專(zhuān)利名稱(chēng)：：金屬硫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及金屬硫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：金屬硫蛋白(metallothioneins，MT)是一類(lèi)低分子量(60007000Da)、高Cys含量，具有金屬結(jié)合能力的多肽，廣泛存在于生物界。它具有獨(dú)特的氨基酸排列順序，即多肽的N端和C端具有兩個(gè)富含Cys的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Cyc殘基與許多金屬離子以硫醇鍵形式結(jié)合形成金屬硫的四面體單位。由于MT特有的氨基酸組成與分子結(jié)構(gòu)，它在生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)著重要的生理功能。目前對(duì)植物MT功能的研究還處于起步狀態(tài)，尚無(wú)十分明確的結(jié)論。一般認(rèn)為MT在金屬離子的儲(chǔ)存和運(yùn)輸、重金屬的解毒、維持金屬離子濃度穩(wěn)態(tài)等方面起重要作用。另外，MT還與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎發(fā)生、果實(shí)成熟、衰老等過(guò)程有關(guān)。越來(lái)越多的研究表明MT是植物體內(nèi)重要的氧自由基清除劑之一，能提高植物的抗氧化能力。根據(jù)氨基酸尤其是Cys的排列方式，可以把植物中的MT分為四類(lèi)。I型在根中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部分，II型則剛好相反，集中在葉中表達(dá)。III型主要在成熟果實(shí)中表達(dá)。而IV型迄今為止只在種子中發(fā)現(xiàn)，比如小麥胚芽和芝麻籽。水稻的MT家族包含11個(gè)成員，分別屬于四類(lèi)。除了被各種金屬離子誘導(dǎo)外，其他一些刺激比如蔗糖饑餓、雙氧水和鹽脅迫也能提高水稻MT合成增加。初步研究表明，水稻MT參與了重金屬代謝、種子發(fā)育和抗氧化過(guò)程。水稻是一種重要的糧食作物，是世界上約1/3人口的主要糧食來(lái)源?，F(xiàn)今世界范圍內(nèi)水稻的發(fā)展受到水資源匱乏以及地區(qū)性、季節(jié)性干旱的嚴(yán)重限制，增產(chǎn)潛力受到明顯制約。中國(guó)作為發(fā)展中國(guó)家，飛速發(fā)展的工業(yè)化和城市化進(jìn)程加劇了水資源危機(jī)。另外，由于農(nóng)藥的廣泛使用，大量的汞、鎘、鉛等重金屬造成土壤污染日趨嚴(yán)重。旱災(zāi)及各種污染影響了水稻的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此，對(duì)水稻抗旱、抗金屬毒害等生理進(jìn)行研究，以期提高其抗旱等抗逆能力，顯得十分必要。作物抗旱等非生物逆境研究是植物研究領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)性的工作之一。選擇合適的研究材料是關(guān)鍵的第一步。陸稻原產(chǎn)于巴西，又稱(chēng)巴西旱稻。一般認(rèn)為，旱稻是由水稻演變而來(lái)的適于旱地栽培的“土地生態(tài)型”，因而陸稻的抗旱性比水稻強(qiáng)。陸稻與水稻的親緣性很近。比起遠(yuǎn)緣的雙子葉植物比如擬南芥等，從陸稻研究中得到的功能基因應(yīng)用于水稻抗旱實(shí)踐更具效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種金屬硫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的金屬硫蛋白，命名為OsMTla，來(lái)源于巴西旱稻，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸由a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使a)的OsMTla蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述b)中的OsMTla蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述b)中的OsMTla蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白的編碼基因是如下1)或2)或3)1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA片段雜交且編碼金屬硫蛋白的DNA分子；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且編碼金屬硫蛋白的DNA分子。所述步驟3)中的基因，與1)的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在68°C下雜交，然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC，0.SDS各洗膜一次。擴(kuò)增OsMTla基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述OsMTla基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有OsMTla基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301_UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。攜帶有本發(fā)明的OsMTla基因的植物表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。使用OsMTla基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、泛生素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的OsMTla基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物的方法，是將所述的OsMTla基因?qū)胫参镏校玫娇购的芰μ岣吆?或鋅含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可以為各種單子葉或雙子葉植物，如棉花、小麥或者水稻等。本發(fā)明通過(guò)SSH(抑制消減雜交)的方法從鹽脅迫的巴西旱稻中克隆得到一個(gè)I型的金屬硫蛋白OsMTla。轉(zhuǎn)OsMTla基因酵母和水稻中的微量元素鋅的累積提高，并且轉(zhuǎn)OsMTla基因水稻的抗氧化及耐逆性能提高。本發(fā)明的金屬硫蛋白OsMTla可用來(lái)培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。圖1為Northern雜交分析日本晴中OsMTla的表達(dá)。圖2為金屬處理的巴西旱稻中OsMTla的表達(dá)。圖3為非生物脅迫處理的巴西旱稻中OsMTla的表達(dá)。圖4為300mM甘露醇處理的野生型日本晴(WT)和轉(zhuǎn)OsMTla基因水稻表型變化及失水率測(cè)定。圖5為CAT、APX和POD活性測(cè)定結(jié)果。圖6為轉(zhuǎn)OsMTla基因株系中Ossiz的表達(dá)。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、金屬硫蛋白(OsMTla)基因的應(yīng)用DOsMTla基因的克隆以鹽處理和未處理的巴西旱稻為材料，利用消減抑制雜交的方法，直接從旱稻中分離了94個(gè)鹽誘導(dǎo)基因。其中一個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)222bp，編碼74個(gè)氨基酸，在N端和C端分別有六個(gè)半胱氨酸位于保守的位置，還有大約40氨基酸的spacer區(qū)，其中包含芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸，這是I型植物MT蛋白的典型特征，將其命名為OsMTla。OsMTla蛋白與其他單子葉植物I型MT蛋白都有較高的相似性，比如玉米(73.7%)，大麥(67.6%)。分別取日本晴植株根、葉、花以及幼苗部分，按文獻(xiàn)(Chomczynski，P.andSacchi,N.(1987)Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.AnalBiochem,162,156-159.)方法提取RNA,以O(shè)sMTla全長(zhǎng)cDNA為探針進(jìn)行Northern雜交分析。Northern雜交結(jié)果如圖1所示，表明OsMTla在水稻的根、花、葉、幼苗均有表達(dá)，其中在根中表達(dá)量最高。圖1中，“1”代表花、“2”代表葉、“3”代表幼苗、“4”代表根。巴西旱稻種子在37°C浸種兩天，露白后鋪在放有兩層紗布的平皿上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C，持續(xù)光照強(qiáng)度為25001UX，光周期為16/8h。培養(yǎng)兩周后取幼苗進(jìn)行處理。金屬處理分別用10μMZnCl2,CuCl2^MnCl2和FeCl3溶液處理24小時(shí)。非生物脅迫處理分別用150mMNaCl,7%PEG6000和10μMABA溶液處理24小時(shí)。檢測(cè)金屬處理1、6、12和24小時(shí)和非生物脅迫處理0、0.5、6和24小時(shí)OsMTla的表達(dá)。提取各個(gè)處理不同時(shí)間的巴西旱稻的總RNA，用Promega公司的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄后利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)，根據(jù)廠家(Bio-Rad)提供的使用方法，在PCR體系中加入SYBRgreenI熒光染料，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上檢測(cè)OsMTla的表達(dá)模式。用水稻ACTim基因表達(dá)水平做內(nèi)參。擴(kuò)增OsMTla的引物分別為上游引物5，-GAAGATGTCTTGCAGCTGTGGAT-3，，下游引物5，-AGATGGTAGATGCAGGCAGGC-3，。同時(shí)，以O(shè)sMTla全長(zhǎng)cDNA為探針進(jìn)行Northern雜交分析。金屬處理的實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果如圖2所示，表明10μM的Zn能誘導(dǎo)OsMTla的表達(dá)上調(diào)，同樣濃度的Mn、Fe、Cu不能誘導(dǎo)OsMTla的表達(dá)上調(diào)。圖2中，A為10μΜMn2+、Fe3+、Cu2+處理O24小時(shí)OsMTla表達(dá)變化；B為10μMZn2+處理024小時(shí)OsMTla表達(dá)變化。非生物脅迫處理的實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果如圖3所示，OsMTla受到滲透脅迫、鹽脅迫以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，其中滲透脅迫的誘導(dǎo)最為明顯。設(shè)計(jì)正反向引物，利用PCR方法從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出OsMTla基因，并在正反向引物末端分別添加限制性酶EcoRI和BamHI的酶切位點(diǎn)。正向引物為5，-GAATTCGAAGATGTCTTGCAGCTGTG-3；反向引物為5，-GGATCCGCAGGCAGGCATCTTA-3，。PCR產(chǎn)物回收后連接入pMD18-T(TAKARA，大連)中進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，編碼序列表中序列2所示的蛋白。2)培育抗旱和/或鋅含量提高的水稻用EcoRI與BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切的雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300-pUbiquitin-0CS(購(gòu)自Cambia，澳大利亞，http//www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)連接，得重組表達(dá)載體pCAMBIA2300-pUbiquitin-0sMTla_0CS。將載體pCAMBIA2300-pUbiquitin-0sMTla_0CS通過(guò)農(nóng)桿菌AGLl(購(gòu)自ATCC(AmericanTypeCultureCollection))導(dǎo)入到水稻日本晴愈傷組織中。轉(zhuǎn)化篩選方法參考如下文獻(xiàn)易自力，曹守云，王力，何鍶潔，儲(chǔ)成才，唐祚舜，周樸華，田文忠(2001)提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究，遺傳學(xué)報(bào)，28(4):352-358)。獲得抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)OsMTla基因水稻Ttl代株系共10株。分別取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)同一時(shí)期的野生型日本晴(WT)6株和轉(zhuǎn)OsMTla基因植株(L6和L7各6株)葉片及收割后去掉谷殼的種子進(jìn)行金屬含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測(cè)定方法如下材料洗凈后，經(jīng)過(guò)烘箱80°C徹底干燥24小時(shí)后，磨碎，進(jìn)行微波消解。每200mg加9mlHNO3>2mlH2O2在180°C消解20min，冷卻后開(kāi)蓋，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中加超純水定容，搖勾。禾U用InductivelyCoupledPlasma-OpticalEmissionSpectroscopy(ICP-OES)電感耦合等離子發(fā)生光譜(0ptima-2000DV，PerkinElemer,USA)進(jìn)行相關(guān)重金屬含量的測(cè)定。葉片及種子中金屬含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示。表1.葉片及種子中金屬的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1中金屬含量的單位為(yg/g干重)，**代表通過(guò)t檢驗(yàn)得出轉(zhuǎn)基因株系和野生型有顯著性差異的置信概率為99%。表1表明，兩個(gè)轉(zhuǎn)OsMTla基因株系L6和L7中，Mn和Zn的積累都有所提高，而Zn的提高是顯著性的，比野生型分別提高了45.38%和54.15%。在種子中也有相同的趨勢(shì)，Zn的積累最為明顯，L6和L7分別比野生型提高44.43%和53.93%。因此，OsMTla基因可用于提高作物中的微量元素鋅的累積。將生長(zhǎng)兩周的野生型日本晴(WT)10株和轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7各10株)水稻幼苗轉(zhuǎn)移至含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，觀察對(duì)比表型變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表型變化結(jié)果如圖4A所示，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行300mM甘露醇處理兩周后，可以看到野生型葉片極度卷曲、發(fā)黃、萎縮，幾近枯死；而轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7)表現(xiàn)較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，葉片微卷、葉尖發(fā)黃，主體仍顏色鮮綠。取在溫室中于大小體積相等的花盆中生長(zhǎng)兩個(gè)月的野生型日本晴(WT)5株和轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7各5株)約IcM長(zhǎng)樣段迅速稱(chēng)取0.5g置于室內(nèi)桌面，室溫下每隔5-10分鐘稱(chēng)重一次，直至一個(gè)小時(shí)。利用以下公式計(jì)算失水率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>失水率結(jié)果如圖4B所示，轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7)的葉片一小時(shí)后失水率滯后于野生型3.75%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OsMTla過(guò)表達(dá)株系比野生型具有更好的抗旱性。用EcoRI與BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切的ρ18IAINE載體(ρ18IAINE載體構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)Vernet，T.，Dignard，D.andThomas,D.V.(1987)，Afamilyofyeastexpressionvectorscontainingthephagef1intergenicregion,Gene52,225-233;RiesmeierJW,WillmitzerL,FrommerWB(1992),IsolationandcharacterizationofasucrosecarriercDNAfromspinachbyfunctionalexpressioninyeast.EMBOJ114705-4713；DaramP,BrunnerS,PerssonBL,AmrheinN,BucherΜ.(1998)，F(xiàn)unctionalanalysisandcell-specificexpressionofaphosphatetransporterfromtomato.Planta206:225_233.)(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)連接，獲得重組載體P181AINE:OsMTla,將pl81AINE:OsMTla和pl81AINE分別轉(zhuǎn)化酵母BY4741(MATAhis3leu2metl5ura3)(購(gòu)自Euroscarf，目錄號(hào)Y00000)。在SD/Leu(_)缺陷固體培養(yǎng)基上于30°C生長(zhǎng)2-3天，長(zhǎng)出的克隆為帶plSlAINE-leu標(biāo)簽的陽(yáng)性克隆。再以5，-GAAGATGTCTTGCAGCTGTGGAT-3，和5，-AGATGGTAGATGCAGGCAGGC-3，為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出253bp的片段鑒定轉(zhuǎn)P181AINE:OsMTla陽(yáng)性克隆。每升SD/leu(-)缺陷液體培養(yǎng)基YNB酵母氮源(無(wú)氨基酸、硫酸銨)1.7g、硫酸銨5g、營(yíng)養(yǎng)缺陷混合物(Drop-outMix)1.4g、葡萄糖20g、L-Trp,L-His和Uracil各20mg，加水至IL滅菌。每升SD/leu(-)缺陷液體培養(yǎng)基中加入20g瓊脂粉得到SD/leu(-)缺陷固體培養(yǎng)基。其中YNB、Drop-outMiχ、L-Trp、L-His、Uracil均購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)分別為Y1251、Y2001、T0254、H8000、U0750。將pl81AINE:OsMTla陽(yáng)性克隆與空載體pl81AINE陽(yáng)性克隆于SD/Leu_缺陷液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期，然后加入ImMZnCl2溶液，經(jīng)過(guò)10小時(shí)處理后收菌、干燥后進(jìn)行金屬含量測(cè)定，每個(gè)樣品取三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。金屬含量的測(cè)定結(jié)果如表2所示。表2.酵母中金屬的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2中星號(hào)**代表通過(guò)t檢驗(yàn)得出轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照有顯著性差異的置信概率為99%，表中金屬含量的單位為(yg/g干重)。表2的結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)OsMTla的酵母細(xì)胞在非Zn處理的普通狀態(tài)下，能夠比對(duì)照多吸收19.2%的Zn；而在ImMZn處理?xiàng)l件下，能比對(duì)照多積累1.4倍的Zn，顯著地提高對(duì)Zn的吸收。OsMTla蛋白可能參與了水稻體內(nèi)Zn離子的代謝過(guò)程。3)轉(zhuǎn)OsMTla基因植株抗氧化酶活測(cè)定生長(zhǎng)兩周的野生型日本晴(WT)IO株和轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7各10株)水稻幼苗用ImM雙氧水處理5小時(shí)，分別取0.5g葉片，加入預(yù)冷的酶提取液(IOOmMTrisHCl(ρΗ7·0)，20%甘油，PVP)，研磨至勻漿；4°C,IOOOOg離心30分鐘；上清為粗酶提取液。測(cè)定APX時(shí)，在上述提取液中加ImMAsA。CAT,APX和POD活性參照Rahnama和Ebrahimzadeh(2005)的方法測(cè)定(RahnamaHandEbrahimzadehH(2005),TheeffectofNaClonantioxidantenzymeactivitiesinpotatoseedlings,BiolPlant49，pp.93—97.)。CAT活性用ΔA240mg-lproteinmin_l表示；APX活性用AA265mg-lproteinmin-l表示；POD活性用ΔA53ciIiig-1Proteinmirr1表示。不同波長(zhǎng)下的吸光度變化用美卡西斯0PTIZEN-2120UV分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定。蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照(Bradford，Μ.Μ.(1976)Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72，248-254.)的方法。每個(gè)樣品取三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ImM雙氧水處理5小時(shí)前后水稻葉片內(nèi)抗氧化物酶CAT、P0D和APX的酶活變化如圖5所示，說(shuō)明轉(zhuǎn)OsMTla基因植株的CAT，POD,APX酶活相比野生型都有不同程度的提高；L7的CAT酶活比WT提高81%，POD酶活比WT提高32%，APX酶活比WT提高17%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)OsMTla能提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的效率。圖5中星號(hào)*和**代表通過(guò)t檢驗(yàn)得出轉(zhuǎn)OsMTla基因株系與野生型之間存在顯著性差異的置信概率分別為95%和99%。4)OsMTla提高植物抗逆性的機(jī)理為了獲得準(zhǔn)確的耐逆性機(jī)理信息，選取了報(bào)道已知受到干旱脅迫誘導(dǎo)的三個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZFl(AccessionNo.AF332876)、WRKY71(AccessionNo.NM_001052629)(Takatsuji,H.(1999).Zinc-fingerproteins:theclassicalzincfingeremergesincontemporaryplantscience.PlantMol.Biol.39,1073-1078；Segal,D.J.,Stege,J.Τ.,andBarbas,C.F.,III(2003).Zincfingersandagreenthumb!manipulatinggeneexpressioninplants.Curr.Opin.PlantBiol.6,163-168)禾口Ossiz(AccessionNo.AK108249)(ffu,Y.R.，Wang,Q.Y.，Ma,Y.M.，andChu,C.C.(2005).Isolationandexpressionanalysisofsaltup-regulatedESTsinuplandriceusingPCR-basedsubtractivesuppressionhybridizationmethod.PlantSci168,847—853.),比較它7[門(mén)在野生型與轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)量差別。提取生長(zhǎng)兩周的野生型日本晴(WT)和轉(zhuǎn)OsMTla基因(L6和L7)水稻幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行real-timePCR分析。引物分別為ZFl上游引物5，-TTGTGAATTGCGGTGGAAGC-3‘；下游引物5，-GGCTTCTTGAAGGCGAGGG-3，。WRKY71上游引物5，-CGAGGAGTGCAAGCCCAAGAT-3，；下游引物5，-AATCCTTGGTCGGCGAGAGCT-3，。Ossiz上游引物5，-GCACCATGGCGAGCCGAGAG-3，；下游引物5，-AGGATCCCGGGTGCTTCTACATCACAAGC-3，。轉(zhuǎn)OsMTla基因株系中三個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子0ssiz、ZFl、WRKY71的相對(duì)表達(dá)量如圖6A所示，在OsMTla過(guò)表達(dá)植株中幾個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)上調(diào)；CCCH家族的Ossiz，C2H2家族的ZF1，WRKY家族的WRKY71分別上調(diào)了約10倍、5倍和3倍。選擇Ossiz上調(diào)最明顯的OsMTla過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行Northern雜交。以O(shè)sMTla和Ossiz全長(zhǎng)cDNA為雙探針進(jìn)行Northern雜交分析。圖6B所示是Northern檢測(cè)轉(zhuǎn)OsMTla基因株系中Ossiz的表達(dá)結(jié)果。在過(guò)表達(dá)OsMTla的植株中檢測(cè)到了Ossiz的積累。這說(shuō)明Ossiz位于OsMTla的下游。而且Ossiz同OsMTla—樣，也能受到Zn的誘導(dǎo)。圖6C所示是10μMZn2+處理024小時(shí)Ossiz表達(dá)變化。上述結(jié)果表明，金屬硫蛋白OsMTla—方面可能通過(guò)感應(yīng)Zn濃度變化來(lái)響應(yīng)外界脅迫，通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的效率來(lái)清除自由基，并提高植物的抗旱功能。此外在對(duì)外界脅迫的應(yīng)答過(guò)程中，OsMTla能夠向一些鋅指的轉(zhuǎn)錄因子，比如Ossiz直接或間接地提供Zn離子，協(xié)同作用來(lái)傳導(dǎo)抗逆信號(hào)，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，最終提高植物抗逆性。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>金屬硫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用<130>CGGNARW92095<160>2<210>1<211>222<212>DNA<213>稻屬陸稻(Oryzaglaberrima)<400>1atgtcttgcagctgtggatctagctgcagctgcggctcaaactgctcctgcggaaagaag60taccctgacctggaagagaagagcagcagcaccaaggccaccgtcgtgctgggtgtggcg120ccggagaagaaggcgcagcagtttgaggcggccgcagagtccggcgagaccgcccatggc180tgcagctgcggttccagctgcaggtgcaacccttgcaactgt222<210>2<211>74<212>PRT<213>稻屬陸稻(Oryzaglaberrima)<400>2MetSerCysSerCysGlySerSerCysSerCysGlySerAsnCysSer151015CysGlyLysLysTyrProAspLeuGluGluLysSerSerSerThrLys202530AlaThrValValLeuGlyValAlaProGluLysLysAlaGlnGlnPhe354045GluAlaAlaAlaGluSerGlyGluThrAlaHisGlyCysSerCysGly505560SerSerCysArgCysAsnProCysAsnCys6570權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸由a)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)其核苷酸序列是序列表中序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA片段雜交且編碼金屬硫蛋白的DNA分子；3)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性，且編碼金屬硫蛋白的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6.一種培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)胫参镏?，得到抗旱能力提高?或鋅含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)及其任意片段的引物對(duì)。8.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體、權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種金屬硫蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白質(zhì)是序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；該蛋白可用于培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種培育抗旱能力提高和/或鋅含量提高的植物的方法，是將所述基因?qū)胫参镏校玫娇购的芰μ岣吆?或鋅含量提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的金屬硫蛋白及其編碼基因?qū)r(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。文檔編號(hào)C07K14/825GK101817879SQ200910078200公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2009年2月26日優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日發(fā)明者儲(chǔ)成才,吳耀榮,楊昭申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所