專利名稱:用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的組合物,尤其涉及一種用于斑點(diǎn)金免疫 滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物,實(shí)現(xiàn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確 檢測。
背景技術(shù):
臨床上自身免疫疾病主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、皮肌 炎、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)(多發(fā))性硬化癥、硬皮病等,這些疾病曾被命名為“結(jié)締組織病”,后 來國外和國內(nèi)均將它們歸為風(fēng)濕性疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種較常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為 主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫疾病,其病程長,多反復(fù),且會造成組織不可逆的損傷,而給患 者造成很大痛苦。該病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為0.5-1%,中國的發(fā)病率約為0.36%?;?者發(fā)病年齡多在20 50歲,女性多于男性,男女之比為1 3。最近流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎有逐年增加的趨勢,其突出的早期臨床表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)紅腫熱痛、常見四肢小關(guān) 節(jié)、指間近端關(guān)節(jié)腫脹、掌指、腕、肘和踝等關(guān)節(jié)腫痛及活動困難、晨間關(guān)節(jié)僵硬、午后逐漸 減輕、關(guān)節(jié)外癥狀約有20%患者可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié);長久不愈的晚期癥狀則有不同程度的關(guān) 節(jié)畸形和強(qiáng)直,以及關(guān)節(jié)功能喪失等現(xiàn)象,還會損傷臟器和多組織器官,造成骨頭缺血性壞 死,對人體消耗大,致殘率高。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因至今尚不十分清楚,且早期臨床表現(xiàn)也不典型。在國 內(nèi)外臨床實(shí)踐中,該疾病的常用診斷工具是美國風(fēng)濕學(xué)學(xué)會(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的類風(fēng)濕分類標(biāo)準(zhǔn)(Arthritis Rheum 1988,31, 315-24),該標(biāo)準(zhǔn)更依賴于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所表現(xiàn)出的臨床病癥。但是,在該疾病早期,這些臨 床指標(biāo)通常是不易操作的。因此,目前普遍認(rèn)為這一標(biāo)準(zhǔn)不能較好適應(yīng)于早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎的診斷(Arthritis Rheum 2001,44,2485-91 ;Neth J Med 2002,60,383-8)。而目前使用 的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法主要是采用消炎方法,這種方法雖能使得關(guān)節(jié)腫脹(swelling) 和侵蝕(erosive)的程度得以減慢,卻無法使疾病得到治愈。當(dāng)前人們共同的觀點(diǎn)認(rèn)為, 在該疾病早期采用多種方法治療能得到最佳的治療效果(Autoimmunity Reviews 2006,6, 37-41)。由此,具有高專一性(Specificity)和高靈敏度(Sensitivity)的血清學(xué)檢測標(biāo) 記對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在骨關(guān)節(jié)遭受損傷之前的早期診斷就顯得尤為必要(Clin Applied Immunol Rev 2004,4,239—62)。研究發(fā)現(xiàn)一些自身免疫抗體雖然與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相聯(lián)系,如抗 calpastatin 抗體(Proc Natl Acad Sci USA 1995,92,7267-71)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, AN CA)(IntArch Allergy Immunol 1996, 109,201-6)、核抗原抗體(anti-nuclearantigens,ANA) (Scand J Rheumatol 1986,15, 185-92)、抗 II 型膠原抗體(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001,247,191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸異構(gòu)酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase, anti-GPI) (Nat Immunol 2001,2,746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中,甚至于在健 康個(gè)體中檢測出來(Clin Applied Immunol Rev 2004,4,239-62)。其中的某些抗體雖 然能應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病的識別,而且篩選這些抗體也有助于疾病監(jiān)測和預(yù)測,但由于其對 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎缺乏專一性,這些抗體中的絕大多數(shù)都很少應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷 (Clinica Chimica Acta 2004,350,17-34)。對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期診斷的理想標(biāo)記(Marker)應(yīng)當(dāng)至少滿足4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(1)高 靈敏度,能檢測的病人達(dá)到高百分比;(2)高專一性,盡可能地限制錯誤陽性結(jié)果的發(fā)生; (3)能適用于早期診斷;(4)能預(yù)見到某些病人會發(fā)展成侵蝕性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006,6,37-41 ;MEDICINE 2006,34,441-4)。類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)抗體作為血清學(xué)檢測方法應(yīng)用于ACR標(biāo) 準(zhǔn)中,被公認(rèn)為是IgG分子上Fc結(jié)構(gòu)域的直接抗體。雖然其檢測靈敏度范圍可以達(dá)到 60-80%,但其對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性也比較一般,為60%。此外,RF同樣可以在其 它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5 %健康人群中(其中 10-30% 的老年人)檢測到(Ann Rheum Dis 2003,62,261-3)。抗BiP(p68)抗體,抗Sa抗體和抗環(huán)狀胍氨酸化蛋白抗體(APF、AKA、抗fiIaggrin 和抗CCP)則對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有更高的專一性。64%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人能產(chǎn)生直接針對 BiP的抗體,還有報(bào)道稱其對該疾病具有高度的專一性,但目前沒有數(shù)據(jù)支持BiP在預(yù)測類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面具有作用,而且這些報(bào)道的BiP抗體還需要等待進(jìn)一步通過獨(dú)立的臨床研 究加以確認(rèn)(Clinica Chimica Acta 2004,350,17-34)??筍a抗體是源自于人脾臟和胎盤 的提取物當(dāng)中,分子量為50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005,44,1122-6)。另有研究 揭示Sa抗原對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的專一性可以高達(dá)92-99%,但其靈敏度則顯得一般,僅為 30-40% (J Rheumatol 1994,21,1027-33 ;J Rheumatol 1999,26,7-13)??购酥芤蜃?antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。經(jīng)研究這些自 身免疫抗體對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性,并能通過以人頰粘膜細(xì)胞為抗原底物的免疫熒光 法間接測得(Ann Rheum Dis 1964,23,302-5)。1979年研究者描述了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎專一性角質(zhì)蛋白抗體,它能直接抑制 角質(zhì)層上皮細(xì)胞角質(zhì)化,并將這類抗體的名稱暫定為抗角質(zhì)蛋白抗體(anti-keratin andtibody,AKA) (BMJ 1979,2,97-9)。之后的研究證實(shí),雖然AKA和APF的發(fā)現(xiàn)是互相 獨(dú)立的,但是兩者所直接對應(yīng)的抗原是一致的(J.Clin. Invest 1995,95,2672-9)。許多 研究進(jìn)一步表明AKA和APF具有許多共同的特性,它們均對于RA患者表現(xiàn)出高度的專一 性(Internal Medicine 2005,44,1122-6)。Filaggrin(filamentaggregating protein) 是一種互相交聯(lián)的角蛋白絲狀體,作用是形成非常堅(jiān)固的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),其也是AKA和 APF 的常見抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004,4,239-62)。其中,APF 的目標(biāo)抗原為 profilaggrin,而 AKA 的抗原為 filaggrin(J Clin Invest 1995,95,2672-9)。雖然AKA和APF對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有專一性,但其缺陷也很突出。這兩種抗體 的檢測靈敏度嚴(yán)重依賴于filaggrin的純化方法。實(shí)踐中,由于難以分離得到純的且胍基 含量具有可重復(fù)性的抗原,再加上其檢測手段不簡便,以及熒光免疫檢測過程需要耗費(fèi)較 大的工作量,從而使得實(shí)驗(yàn)室間難以形成標(biāo)準(zhǔn)化,導(dǎo)致AKA和APF沒有成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎檢測的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004,4,239-62)?;趂ilaggrin和profiIaggrin是AKA和APF抗體靶點(diǎn)的知識,人們合成了 含有瓜氨酸的多肽以檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中AKA和APF抗體的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而無法在蛋白質(zhì)翻譯中加入,因此通常的方法是通過肽精氨酸脫亞胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3. 5. 3. 15)催化精氨酸殘基脫氨基得到。根據(jù)這 些事實(shí),一些從filaggrin序列中衍生出來的精氨酸側(cè)鏈經(jīng)修飾的,尤其是含有瓜氨酸的 多肽被合成出來,并用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體的體外檢測(US6,858,438)。在用酶聯(lián)免疫吸 附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法檢測實(shí)驗(yàn)中,這一方法合成的含有 瓜氨酸直線性多肽能從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中檢測出抗瓜氨酸肽抗體,在保持高專一性 (大于90%)的情況下,還大大提高了檢測的靈敏度(達(dá)到63%)。實(shí)驗(yàn)還證明,只有含 瓜氨酸的多肽才能實(shí)現(xiàn)該反應(yīng),若將多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替則完全沒有反應(yīng)發(fā) 生。這些結(jié)果表明,瓜氨酸部分是決定能被AKA和APF抗體識別的抗原決定因子(J Clin Invest 1998,101,273-81)。其它研究者發(fā)現(xiàn)將含有瓜氨酸的直線性多肽通過二硫鍵(S-S鍵)形成環(huán)形結(jié)構(gòu) 的方式能模擬類似轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),從而模仿最初抗原決定簇的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),并可增加多 肽-抗體的親和力(FASEB J 1995,9,37-42 ;Mol Immunol 1985,22,1255-64)。由此,一 種環(huán)狀肽被人工合成出來,其將filaggrin主要表位上的兩個(gè)絲氨酸換成半胱氨酸后,再 由二硫鍵環(huán)化形成,即第一代環(huán)瓜氨酸肽(the first generation cycliccitrullinated peptide, CCP1) (Internal Medicine 2005,44,1122-6)。研究者將一條由 19 個(gè)氨基酸殘 基組成的瓜氨酸肽中兩個(gè)絲氨酸替換為半胱氨酸形成與β“轉(zhuǎn)角具有相似結(jié)構(gòu)的二硫鍵, 得到人工合成CCP,并將CCPl與直線肽的檢測結(jié)果作了比較。結(jié)果顯示,采用CCPl為抗原 的多肽用ELISA法檢測RA患者的抗CCP抗體,靈敏度較用直線性瓜氨酸肽為抗原有顯著提 高,分別為68%和49%,二者專一性相似(Arthritis Rheum2000,43,155-63)。穆榮等人 在266例RA患者和186例對照者血清中檢測RF和AKA抗體、APF和抗CCP抗體的方式,評 估了抗聚絲蛋白抗體群(anti-filaggrin antibodies,AFAs)與RF聯(lián)合檢測的意義。由于 AKA和APF的敏感性太低,臨床上以RF和抗CCP抗體的聯(lián)合測定更為實(shí)用(北京大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版)2005,37,894)。研究還發(fā)現(xiàn),通過檢測抗CCP抗體還能作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期病 人一項(xiàng)重要指標(biāo),為這類人群的早期防治提供參考(J India Rheumatol Assoc 2004,12, 143-6),其還能預(yù)測侵蝕性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004,4,239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反應(yīng)模式中,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清檢測表現(xiàn)出巨大的可變 性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清/血漿中除了 filaggrin精氨酸殘基被瓜氨酸化外,Sa抗原、 膠原蛋白(I和II型)、組蛋白、髓磷脂堿蛋白、纖維連接蛋白等也出現(xiàn)瓜氨酸化,并產(chǎn)生抗 CCP抗體。深入研究表明,瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脫氨基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸;已 瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全參與形成抗原表位,即產(chǎn)生抗CCP抗體。綜上,抗瓜氨酸抗體 的產(chǎn)生與瓜氨酸密切相關(guān),并且瓜氨酸的側(cè)翼序列對抗瓜氨酸抗體的產(chǎn)生起重要作用,這 一事實(shí)暗示著瓜氨酸殘基的周邊氨基酸對于抗原表位(antigen episode)具有重要作用, 以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗體)活性是多克隆反應(yīng)(J Clin Invest 1998, 101,273-81).基于filaggrin的屬性,它被認(rèn)為是模擬瓜氨酸抗原表位的天然庫藏(Clin Applied Immunol Rev 2004,4,239—62)。
第二代CCP(CCP2)檢測方法產(chǎn)生于2002年,通過將含有瓜氨酸的多肽庫與類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎血清篩選得到與filaggrin無關(guān)的第二代CCP,其具有更有利于抗體檢測的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies. Lengerich, Germany :Pabst Science Publishers ;2000. p. 140-5)。將CCPl和CCP2經(jīng)同一組病人測試后表明,CCP2不僅 保持了較高專一性(96% ),而且其分析靈敏度也有顯著的提高(Arm. Rheum. Dis. 2005,64, 1510-2)。許多研究者在最近5年的研究證明,抗含瓜氨酸多肽的測試的靈敏度具有較高的 可變性,范圍在 40% -94% (Clin. ExpRheumatol. 2005, 23 (Suppl39), 569-76 ;Ann. Rheum. Dis. 2006,65,845-51)。CCP2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身免疫抗體體外檢測中得到應(yīng)用說明了在 該領(lǐng)域的檢測抗原的篩選并不需要僅僅依賴filaggrin,也說明與filaggrin不同的結(jié)合 表位能更有利于體外檢測。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007,53,1527-33)和 Lutteri L 等人(Clinica Chimica Acta 2007,386,76-81)分別針對現(xiàn)在市場上使用的第二代和第三代CCP試劑盒 (Kit)進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),伊諾瓦診斷(InovaDiagnostics)公司開發(fā)的三種檢測方法 中,其CCP3試劑盒與使用CCP2為抗原的方法相比僅僅略有改善,各自的靈敏度分別為67 % 和64%。相反地,用于抗IgG的CCP3. 0與即能檢測IgG又能檢測IgA的CCP3. 1的檢測方 法相比后發(fā)現(xiàn),兩者竟然沒有絲毫差別??梢?,同時(shí)檢測IgG和IgA抗體的方法并沒有象看 上去那樣有顯著改進(jìn)。他們的結(jié)論是由于測試的診斷試劑盒靈敏度可能與胍基化精氨酸殘 基的位置和數(shù)量有關(guān),而專一性則可能受到蛋白質(zhì)或雜多肽序列的影響,因此,對此二者而 言,抗原的種類顯得更為重要。兩者綜合考慮,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明抗原的制備是決定測定方法優(yōu) 劣的最重要的可變因素。Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007,386,76-81)的研究還發(fā)現(xiàn)了抗CCP 的另一個(gè)價(jià)值,他們指出,IgM-RF是最靈敏的標(biāo)記,能在77. 9%的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā) 現(xiàn)。必須注意的是,作為ACR標(biāo)準(zhǔn)中的RF,其類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷中靈敏度不能直接與那些沒 有包括在診斷標(biāo)準(zhǔn)中的其它方法相比較。IgM-RF被認(rèn)為在疾病專一性方面略有欠缺。使用 IgM-RF檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者,其中有13-19%的人為RF陰性,與之相比,當(dāng)這些患者使用 抗CCP方法檢測時(shí)均為陽性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素會影響瓜氨酸化蛋白的出現(xiàn)和產(chǎn)生,也會影響針對這 些修飾蛋白的抗體產(chǎn)物(Clinica Chimica Acta 2004,350,17-34)。一系列相關(guān)研究表 明,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與某些HLA-DR等位基因有密切聯(lián)系,尤其是HLA-DRB 1*0401和HLA-DRB 1*0404 (Cell 1996,85,307-10)。與相應(yīng)的含有精氨酸的多肽相比,將多肽瓜氨酸化就能 與 HLA-DRB 1*0401 和 HLA-DRB 1*0404 兩種“袋形”抗原更好地結(jié)合(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6)。在不同地區(qū)的人群中,這些等位基因也略有不同。DRB1*0401主 要出現(xiàn)在北歐和北美地區(qū)的人群中,有證據(jù)表明該基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所導(dǎo)致的“特大關(guān) 節(jié),,表征(extraarticular manifestations)有聯(lián)系,在 DRB1*0401/DRB1*0404 雜合基因 型中尤為突出。DRB1*0403、DRB1*0406 和 DRB1*0407 與 DRB1*0401、*0404 或 *0101 基因 組合后會增加類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)展可能。DRB1*0404與DRB1*0408只要存在于白色人 種中。DRB1*0405很少在北歐人群中,但在亞洲和環(huán)地中海沿岸國家的人群中極其普遍。 DRB1*0101主要存在于北歐和北美人群中。美洲印第安人群中則為DRB1*1402和*1406 (Hum Immuno 2000,61,1254-1261)。雖然這些與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因在各地區(qū)人群中各有不同,但研究發(fā)現(xiàn)在DRBl的第三高度可變區(qū)(HV3)具有共享表位(shared印itope,SE),在 70-74 位氨基酸殘基都為 QKRAA、QRRAA 或 RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004,350,17-34)。將一群有幾個(gè)共享表位基因型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者與具有抗CCP2抗體的患 者比較研究表明,一種共享表位等位基因與抗CCP2抗體的產(chǎn)生具有密切的內(nèi)在聯(lián)系 (Arthritis Rheum 2000,50,2113-21 ;Arthritis ResTher 2004,6,R303-8)。經(jīng)證實(shí),這一 關(guān)聯(lián)是由于MHC分子共享表位β鏈的70-74位氨基酸殘基(Q/R,K/R,R,A,A)形成第4個(gè) 錨定袋(P4),其與電中性或負(fù)電荷氨基酸具有高度親和性(J Immuno 2003,171,538-541)。 當(dāng)帶正電荷精氨酸在PAD酶作用下轉(zhuǎn)換成電中性的瓜氨酸后,得到的翻譯后修飾蛋白/多 肽親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于精氨酸與P4的親和力,并能夠激活⑶4+T細(xì)胞,這些“瓜氨酸特異T細(xì) 胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗體的產(chǎn)生(J Immuno 2003,171,538-541 ;Arthritis Rheuml987,30,1205-13 ;Rheum Dis Clin North Am 1992,18,741-59 ;ArthritisRheum 2005,52,1063-68)。這些結(jié)果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患 者自身免疫反應(yīng)。綜合目前的研究結(jié)果,抗CCP抗體對RA具有較高的專一性,能將RA與其它與RA相 似的疾病相區(qū)分,這類抗體存在于絕大多數(shù)的病人體內(nèi),在疾病的早期就能檢測到,有助于 對疾病的預(yù)測,能通過簡單的方式加以檢測(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6)。將CCP肽用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的體外ELISA檢測已得到廣泛研究,也有諸多商業(yè)化 的檢測試劑盒。單次ELISA檢測通常需要較大的樣本數(shù),檢測所用的時(shí)間也較長,其檢測過 程還需要專業(yè)的人員進(jìn)行操作,對醫(yī)療機(jī)構(gòu)的依賴度較大,從而不利于普通病患對病程的 自助監(jiān)測。膠體金金標(biāo)側(cè)向?qū)游龇ㄔ陬愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體檢測中也有應(yīng)用,該方法利用毛 細(xì)現(xiàn)象使檢測樣品依次流過標(biāo)記物、檢測區(qū)和控制區(qū)。由于在整個(gè)檢測過程中,待測抗體分 子與標(biāo)記抗體/抗原的結(jié)合始終處于吸附和脫附的過程當(dāng)中,在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中,其檢測靈 敏度受到所用檢測膜的影響,不利于產(chǎn)品的大規(guī)模臨床應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體 的組合物,包括CCP肽、與CCP肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的高分子聚合物、微孔濾膜和吸水介質(zhì), 實(shí)現(xiàn)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速、準(zhǔn)確檢測。CCP肽是一種由5-50個(gè)氨基酸通過酰胺鍵互相連接,且在不相鄰的兩個(gè)氨基酸側(cè) 鏈之間通過共價(jià)鍵形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)有機(jī)分子。氨基酸為分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有氨基和羧基 的有機(jī)化合物,選自于甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨 酸、天冬氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。CCP肽的序列如美國專利申請2006/0039924A1、中國專利申請 02133648. 2、中國專利申請 200410093354. 1 和文獻(xiàn) J. Clin. Invest. 1998,273-281 中所記 載的多肽。在所述CCP肽序列當(dāng)中至少有一個(gè)精氨酸側(cè)鏈被修飾,修飾的精氨酸側(cè)鏈具有 式I所示的結(jié)構(gòu),
權(quán)利要求
1.一種用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物,包括CCP肽、高 分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì);其中,CCP肽與高分子聚合物共價(jià)或非共價(jià) 結(jié)合,所述高分子聚合物通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合于微孔濾膜上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述CCP肽的序列當(dāng)中至少有一個(gè)精氨酸側(cè)鏈被修飾,修飾的精氨酸側(cè)鏈 具有式I所示的結(jié)構(gòu),
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述CCP肽的序列當(dāng)中至少有一個(gè)精氨酸殘基被修飾成瓜氨酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述CCP肽選自于SEQ ID No :1-261任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為2 μ g-400 μ g/cm3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述微孔濾膜上結(jié)合的CCP肽聚合物含量為50μ g-150y g/cm3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述高分子聚合物分子量大于2,OOODa0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述高分子聚合物分子量范圍為20kDa-100kD。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述高分子聚合物選自于牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、雞 卵清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、分叉型聚合物、聚賴氨酸、聚乙二醇或抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合 物,其特征在于所述CCP肽與高分子聚合物之間的共價(jià)鍵選自于酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、硫醚 鍵、腙鍵、肟鍵或二硫鍵。
全文摘要
一種用于斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的組合物,包括CCP肽、高分子聚合物、微孔濾膜、吸水介質(zhì)和載體介質(zhì)。其中,CCP肽與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合,之后高分子聚合物通過共價(jià)或非共價(jià)形式結(jié)合于微孔濾膜上。該組合物不僅能夠?qū)崿F(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫抗體的快速體外檢測,而且便于患者自助診斷,并為及時(shí)了解病情發(fā)展提供參考。
文檔編號C07K16/18GK101995463SQ20091005647
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月14日
發(fā)明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司