專利名稱：免疫球蛋白組合物和生產(chǎn)其的方法
免疫球蛋白組合物和生產(chǎn)其的方法發(fā)明領(lǐng)域和背景本發(fā)明在其一些實施方案中涉及免疫球蛋白組合物和生產(chǎn)其的方法。抗體近年來已經(jīng)成為有前途的治療蛋白，且是生物藥的領(lǐng)先類別，年銷售額超 過200億美元。連續(xù)的技術(shù)進步已經(jīng)驅(qū)動單克隆抗體部分的增長，該部分直到最近仍然 由諸如Remicade和Rituxan等嵌合抗體占優(yōu)勢，其在2008年中將繼續(xù)驅(qū)動市場份額。但 是，趨勢在改變，人源化和全人單克隆抗體以及諸如Fab、scFv等重組抗體片段和綴合抗 體，正在日益變成重要的單克隆抗體市場增長驅(qū)動器，預測化合物年增長率是20.9%。盡管重組抗體片段正在穩(wěn)定進展，抗體市場仍然由全長IgG抗體占優(yōu)勢。雖然 通常在大腸桿菌表達系統(tǒng)中生產(chǎn)小抗體片段(Ward，1993 ； Kipriyanov和Little，1999)， 已經(jīng)傳統(tǒng)地在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)全長單克隆抗體，這是由于它們的起始雜交瘤 來源和由于分子的復雜性(Simmons等人，2002)。對于全長IgG而言，存在幾種備選 的表達系統(tǒng)，例如在植物中(Ko和Koprowski，2005)或在轉(zhuǎn)基因動物奶中(Houdebine， 2002)，但是尚未獲得普及(Kipriyanov 和 LeGall，2004)。20 多年以前，Cabilly 等人(Cabilly 等人，1984，Proc Natl Acad Sci U S A 81，
3273-7)報道了他們的生產(chǎn)IgG的嘗試。他們得到了低質(zhì)量的產(chǎn)物和低產(chǎn)率。其原因之 一是，超過20年以來，認為在大腸桿菌中生產(chǎn)IgG是不實際的。美國6,331,415公開了生產(chǎn)免疫球蛋白或至少含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變 結(jié)構(gòu)域的免疫功能的免疫球蛋白片段的方法。所述方法可以在單個細胞中或在分開的宿 主細胞培養(yǎng)物中使用一種或更多種生成重鏈和輕鏈或其片段的載體。提供的結(jié)果(圖8B 和9)清楚地顯示了與臨床應(yīng)用無關(guān)的異基因產(chǎn)物。近年來，2個研究組已經(jīng)報道了全長抗體在大腸桿菌中的裝配(Simmons等人， 2002 ； Mazor等人，2007b)。這2個研究組都使用指導可溶的重鏈和輕鏈向細菌周質(zhì) 中分泌的載體系統(tǒng)，它們在細菌周質(zhì)中裝配成可溶的有活性的IgG分子。第一項研究 (Simmons等人，2002，和美國專利6,979,556，美國專利申請20070015244)生產(chǎn)抗體制 品，其除了裝配的IgG以外，還含有部分裝配的物質(zhì)，例如重鏈二聚體或只與輕鏈配對 的這種二聚體。他們的結(jié)論是，他們描述的技術(shù)是在大腸桿菌中有效地生產(chǎn)全長無糖基 化抗體的方法中的重要步驟，且產(chǎn)率高得足以提供用于研究目的的材料。他們進一步提 出，這些蛋白作為治療劑的應(yīng)用，在不遠的將來會具有進一步增加的滴度。第二項研究 (Mazor等人，2007b)改善了表達條件，其中使用稍微不同的分泌質(zhì)粒集合。他們得到了 相當質(zhì)量的IgG，其仍然含有部分裝配的物質(zhì)(Mazor等人2007b，補充圖4)。Mazor等 人，2007b報道的生產(chǎn)產(chǎn)率是約0.2-lmg/l (低密度搖瓶培養(yǎng)物)，而Simmons等人，2002 報道了高達150mgIgG/升的產(chǎn)率(高密度發(fā)酵培養(yǎng)物)，在達到400D55(i的細胞密度后誘 導另外80小時。難以進行對比，但是他們的產(chǎn)率大概相當于每個搖瓶培養(yǎng)物幾mg。美國20080305516教導了在革蘭氏陽性細菌或真核細胞中生產(chǎn)免疫球蛋白分子 或至少包含免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的功能部分的免疫功能的免疫球蛋白片 段的方法。所述方法包含，在2個分開的宿主細胞中生產(chǎn)重鏈和輕鏈，并在體外重新折疊免疫球蛋白分子或片段。該申請清楚地教導了不在革蘭氏陰性細胞中表達抗體，這是 因為在革蘭氏陰性培養(yǎng)物中難以獲得高分子量產(chǎn)物。另外，美國20080305516闡明，在 大腸桿菌中生產(chǎn)大量目標蛋白的結(jié)果，經(jīng)常是形成包涵體和后續(xù)的重新折疊，這會降低 產(chǎn)率和質(zhì)量。Boss 等人(1984 Nucleic Acids Research 12 3791-3806)教導了在單個大腸桿菌 培養(yǎng)物或分開的大腸桿菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)鼠IgM輕鏈和重鏈。在從包涵體重建和重新折疊 后，僅檢測到殘余的抗體活性。表現(xiàn)出的產(chǎn)率較差，因為僅基于放射性的分析鑒別出了 產(chǎn)物(參見其中的圖3)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案的一個方面，提供了在細菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)免疫球蛋 白的方法，該方法包含(a)在第一種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白輕鏈的第一種多肽，從而形成 包含免疫球蛋白輕鏈的包涵體；(b)在第二種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白重鏈的第二種多肽，從而形成 包含免疫球蛋白重鏈的包涵體；(c)從包涵體回收第一種多肽和第二種多肽，從而得到重建的重鏈和重建的輕 鏈；和(d)在允許重建的輕鏈和重建的重鏈主要重新折疊為完整免疫球蛋白的條件下， 重新折疊重建的重鏈和重建的輕鏈。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述條件包含約1 2的重鏈_輕鏈摩爾比。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述第一種細菌宿主和第二種細菌宿主各自是革 蘭氏陰性細菌。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述革蘭氏陰性細菌是大腸桿菌。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述方法另外包含，在蛋白A/G/L上純化免疫球 蛋白分子。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述方法具有每1升重鏈細菌培養(yǎng)物至少50mg純 化的免疫球蛋白分子的產(chǎn)率，在誘導時具有2.5的O.D.600。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，第一種多肽和第二種多肽中的至少一種包含治療 部分。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，第一種多肽和第二種多肽中的至少一種包含可鑒 別部分。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，主要重新折疊為完整免疫球蛋白包含至少80%的 免疫球蛋白作為完整免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述重鏈屬于Y家族。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述輕鏈屬于κ家族。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述輕鏈屬于λ家族。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案的一個方面，提供了根據(jù)上述方法生產(chǎn)的免疫球蛋 白。
根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案的一個方面，提供了物質(zhì)組合物，其包含革蘭氏陰 性制品殘余物和至少90%免疫球蛋白。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述組合物包含不超過10%免疫球蛋白片段。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述免疫球蛋白選自IgA，IgD, IgE和IgG。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述IgG包含IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述免疫球蛋白選自嵌合抗體，人源化抗體和 全人抗體。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述免疫球蛋白是雙特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述免疫球蛋白選自靈長類動物免疫球蛋白， 豬免疫球蛋白，鼠免疫球蛋白，牛免疫球蛋白，山羊免疫球蛋白和馬免疫球蛋白。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和/或科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可以 用于實踐或測試本發(fā)明的實施方案，下文還是描述了示例性的方法和/或材料。在沖突 的情況下，以本專利說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性 的，無意成為必要的限制。附圖簡述本發(fā)明的有些實施方案在本文中僅作為實例參考附圖予以描述?，F(xiàn)在詳細地具 體參考附圖，應(yīng)強調(diào)的是，顯示的細節(jié)僅作為實例和用于本發(fā)明實施方案的說明性討論 的目的。在這點上，說明書連同附圖使得本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見如何實踐本發(fā)明的實 施方案。在附圖中

圖1是Inclonal表達載體的示意圖。用于表達人Y 1重鏈的質(zhì)粒pHAK_IgH、用 于表達人κ輕鏈的pHAK-IgL、用于表達與假單胞菌外毒素A的截短形式(PE38)融合的 人Y 1重鏈的pHAK-IgH_PE38、用于表達與PE38融合的人κ輕鏈的pHAK-IgL_PE38
的圖譜。圖2A-B是顯示T427 Inclonal在大腸桿菌中的表達和純化的蛋白凝膠照片。圖 2a-12% SDS/PAGE。泳道1，未誘導的大腸桿菌培養(yǎng)物。泳道2，誘導的重鏈。泳 道3，誘導的輕鏈。泳道4，未純化的重新折疊的IgG。泳道5，蛋白-A純化的IgG。 M，分子量標志物，以kDa為單位，泳道6，西妥昔單抗。泳道7，蛋白-A純化的T427 Inclonal。在還原條件下分析泳道1_5，而泳道6-7則不是。通過GelCode Blue 染色， 使蛋白顯影。圖2B是使用HRP-綴合的抗人抗體和ECL顯影的免疫印跡。泳道排列與 在A中相同，只是泳道E=西妥昔單抗 。圖3中的圖顯示了通過凝膠過濾色譜法對T427 Inclonal和西妥昔單抗分析。 在TSK3000柱上分離IgG樣品。箭頭指示商品化的大小標志物在柱上的遷移圖譜。圖4A-C中的圖顯示了 Τ427 Inclonal的結(jié)合性質(zhì)。圖4A顯示了通過ELISA測 定法測得的與MBP-CD30的結(jié)合，而檢測是使用HRP-綴合的抗人IgG。圖4B顯示了 通過FACS分析測得的T427 Inclonal抗體的結(jié)合。左圖-用IOnM在哺乳動物細胞中生 產(chǎn)的chT427-IgG或用T427 Inclonal溫育穩(wěn)定的A431/CD30轉(zhuǎn)染的細胞(左圖，1)。右 圖_在有X 30摩爾過量的T427 (dsFv) -PE38免疫毒素作為競爭劑存在下，T427 Inclonal結(jié)合的FACS分析。使用FITC-綴合的抗人抗體，檢測結(jié)合。圖4C中的圖顯示了 T427-ZZ-PE38的特異性細胞毒性。用指定濃度的IgG_ZZ"PE38免疫綴合物或只用T427 IgG,溫育A431/CD30細胞48h。使用酶MTT測定法，測定活細胞的相對數(shù)。每個點 代表在三個獨立實驗中一式三份測定的一組數(shù)據(jù)的平均值。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準差。圖5A-C示意地解釋了 IgG-毒素融合蛋白和它們通過SDS-PAGE的分離。 圖5A是在該研究中生產(chǎn)的inclonal的示意圖。圖5B是在非還原條件下蛋白_A_純 化的T427 Inclonal的免疫印跡。泳道1，IgG ；泳道2，IgG- ( 二 ) -PE38 ；泳道3， IgG-(四)-PE38 ；圖5C是在還原條件下蛋白-A-純化的T427 Inclona卜PE38融合蛋白的 免疫印跡。泳道1，IgG-(二)-PE38 ；泳道2，IgG-(四)-PE38.M，分子量標志物，以 kDa為單位。圖6A-B是表征T427 Inclonal-毒素融合蛋白的圖。圖6A顯示了在ELISA中與 MBP-CD30結(jié)合的評價。檢測是使用與HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG混合的小鼠抗PE血 清。圖6B顯示了 inclonal-毒素融合體的特異性細胞毒性用指定濃度的重組IgG_PE38 融合蛋白或T427(dsFv)_PE38作為參照，溫育A431/CD30細胞48h。使用酶MTT測定 法，測定活細胞的相對數(shù)。每個點代表在三個獨立實驗中一式三份測定的一組數(shù)據(jù)的平 均值。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準差。圖7A-B是顯示抗EGFR 225 Inclonal的結(jié)合性質(zhì)的圖。圖7A-通過全細胞ELISA 測試的與在A431細胞上表達的EGFR的結(jié)合。檢測是使用HRP-綴合的抗人IgG。圖 7B-FACS分析(bl)用IOnM 225Inclonal或商品化的用作對照的抗EGFR抗體西妥昔 單抗 溫育A431細胞。(b2)象在bl中一樣，在不表達EGFR的G43黑素瘤細胞上的 FACS分析。(b3)在有X 30摩爾過量的225 (scFv) -PE38免疫毒素作為競爭劑存在下， 225 Inclonal結(jié)合A431細胞的FACS分析。使用FITC-綴合的抗人抗體，檢測結(jié)合。圖8A-C是顯示225 1加10皿卜22" ￡38的分析的圖。圖8A-下述細胞系的EGFR 表達水平的FACS分析A431 (粗體亮色灰色)，HEK293 (粗體黑色灰色)和對照G43 (細 體亮色灰色)。通過用與FITC-綴合的抗人抗體混合的西妥昔單抗 染色，檢測EGFR 水平。圖8B-225 Inclonal-ZZ-PE38對A431細胞(表達高水平的EGFR)的細胞殺傷測 定。圖8C-225 Inclonal-ZZ-PE38對HEK293細胞(表達低水平的EGFR)的細胞殺傷測 定，其中用指定濃度的IgG-ZZ_PE38免疫綴合物或只用IgG溫育細胞48h。使用酶MTT 測定法，測定活細胞的相對數(shù)。每個點代表在三個獨立實驗中一式三份測定的一組數(shù)據(jù) 的平均值。誤差棒代表數(shù)據(jù)的標準差。圖9A-B中的圖顯示了哺乳動物細胞生產(chǎn)的T427和T427 Inclonal在100 %牛血清 中溫育后的穩(wěn)定性分析。在100%牛血清中將IgG稀釋至30 μ g/ml的終濃度，并在37°C 溫育指示的時間段。如圖4A所述，通過ELISA評價每個反應(yīng)中與MBP-CD30的殘余結(jié)
合活性。本發(fā)明實施方案的描述本發(fā)明在其有些實施方案中涉及免疫球蛋白組合物和生產(chǎn)其的方法。在詳細說明本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)當理解，本發(fā)明的應(yīng)用不一定 限于下列描述中闡述或通過實施例例示的細節(jié)。本發(fā)明可以是其它實施方案或以各種方 式實踐或執(zhí)行。
重組抗體已經(jīng)成為診斷和治療中的中樞模態(tài)，大量單克隆抗體處于臨床試驗的 不同階段。因此非常希望使重組抗體生產(chǎn)產(chǎn)率最大化，因為它會導致節(jié)省成本的生產(chǎn)。同時使本發(fā)明回歸實踐，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了當作為包涵體從原核細胞系統(tǒng)表達 時使免疫球蛋白的生產(chǎn)產(chǎn)率和裝配最大化的條件。根據(jù)本發(fā)明的教導生產(chǎn)的重組抗體制 品是非常均質(zhì)的，因此制品中的主要物質(zhì)是完整的免疫球蛋白，而存在的抗體片段僅是 殘余量。本文所述的方法在性質(zhì)上是簡單的，節(jié)省成本的，可以容易地放大，且特征在 于轉(zhuǎn)化、蛋白純化和重新折疊之間相對較短的時間，使它可有效地用于在細菌中工業(yè)化 生產(chǎn)抗體。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了在細菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)免疫球蛋白的方 法，該方法包含(a)在第一種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白輕鏈的第一種多肽，從而形成 包含免疫球蛋白輕鏈的包涵體；(b)在第二種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白重鏈的第二種多肽，從而形成 包含免疫球蛋白重鏈的包涵體；(c)從包涵體回收第一種多肽和第二種多肽，從而得到重建的重鏈和重建的輕 鏈；和(d)在允許重建的輕鏈和重建的重鏈主要(即超過50%、60%, 70%, 80%, 90%或更多的抗體物質(zhì))重新折疊為免疫球蛋白的條件下，重新折疊重建的重鏈和重建 的輕鏈。本文使用的“抗體物質(zhì)”是指免疫球蛋白和其片段(例如，F(xiàn)ab，重鏈單體，輕 鏈單體，雜合體(heteromer)重鏈-輕鏈)。本文互換使用的術(shù)語“完整的免疫球蛋白”或“完整的抗體”是指通過本領(lǐng)域 熟知的方法生產(chǎn)的完整抗體，所述方法通常需要免疫接種(參見例如，Harlow和Lane， Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988,其通
過參考引用并入本文)。所述抗體通常是單克隆抗體。全部或完整抗體包含通過二硫鍵相互連接的至少2個重(H)鏈和2個輕(L)鏈。 每個重鏈由一個重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和一個重鏈恒定區(qū)組成。所述重鏈恒 定區(qū)由3個結(jié)構(gòu)域組成CH1，CH2和CH3。每個輕鏈由一個輕鏈可變區(qū)(在本文中縮 寫為VJ和一個輕鏈恒定區(qū)組成。所述輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL 區(qū)可以進一步細分成超變區(qū)，稱作互補性決定區(qū)(CDRs)，其間間隔有更保守的區(qū)域，稱 作框架區(qū)(FR)。每個Vh和^由3個CDR和4個FR組成，它們從氨基端向羧基端以 下述次序排列FRl，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變 區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子 的結(jié)合，所述因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一 種組分(Clq)。根據(jù)重鏈中恒定結(jié)構(gòu)域的類型，將抗體歸入5個大類中的一個IgA， IgD, IgE, IgG,和IgM，本發(fā)明的實施方案預見到它們中的任一個或下述的抗體亞型和 類型。它們中的幾個進一步分成子類或同種型，例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl, IgA2，IgAsec等。輕鏈可以屬于"κ "或"λ “類別。與不同類別的免疫球蛋白對應(yīng) 的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱作〃 α〃、 “ δ〃、 “ ε〃、 “ Υ〃和〃 μ"。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。經(jīng)常用于生理/臨床情形中的IgG 和/或IgM是用于本發(fā)明的抗體的示例性類別。本發(fā)明的有些實施方案的抗體可以來自任意的哺乳動物來源，包括人、豬、 鼠、牛、山羊、馬、犬、貓、羊等。所述抗體可以是異源抗體。與轉(zhuǎn)基因宿主(例如表 達所述抗體的植物)有關(guān)地定義本文使用的"異源抗體"。根據(jù)本發(fā)明的有些實施方案，所述抗體是分離的完整抗體(即，基本上不含有 細胞物質(zhì)、具有不同抗原特異性的其它抗體和/或其它化學試劑)。本文使用的"重組抗體"是指通過重組方式制備、表達、建立或分離的完整抗 體，例如(a)從免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠) 或源自它的雜交瘤分離的抗體；(b)從轉(zhuǎn)化成表達抗體的宿主細胞分離的抗體；(C)從重 組抗體文庫分離的抗體；和(d)通過任意其它方式制備、表達、建立或分離的抗體，所 述方式包括將免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列剪接。在某些實施方案中，本發(fā)明 的免疫球蛋白可以具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在其它實施方案 中，可以對這樣的重組人抗體進行體外誘變，從而重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序 列包含盡管源自人種系VH和VL序列且與之有關(guān)、但是可能在人抗體體內(nèi)種系庫中天然 地不存在的序列。免疫球蛋白的下面的示例性實施方案包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文使用的"人抗體"是指具有可變區(qū)的完整抗體，在所述可變區(qū)中，框架區(qū) 和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列，后者如例如Kabat等人(參見Kabat 1991， Sequences of proteins of immunological Interest, 5th Ed.NIH Publication No.91-3242)所述。 人抗體的恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋 白序列編碼的氨基殘基(例如，通過隨機的或定向的體外誘變或體內(nèi)體細胞突變引入的 突變)。但是，本文使用的術(shù)語“人抗體"無意包括這樣的抗體，其中源自另一個哺乳動 物物種(例如小鼠)種系的CDR序列已經(jīng)嫁接到人框架序列上。本文使用的"嵌合的免疫球蛋白"是指其中可變區(qū)源自第一個物種且恒定區(qū)源 自第二個物種的完整免疫球蛋白或抗體。通過基因工程，從屬于不同物種的免疫球蛋白 基因節(jié)段，可以構(gòu)建嵌合的免疫球蛋白。本文使用的"人源化免疫球蛋白"是指其中來自非人(例如，鼠)抗體的最小量 小鼠部分移植到人抗體上的完整抗體；一般而言，人源化抗體是5-10%小鼠和90-95% 人。一般而言，人源化抗體基本上包含至少1個、一般2個可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中 所有或基本上所有CDR區(qū)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR區(qū) 是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最佳地還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的 至少一部分，一般是人免疫球蛋白的那種[Jones等人，Nature，321 522-525(1986)； Riechmann 等人，Nature，332 323-329(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol., 2 593-596(1992)] ο對非人抗體進行人源化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。一般地，人源化抗體含 有由非人來源引入其中的一個或更多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為引 入殘基，其一般取自引入的可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以基本上根據(jù)Winter等人[Jones等人，Nature，321 522-525(1986) ； Riechmann 等人，Nature 332 323-327(1988)； Verhoeyen等人，Science，239 1534-1536 (1988)]的方法進行，通過用嚙齒動物的CDRs
或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列。相應(yīng)地，此類人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號 4,816,567)，其中顯著小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域已由來自非人種類的相應(yīng)序列取代。在實 踐中，人源化抗體一般是其中某些CDR殘基和可能的某些FR殘基由來自嚙齒動物抗體 中類似位點的殘基取代的人抗體。人抗體還可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom 和 Winter，J.Mol.Biol.，227 381(1991) ； Marks 等人，J.Mol.Biol.，222 581(1991)] 來生產(chǎn)。Cole等人和Boemer等人的技術(shù)同樣可用于制備人單克隆抗體(Cole等人， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss，第 77 頁(1985)禾口 Boerner 等 人，J.Immunol.，147 (1) 86-95 (1991)。類似地，人抗體還可通過將人免疫球蛋白基 因座引入轉(zhuǎn)基因動物例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因已部分或完全滅活的小鼠中來制備。攻 擊后，觀察到人抗體生產(chǎn)，其在包括基因重排、裝配和抗體文庫的所有方面非常類似人 抗體。這種方法描述在例如美國專利號5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016,以及下列科學出版物Marks 等人，Bio/Technology 10， 779-783(1992) ； Lonberg 等人，Nature 368 856-859(1994) ； Morrison, Nature 368 812-13(1994) ； Fishwild 等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology 14 826(1996)； 禾口 Lonberg 禾口 Huszar, Intem.Rev.Immunol.13, 65-93(1995)中。本文使用的“雙特異性的”或“雙功能的”抗體是指具有2個不同重鏈/輕鏈對 和2個不同結(jié)合部位的人工雜種抗體。通過多種方法，包括雜交瘤融合，可以生產(chǎn)雙特 異性的抗體。參見例如，Songsivilai 和 Lachmann (1"0) Clin.Exp.Immunol.79 315-321 ； Kostelny 等人(I"2) J.Immunol.148 1547-15530從通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)中的任一種生產(chǎn)的抗體，可以得到用于本發(fā)明的 VH和VL序列。生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見例如，Harlow和Lane， Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988,通過
參考引用并入本文)。通常，通過用包含希望的抗原或免疫原的免疫原免疫接種非人動物優(yōu)選小 鼠，提供抗體。或者，通過選擇免疫球蛋白的組合文庫，如例如Ward等人(Nature 341(1989)544)公開的，可以提供抗體。因而，根據(jù)本發(fā)明的教導，預見到任意抗體生產(chǎn) 方法，只要免疫球蛋白抗體最終在細菌宿主中表達。用抗原免疫非人哺乳動物的步驟可以任何本領(lǐng)域公知的方式進行，以刺激在小 鼠中產(chǎn)生抗體(參見，例如，E.Harlow 和 D.Lane，Antibodies A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988))。在一個優(yōu)選的實 施方案中，所述非人動物是哺乳動物，例如嚙齒動物(例如，小鼠，大鼠，等)，牛， 豬，馬，兔子，山羊，綿羊，等。如提及的，可以遺傳地修飾或改造非人哺乳動物，以 生產(chǎn)“人“抗體，例如Xeno小鼠 (Abgenix)或HuMAb-小鼠 (Medarex)。通常，將 免疫原在緩沖液中懸浮或溶解，可選擇地使用佐劑，例如完全弗氏佐劑。用于測定免疫
9原數(shù)量、緩沖液類型和佐劑的量的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且不以任何方 式限制本發(fā)明。對于不同的免疫原，這些參數(shù)可以不同，但容易被說明。類似地，足以刺激產(chǎn)生抗體的免疫接種的位置和頻率也是本領(lǐng)域公知的。在一 種典型的免疫接種方法中，在第一天向非人動物腹膜內(nèi)注射抗原，并且在大約一周后再 次注射。隨后在大約第20天，再次注射抗原，可選擇地使用佐劑，例如不完全弗氏佐 劑。該再次注射于靜脈進行，并且可以重復連續(xù)若干天。然后在第40天進行靜脈內(nèi)或 腹膜內(nèi)加強注射，典型地不用佐劑。這一方法導致在大約40天后產(chǎn)生抗原-特異性的抗 體生成B細胞。也可以利用其它方法，只要它們導致產(chǎn)生這樣的B細胞，其表達針對免 疫接種所使用的抗原的抗體。在一個替代實施方案中，分離來自未免疫的非人哺乳動物的淋巴細胞，在體外 培養(yǎng)，然后在細胞培養(yǎng)物中暴露于免疫原。然后收集該淋巴細胞，并進行下述融合步 馬聚ο對于單克隆抗體，接下來的步驟是，從免疫的非人哺乳動物分離脾細胞，隨后 使這些脾細胞與永生細胞融合，以便形成抗體生成雜交瘤。從非人哺乳動物分離脾細胞 是本領(lǐng)域公知的，并且典型地包括，從被麻醉的非人哺乳動物取出脾，將其切成小片， 并從脾被膜中擠出脾細胞，并通過細胞過濾器的尼龍網(wǎng)篩到適宜的緩沖液中，以便產(chǎn)生 單細胞懸浮液。沖洗細胞，離心，并重懸浮于溶解了任何血紅細胞的緩沖液中。再次將 溶液離心，并且最終將保留在沉淀中的淋巴細胞重懸浮于新鮮的緩沖液中。淋巴細胞一旦被分離并且存在于單細胞懸浮液中，它們將融合成永生細胞系。 盡管本領(lǐng)域已知許多其它用于產(chǎn)生雜交瘤的永生細胞系，其典型地是小鼠骨髓瘤細胞 系。優(yōu)選的鼠骨髓瘤細胞系包括但不限于衍生自MOPC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的細胞 系，其獲得自 Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego, Calif.U.S.A.，X63 Ag8653 和SP-2細胞，其獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)， Rockville, Md.U.S.A。使用聚乙二醇等，實現(xiàn)該融合。然后，生成的雜交瘤在選擇 培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基含有一種或更多種抑制使未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活 的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或 HPRT),雜交瘤的培養(yǎng)基典型地包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，該物質(zhì) 阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。雜交瘤典型地生長于巨噬細胞飼養(yǎng)層上。該巨噬細胞優(yōu)選來自用于分離脾細胞 的非人哺乳動同窩出生仔畜，并且典型地在將雜交瘤鋪板的幾天前用不完全弗氏佐劑等 預處理。融合方法描述于(Goding, “Monoclonal Antibodies Principles and Practice, ” 第 59-103 頁(Academic Press, 1986))。使細胞在選擇培養(yǎng)基中生長充足的時間，以形成菌落并生成抗體。這通常是 7 14天。然后檢測雜交瘤菌落中結(jié)合免疫原/抗原的抗體生成。這一檢測典型地是比 色ELISA-型檢測，盡管可以使用任何適合于雜交瘤所生長的小孔的檢測法。其它檢測 法包括免疫沉淀和放射性免疫測定。檢測產(chǎn)生目的抗體的陽性小孔，以確定是否存在一 種或更多種不同的菌落。如果存在一種以上的菌落，可以重克隆并培養(yǎng)細胞，以保證只 有單一細胞產(chǎn)生該生成目的抗體的菌落。典型地重克隆和重檢測具有單一顯性菌落的陽 性小孔，以保證只有一種單克隆抗體被檢測和生產(chǎn)。
然后在適當培養(yǎng)基例如DMEM或RPMI-1640中，以更大的量培養(yǎng)經(jīng)證實生產(chǎn)單 克隆抗體的雜交瘤?；蛘撸梢宰鳛閯游镏械母顾?，體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細胞。培養(yǎng)足以生產(chǎn)希望的單克隆抗體后，將含有單克隆抗體的生長培養(yǎng)基(或腹 水液)與細胞分離，純化其中存在的單克隆抗體。通常通過凝膠電泳、透析、使用蛋 白A或蛋白G-瓊脂糖或連接到諸如瓊脂糖或瓊脂糖珠子等固體支持體上的抗-小鼠 Ig的色譜法，實現(xiàn)純化(都描述在，例如，Antibody Purification Handbook，Amersham Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC,它的公開內(nèi)容通過參考引用并入本 文)。通常使用低pH緩沖液(pH 3.0或以下的甘氨酸或醋酸鹽緩沖液)，從蛋白A、蛋 白G或蛋白L柱洗脫結(jié)合的抗體，立即中和含有抗體的級分。合并這些級分，透析，并 根據(jù)需要進行濃縮。使用常規(guī)方法(例如，使用寡核苷酸探針，其能與編碼例如鼠或人抗體的重鏈 和輕鏈的基因特異性結(jié)合)，可以容易地將編碼抗體的CDR的DNA分離并測序。一旦 被分離，可以將DNA連接進表達載體中，然后將其轉(zhuǎn)染進細菌宿主細胞。將編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈多肽的DNA序列獨立地插入分開的重組載體中， 后者可以是任意載體，可以方便地進行重組DNA操作，載體的選擇經(jīng)常依賴于要將其導 入的宿主細胞。根據(jù)一個具體實施方案，重鏈和輕鏈編碼序列中的至少一個另外包括治療或可 鑒別部分的框架內(nèi)序列，從而產(chǎn)生免疫毒素(例如，用于治療用途，例如殺傷癌細胞)和 免疫標記(例如，用于診斷用途)。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，重鏈包含該部分 的框架內(nèi)融合，輕鏈包含該部分的框架內(nèi)融合，或重鏈和輕鏈都包含該部分的框架內(nèi)融 合(參見圖5a)。可鑒別部分可以是結(jié)合對的一個成員，其可以通過它與結(jié)合對的另一個成員的 相互作用和直接可見的標記予以鑒別。在一個實施例中，結(jié)合對的該成員是可通過對 應(yīng)的標記的抗體鑒別的抗原。在一個實施例中，所述標記是熒光蛋白或產(chǎn)生比色反應(yīng)的酶。下面的表1提供了可鑒別的部分的序列的實例。表 1
1權(quán)利要求
1.在細菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，該方法包含(a)在第一種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白輕鏈的第一種多肽，從而形成包含 所述免疫球蛋白輕鏈的包涵體；(b)在第二種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白重鏈的第二種多肽，從而形成包含 所述免疫球蛋白重鏈的包涵體；(c)從所述包涵體回收所述第一種多肽和所述第二種多肽，從而得到重建的重鏈和重 建的輕鏈；和(d)在允許所述重建的輕鏈和所述重建的重鏈主要重新折疊為完整免疫球蛋白的條件 下，重新折疊所述重建的重鏈和重建的輕鏈。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述條件包含約1 2的重鏈-輕鏈摩爾比。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種細菌宿主和所述第二種細菌宿主各自是革蘭氏 陰性細菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述革蘭氏陰性細菌是大腸桿菌。
5.權(quán)利要求1的方法，另外包含，在蛋白A/G/L上純化所述免疫球蛋白分子。
6.權(quán)利要求1的方法，其具有每1升重鏈細菌培養(yǎng)物至少50mg純化的免疫球蛋白分 子的產(chǎn)率，在誘導時具有2.5的O.D.600。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種多肽和所述第二種多肽中的至少一種包含治療 部分。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種多肽和所述第二種多肽中的至少一種包含可鑒 別部分。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述主要重新折疊為所述完整免疫球蛋白包含至少80% 的免疫球蛋白作為所述完整免疫球蛋白。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述重鏈屬于Y家族。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述輕鏈屬于K家族。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述輕鏈屬于λ家族。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的方法生產(chǎn)的免疫球蛋白。
14.物質(zhì)組合物，其包含革蘭氏陰性制品殘余物和至少90%免疫球蛋白。
15.權(quán)利要求14的物質(zhì)組合物，其包含不超過10%免疫球蛋白片段。
16.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求14或15的組合物，其中所述免疫球蛋白選自 IgA, IgD, IgE 和 IgG。
17.權(quán)利要求16的方法或組合物，其中所述IgG包含IgGl，IgG2，IgG3或IgG4。
18.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求14或15的組合物，其中所述免疫球蛋白選自嵌 合抗體，人源化抗體和全人抗體。
19.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求14或15的組合物，其中所述免疫球蛋白是雙特異 性抗體。
20.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求14或15的組合物，其中所述免疫球蛋白選自靈 長類動物免疫球蛋白，豬免疫球蛋白，鼠免疫球蛋白，牛免疫球蛋白，山羊免疫球蛋白 和馬免疫球蛋白。
全文摘要
在細菌培養(yǎng)物中生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，該方法包含(a)在第一種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白輕鏈的第一種多肽，從而形成包含免疫球蛋白輕鏈的包涵體；(b)在第二種細菌宿主細胞中表達包含免疫球蛋白重鏈的第二種多肽，從而形成包含免疫球蛋白重鏈的包涵體；(c)從包涵體回收第一種多肽和第二種多肽，從而得到重建的重鏈和重建的輕鏈；和(d)在允許重建的輕鏈和重建的重鏈主要重新折疊為完整免疫球蛋白的條件下，重新折疊重建的重鏈和重建的輕鏈。
文檔編號C07K16/00GK102015770SQ200980115304
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者I·本哈爾, R·哈金 申請人:特拉維夫大學拉莫特有限公司