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。得到的直鏈的帶保護(hù)基團(tuán)的多肽，環(huán)化后并去除保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀肽經(jīng)制備級HPLC純化后，最終得到的白色的純品，純度為98%。MALDI-TOFMS:m/z=1636.38for[M+H]+。實(shí)施例10多肽用于金表面的生物活性修飾將實(shí)施例1中制備的化合物，按照25μmol/L的濃度溶于純凈水中，滴加在干凈的金表面，在4°C6°C下反應(yīng)1215小時。反應(yīng)結(jié)束后，用純凈水輕輕沖洗金表面，去除未反應(yīng)的多肽分子即可。實(shí)施例11多肽用于PLGA-PEG-PLGA(polylactide/glycolideacid(PLGA)-polyethyleneglycol(PEG)-PLGA,)水凝膠的生物活性修飾。將實(shí)施例3中制備的化合物，與兩端NHS化改性的NHS-PLGA-PEG-PLGA-NHS，按照21的配比投入pH=8.O的PBS中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析除去未反應(yīng)的多肽，冷凍干燥得到產(chǎn)物多肽接枝的PLGA-PEG-PLGA。將產(chǎn)物配制成10%-30%的水溶液，在20°C-40°C之間能形成多肽活性修飾的PLGA-PEG-PLGA水凝膠。權(quán)利要求一種可促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽分子，其特征在于包含至少兩個部分，一部分可以促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附，另外一部分可以促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附，其中，所述可促進(jìn)特異性細(xì)胞黏附的多肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽序列，所述可促進(jìn)非特異性細(xì)胞黏附的部分為含有荷正電荷的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽分子，其特征在于，還包含可以進(jìn)一步連接材料表面或其它分子的功能基團(tuán)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽分子，其特征在于具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，R代表精氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基；X1是帶苯環(huán)的右旋氨基酸；X2是帶有側(cè)鏈的氨基酸；X3是賴氨酸或精氨酸；η為1-20之間的數(shù)字;X4為含有巰基、氨基或羧基功能化基團(tuán)的分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可促進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽分子，其特征在于X2與X3之間和/或X3與X4之間通過酰胺鍵連接，其結(jié)構(gòu)式為<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>或<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>當(dāng)中的任何一種，其中，η為1-20之間的數(shù)字。5.一種如權(quán)利要求1所述的多肽分子的合成方法，其特征在于具體步驟如下(1)首先利用Fmoc固相合成的方法在二氯三苯甲基樹脂上，通過逐步接肽及脫除保護(hù)基條件的選擇，合成帶有不同保護(hù)基團(tuán)的含有RGD的并帶有側(cè)鏈的線型多肽，連接側(cè)鏈的同時接上巰基、氨基或羧基功能化基團(tuán)；(2)用三氟乙酸將線型多肽從樹脂上切割下來；(3)通過甘氨酸的羧基與天冬氨酸的氨基的縮合反應(yīng)，使得線型多肽中的一部分在二甲基亞砜的溶液中發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，形成帶保護(hù)基團(tuán)的環(huán)狀多肽；(4)最后，使用三氟乙酸將環(huán)狀多肽的保護(hù)基團(tuán)去除得到的產(chǎn)物通過制備級高效液相色譜純化，真空干燥。6.一種如權(quán)利要求1所述的多肽分子在金表面的固定方法，其特征在于將所述的多肽分子，溶解于水中，滴加于干凈的金表面，在4°C飛。C環(huán)境中反應(yīng)1215小時，形成金表面的生物活性修飾。7.—種如權(quán)利要求1所述的多肽分子在聚合物中的固定化方法，其特征在于修飾前大單體分子鏈中包含NHS或碳碳雙鍵，多肽分子端基的雙鍵可通過紫外光引發(fā)聚合。8.—種如權(quán)利要求1所述的多肽分子在聚合物中的固定方法，其特征在于將所述的多肽分子，按一定比例大單體混合于水中，在紫外光照射下，誘發(fā)大單體聚合，完成多肽分子在聚合物中的固定。全文摘要本發(fā)明屬于生物材料、再生醫(yī)學(xué)和藥學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及到一種能夠顯著誘導(dǎo)并同時促進(jìn)細(xì)胞特異性及非特異性黏附的多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的多肽包含兩部分結(jié)構(gòu)，一端是含有整合素親和性的有利于細(xì)胞特異性黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的環(huán)型肽鏈，另一端是可與細(xì)胞外被膜發(fā)生作用促進(jìn)細(xì)胞非特異性黏附的線型肽鏈，同時側(cè)鏈的末端具有可功能化修飾的基團(tuán)，使此多肽可被固定于生物材料，例如金、聚乳酸-聚乙交酯等表面，可大大提高材料的生物相容性及有利于細(xì)胞黏附性?？捎糜谏锊牧系母男砸约鞍邢蛩幬铩Ｎ臋n編號C07K1/20GK101817873SQ20101012187公開日2010年9月1日申請日期2010年3月11日優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日發(fā)明者丁建東,賴毓霄申請人:復(fù)旦大學(xué)