專利名稱：一種制備雙功能抗體的方法
技術領域：
本技術涉及雙功能抗體的制備方法，特別涉及免疫學中可攜帶用于治療小分子的藥物，同時也具有定向功能的雙功能單克隆抗體制備方法。
背景技術：
免疫學中的抗體具有特異性，能特異性地識別目標抗原。隨著雜交瘤技術的發(fā)展，人們很容易地就可以通過常規(guī)的免疫雜交瘤技術已經獲得了大量的特異性的單克隆抗體，尤其是特異性的抗腫瘤的單克隆抗體的獲得使單克隆抗體對腫瘤的診斷與醫(yī)治起著非常重要的作用.然而由于單克隆抗體多數是鼠源抗體，因而必然存在異源性問題，也必然引起免疫的排斥反應.并且鼠源性抗體對激發(fā)人細胞免疫活力方面的作用也是有限的。
后來人們又發(fā)明了免疫毒素或放射免疫治療技術，將毒蛋白或放射性同位與特異性的單克隆抗體通過共價偶聯，制備出毒素與單克隆抗體的化學偶聯物，由于單克隆抗體的導向作用，從而將毒蛋白或放射性同位帶到靶細胞處，再利用毒蛋白毒性或放射性同位素射線將靶細胞殺死.這種免疫毒素或放射免疫技術，雖然對靶細胞有一定殺傷作用，但是同時毒蛋白質分子本身就是異源物質，是很好的免疫原，在免疫毒素發(fā)揮一段時間作用之后，機體產生抗毒蛋白的抗體，其治療效果將大打折扣.再說放射免疫因同位素的污染性較強，對機體及環(huán)境都是有很大的危害，從而也限制了放射免疫技術的應用.
現實生活中許多化療所涉及的化學藥物雖然對癌癥細胞具有極大的殺傷作用，但是由于化療或放療過程中藥物的負作用很大，使得正常細胞在治療期間也同時得到極大的傷害，這主要是由于正常組織細胞所能承受的藥物濃度與腫瘤細胞治療所用的濃度很接近，雖然殺死了腫瘤細胞，但同時也對正常細胞產生極大的殺傷，以至于許多放療以及化療患者都出現脫發(fā)、病體虛弱等現象。
于是人們想到了雙功能抗體，希望抗體既具有特異性識別功能，同時也具有治療功能.現在雙功能抗體，多數集中在抗腫瘤特異性的抗體獲得后，再通過誘導劑誘導雜交瘤，獲得營養(yǎng)缺陷型的腫瘤細胞，再與抗第二種抗原的脾細胞進行細胞融合，并且第二種抗原通常是治療中相關蛋白，這種雙功能抗體研究與開發(fā)周期較長，并且雙功能抗體自身也存在穩(wěn)定性的問題，在實際中治療效果存在不足.
人們急需要一種雙功能抗體，用于治療，并且研發(fā)周期長相對較短，穩(wěn)定性好，治療效果強，并且毒性與負作用小的雙功能抗體.
雖然制備這種雙功能抗體構思本人在數年前就已經形成，但苦于資金等條件所限而未能實施，并且為了籌款本人在其他方面也投入了許多精力。現將相關制備方法公開以便人們能從根本上解決醫(yī)學上的難題，并且對其他疾病治療帶來啟發(fā).

發(fā)明內容
一種制備雙功能抗體的方法，其內容是將小分子藥物作為半抗原與以特異性抗原作為載體蛋白進行化學偶聯，其中治療藥物是小分子化合物，具有一定的化學結合為半抗原，而特異性抗原是大分子物質，直接用作載體蛋白；通過常規(guī)的化學偶聯制備形成小分子藥物與特異蛋白的偶聯物，將其偶聯物作為免疫原，免疫動物，然而取其脾細胞與相應的骨髓瘤細胞進行細胞融合，在HAT選擇培養(yǎng)基的篩選下，只能融合細胞才能存活生長，再經過ELISA篩選出，抗藥物小分子的單克隆抗體，所用篩選抗原為小分子藥物與另一種蛋白載體的化學偶聯物，這樣可得到抗小分子藥物的單克隆抗體，同時這種單克隆抗體對載體蛋白也呈陽性反應，再從這些陽性雜交瘤中篩選出針對特異性的載體抗原也具有良好的特異性的單克隆抗體。這樣就得到抗藥物小分子的特異性的單克隆抗體，而同時這個特異性的單克隆抗體對免疫原中的載體蛋白成分即特異性的病原抗原也具有良好的抗原抗體反應能力，即所獲得具有雙功能特點的單克隆抗體！本發(fā)明建立在一些常規(guī)的免疫學理論或技術的基礎上，同時本人依據相關的免疫技術進而提出“定向免疫治療論點”，該論點的基本內容是1、小分子化學藥物與以病原的特異性抗原作載體能通過化學偶聯的方法形成的半抗原-載體蛋白復合物，該復合物依然具有良好的免疫原2、所得到的半抗原-病原特異性抗原的復合物可以誘發(fā)機體，產生抗小分子藥物、同時也抗病原特異性抗原的雙功能抗體3、所產生的雙功能抗體，能與自由的半抗原小分子藥物通過非共價鍵的方式進行結合，同時也能通過非共價鍵的方式與腫瘤特異性抗原進行抗原-抗體親和結合4、該類雙功能抗體能與半抗原藥物預先結合，并且半抗原結合后，依然能與特定病原中的特異性抗原結合，從而從藥物分子帶到病灶處，由于半抗原藥物分子與抗體結合是非共價鍵，這種結合是可逆反應的，因而小分子藥物可以從抗體中脫落5、由于小分子藥物可以從雙功能抗體中脫落的，是一種動態(tài)的可逆反應，這種雙功能抗體在一定程度上具有“藥泵”作用，將有效的治療藥物，定向地帶到病原的特異性抗原周圍，使得病灶周圍藥物的濃度遠遠大于血清中藥物的濃度，這樣就可以減輕藥物對機體的毒害作用。
6、小分子藥物與雙功能抗體結合后，再結合病灶處特定的抗原時不脫落小分子藥物也會隨著病灶細胞上的特定抗原在細胞膜上的移動而進入目標細胞內。
7、采用病原特異抗原作為載體與抑制病毒復制小分子藥物偶聯時，所得到的特定的雙功能抗體制備可以將藥物定向帶到病毒感染細胞的周圍，提高化學治療藥物對病毒復制的干擾效果。
8、采用病原特異性抗原作載體時，與具有細胞毒性小分子藥物進行偶聯，所得到的特定的雙功能抗體，可以實現將細胞毒性的藥物帶到病毒感染細胞周圍，使病毒感染細胞死亡，限制了病毒的擴散.但機體的這類細胞不能是實質器官組織的細胞，避免給機體實質器官帶來傷害.
9、采用病原細菌特異性抗原作為載體時，可以將殺死細菌的藥物，定向帶來病細菌的周圍從而提高了藥物的殺菌效果。
10、以其他病原微生物或寄生蟲的特異性的抗原作為載體，并結合相關藥物也具有類同的定向藥泵作用。
11、針對不同藥物半抗原分別與同一種特異性抗原偶聯，制備不同的雙功能單克隆抗體，將不同種的雙功能分別與不同藥物預先結合，再混合輸入患者的機體內，有助于治療效果的提高。
12、本雙功能抗體也可以結合外用，將以非共價鍵結合有治療藥物的雙功能抗體在緩沖液中，并在接近體溫的條件上，將藥物傳送到病原處，對病原微生物構成殺傷.
本發(fā)明所涉及免疫學理論的基礎是1、半抗原只有免疫反應性而沒有免疫原，2、以特異性抗原作為載體蛋白，所得到的抗體一定與特異性抗原有免疫學反應，只要進一步篩選人們就能從中篩選出良好的雙功能抗體雜交瘤。所涉的基本技術包括小分子藥物與特異性抗原化學偶聯技術、雜交瘤技術、酶聯免疫吸附技術等免疫學技術。
使用本發(fā)明所得到的雙功能單克隆抗體，使用前預先最好與小分子藥物即半抗原進行免疫親和結合，然而將這種復合物通過輸液的方式經血液循環(huán)，利用雙功能抗體對特異性抗原能進行特異性的親和反應的特點，將雙功能抗體送達特定的位置，同時也將治療所用的藥物帶到病灶處，從而使得病灶處的藥物濃度很高，較低血液中藥物的濃度，因而對病人的身體健康不會構成毒害作用。雖然小分子藥物與該雙功能單克隆抗體在體內也可以結合，但是藥泵的效果會不如將小分子藥物與雙功能單克隆抗體預先結合。同時將小分子藥與雙功能單克隆抗體輸入體內，藥物也能定向送到病灶處，傳送藥物的效果可能會低許多。
本發(fā)明雖然存在異源性的問題，但是本發(fā)明中的雙功能抗體的研制方法，卻能為人類開創(chuàng)一系列的治療性雙功能的單克隆抗體的研發(fā)提供幫助，同時也為人類構造人源化的基因工程抗體提供基礎，促進人源雜交瘤技術以及體外免疫技術成熟，從而徹底解決免疫排異。
具體施實例實施例1將治療人胃癌的化學藥物，5-氟-尿嘧啶核糖與人胃癌特異性的抗原進行化學偶聯，此處化學偶聯的方法可以采用過碘酸鈉氧化法，將適量的5-氟-尿嘧啶核糖與適量的過碘酸鈉進行糖基的氧化反應，然后再加入適量乙二醇反應掉過量的過碘酸鈉，再加入適量的胃癌特異性的抗原在偏堿性條件進行化學偶聯反應，過夜后加入適量的硼氫化鈉，消除化學偶聯反應中產生的烯醇式結構，再經透析并反復多次換液，即可獲得半抗原-胃癌特異性抗原的復合物，以此物作為免疫原，免疫BAL b/c小鼠，免疫按常規(guī)免疫方法進行，然后取脾細胞與鼠源骨髓瘤細胞進行細胞融合，得到融合細胞再經過ELISA篩選，即可以獲得雙功能雜交瘤單克隆抗體。該雙功能單克隆抗體，既有結合小分子治療藥物5-氟尿嘧啶核糖或小分子5-氟尿嘧啶能力，同時也能特異性地結合胃癌細胞中的腫瘤特異性抗原。
實施例2利用柔紅霉素與白血病特異性抗原進行化學偶聯得到柔紅霉素-白血病特異性抗原的復合物進行免疫、細胞融合、篩選出特定的雙功能單克隆抗體，制備單克隆抗體的方法同常規(guī)雜交瘤融合技術。柔紅霉素與白血病特異性蛋白的偶聯方法如下將適量的柔紅霉素與適量的水合碳化二亞胺混合，再與適量的白血病特異性的抗原混合，利用柔紅霉素中的氨基進行活化反應，與載體蛋白進行共價結合，獲取柔紅霉素-白血病的特異性抗原復合物。然后再按常規(guī)免疫學方法免疫、進行細胞融合，獲得雜交瘤，并從中篩選出特定的雙功能的單克隆抗體，由于這種抗體同時具有抗柔紅霉素、抗白血病特異性的功能，在化療時就可以將相關化學藥物富集到病灶周圍，這些藥物之所以能富集到病灶周圍，是由于雙功能抗體所識別的另一個抗原就是腫瘤特異性的抗原，而這種特異性的抗原只有病灶處較多。病灶處存在許多腫瘤細胞，這些腫瘤細胞中都存在特異性的腫瘤抗原，而機體的正常組織是沒有這種特異性的抗原，因而藥物就會被定向富集到腫瘤細胞周圍，而機體血液中的藥物濃度就可以降低許多而不會影響藥物的療效，這樣就可拉開了病灶組織與機體細胞所接觸到的藥物濃度，降減藥物的負作用。或者在原有的治療濃度下，通過定向送藥的效應將更高濃度的藥物定向送到病灶處，提高藥物的治療效果。
實施例3阿霉菌素與肺癌特異性抗原通過碳化二亞胺進行化學偶聯，制備成阿霉菌素與肺癌特異性蛋白化學偶聯的免疫復合物，該免疫復合物免疫小鼠之后，經細胞融合即可得以雜交瘤細胞，在得到的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中通過ELISA檢測進行篩選，將抗阿霉菌素的雜交瘤篩選出來，再進一步對所得到的雜交瘤進行特異性篩選與單克隆化處理，從而篩選出穩(wěn)定的、抗阿霉菌素同時也抗肺癌特異性抗原的單抗雜交瘤，該雜交瘤經克隆處理將是雙阿霉菌素，同時也會抗肺癌的雙功能單克隆抗體。
實施例4將抗生素與細菌特異性抗原化學偶聯。利用化學偶聯的方法將特定的治療性的抗生素鏈霉素與細菌特異性的抗原進行化學偶聯，獲得半抗原-載體蛋白復合物免疫動物，制備特異性的雙功能雜交瘤來分泌單克隆抗體，所得到的雙功能抗體能與抗生素反應，同時也能與特定的病原細菌結合，具備雙功能抗體。
使用這種雙功能抗體時，抗體與抗生素結合后，再隨著血液循環(huán)將藥物帶到病原菌處，使得特定的病菌周圍的抗生素濃度遠遠高于環(huán)境，從而干擾了細菌的生長，提升藥物的療效。
將相關藥物與載體蛋白進行化學偶聯制備免疫原方法是成熟的，但人們主要考慮免疫學的檢測低分子化合物含量，進而進行測定分析等。而特異性抗原在市場上早有供應的，但是人們也是采用它的特異性用于免疫學檢測分析、免疫學診斷與特定蛋白在細胞結構中的定位研究，而將低分子的藥物與特異性抗原結合起來考慮問題，制備直接雙功能單克隆抗體的并未見到。
現實中應用的治療性的藥物很多，所涉及到特異性抗原的研究與開發(fā)也很多，人們可采用一種小分子藥與多種特異性抗原物質進行化學偶聯，這樣就做到一種疾病采用同種小分子藥物進行化學治療反應，但是特異性的蛋白載體，人們可以一種特異性的載體蛋白質與多種小分子藥物進行偶聯，實行小分子藥物的多元化，做到以多種藥物合用抗擊一種疾病，此處不再一一列舉。
權利要求
1.一種制備雙功能抗體的方法，其特征是將小分子藥物與特異性抗原進行化學偶聯，其中治療藥物是小分子化合物，為半抗原，而特異性抗原是大分子物質蛋白，直接用作載體蛋白；通過常規(guī)的化學偶聯的方法制備小分子藥物與特異蛋白的偶聯物，將該偶聯物作為免疫原，免疫動物，然而取免疫動物脾細胞與相應的骨髓瘤細胞進行細胞融合，在HAT選擇培養(yǎng)基的篩選下，只能融合細胞才能存活生長，再經過ELISA篩選出，抗藥物小分子的單克隆抗體，所用篩選抗原為小分子藥物與另一種蛋白載體的化學偶聯物，這樣可得到抗小分子藥物的單克隆抗體，同時這種單克隆抗體對載體蛋白也呈陽性反應，再從這些陽性雜交瘤中篩選出針對特異性的載體抗原也具有良好的特異性的單克隆抗體。這樣就得到抗藥物小分子的特異性的單克隆抗體，而同時這個特異性的單克隆抗體對免疫原中的載體蛋白成分即特異性的病原抗原也具有良好的抗原抗體反應能力，即所獲得具有雙功能特點的單克隆抗體！
2.依據權利要求1所述，用于與半抗原化學偶聯的載體蛋白是特異性抗原，它們可以是腫瘤特異性抗原、細菌真菌的特異性蛋白抗原、病毒特異性蛋白抗原、寄生蟲的特異性蛋白抗原。
3.依據權利要求1所述，雙功能單克隆抗體所針對的藥物小分子，是小分子藥物或小分子有毒物質，并且小分子物質是具有一定化學結構的半抗原化合物，能與蛋白載體通過化學手段在不破壞小分子化合物的主要結構的前提下實現共價偶聯。
4.依據權利要求1所述，雙功能單克隆抗體與小分子藥物以及特異性抗原結合都是非共價鍵的形式結合，在病灶處可以發(fā)生可逆性結合與脫落現象，小分子藥物被這種方式運送到病灶處。
5.依據權利要求1所述，雙功能抗體能特異性地識別病灶處特異性抗原蛋白質，而其他部分沒有這種特異性的抗原成分，因而這種雙功能抗體保持定向作用，將藥物定向送到病灶處.
全文摘要
一種制備雙功能抗體的方法，其特征是將小分子藥物與病原或腫瘤特異性抗原進行化學偶聯，制成小分子藥物--特異蛋白的偶聯物，免疫動物后，取該動物脾細胞，與相應的骨髓瘤細胞進行融合，制備單克隆抗體，再經過ELISA篩選出抗小分子藥物的單克隆抗體，并從陽性雜交瘤中篩選出同時針對特異性載體蛋白的抗原也有良好反應的單克隆抗體。這種雙功能單克隆抗體與小分子藥物、特定病原的抗原都是通過非共價鍵的形式結合，且結合是可逆的，起到定向將小分子藥物帶到特定位置的作用，使病灶處藥物濃度高于機體的其他部位。
文檔編號C07K16/18GK101070346SQ20061005061
公開日2007年11月14日 申請日期2006年5月8日 優(yōu)先權日2006年5月8日
發(fā)明者陳正賢 申請人:陳正賢