專利名稱：重組蛋白amacr及其在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物研究領(lǐng)域，具體涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域、免疫學(xué)研究領(lǐng)域以及疾病的診斷研究領(lǐng)域，更具體地涉及體外重組蛋白AMACR及其制備、抗AMACR抗體及其制備以及重組蛋白AMACR在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌是男性生殖系常見的惡性腫瘤。前列腺癌的發(fā)病率在國內(nèi)外有很大差別歐美各國發(fā)病率極高，在高齡男性中僅次于肺癌(Reiter Robert E，(2002).Campbell′s Urology，Walsh PC，ed.Elsevier，pp.3003-30024.)；東方發(fā)病率比較低，但是近幾年我國前列腺癌的發(fā)病率有上升的趨勢。據(jù)估計，男性在青壯年時期，約有35％-40％患有不同程度的前列腺炎。前列腺疾病容易誘發(fā)前列腺癌。
通常診斷前列腺癌是采用篩選(screening)方法，包括血清前列腺特異性抗原測試法(serum prostate specific antigen testing，PSA)和直腸指檢(digital rectalexamination，DRE)。目前這兩種方法的組合是用于診斷早期前列腺癌的最佳方法。作為診斷標(biāo)志物，全血清PSA濃度高于10ng/ml時疑似為前列腺癌；PSA濃度低于10ng/ml時，則較難判斷(Stamey et al.，(2002).J.Urol.167，103-111.)。各項(xiàng)研究顯示PSA篩選能夠診斷70％-80％的前列腺癌，其中包括40％的無感覺腫瘤(Schroder，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，239-51，viii.)。從中看出盡管PSA/DRE組合和前列腺活檢使前列腺癌的診斷正確率達(dá)到80％，然而仍會遺漏大量腫瘤，尤其是無感覺腫瘤。
其次，應(yīng)用PSA篩選來診斷前列腺癌尚存在以下幾方面的不足。當(dāng)全血清PSA在4ng/ml-10ng/ml(正常為0-2.5ng/ml)范圍時1.在此范圍內(nèi)的男性需要做前列腺活檢(Catalona et al.，(1994b)，J.Urol.151，1283-1290.)，然而在這種情況下最終被診斷為癌癥的患者僅占22％-27％(Catalona et al.，(1993)，JAMA 270，948-954.；Djavanet al.，(2000)，J.Urol.163，1144-1148.)，原因可能是與前列腺癌無關(guān)的PSA的增高或者活檢取樣存在問題；2.活檢診斷的假陰性比率達(dá)到25％(Cookson，(2000)，Mol.Urol.4，93-97.)，原因可能是取樣時檢體方向的隨機(jī)性，因而有四分之三的處于這一濃度范圍內(nèi)的男性并不受益于這個過程(陰性并不排除癌癥的存在)而且還會經(jīng)歷焦慮、不適、流血和感染這些副作用(Aus et al.，(1996)，Br.J.Urol.77，851-855.；Rietbergen et al.，(1997)，Urology 49，875-880.)；3.通常第一次活檢顯示為陰性的男性會被建議重復(fù)一次，但在復(fù)查過程中能檢測出癌的比率僅為10％(Djavan et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，253-62，viii.)。當(dāng)PSA濃度在2.5ng/ml-4ng/ml范圍時有15％-40％的癌癥被遺漏(Catalona et al.，(1997)，JAMA 277，1452-1455.；Schroder et al.，(2000)，J.Urol.163，806-812.)。當(dāng)PSA濃度在2.5-3ng/ml范圍時在此范圍內(nèi)的男性也被鼓勵做活檢(Catalona et al.，(1994a)，J.Urol.152，2037-2042.；Schroder et al.，(2000)，J.Urol.163，806-812.；Babaian et al.，(2000)，Urology 56，1000-1006.)。在上述這三個PSA濃度范圍內(nèi)，良性前列腺腫大的情況更為普遍，而且已發(fā)現(xiàn)PSA診斷在檢測早期器官癌癥上有很大的局限性(Canto et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，263-277.)。
另外，在過去50年里經(jīng)男性尸體解剖發(fā)現(xiàn)40％的病例是死于前列腺癌(StollerML，Current Medical Diagnosis & Treatment 2002，M.S.P.M.Tierney LM，ed.LangeMedical Books/McGraw-Hill，pp.985-990.)，研究顯示30％的50歲以上男性以及60％-70％的80歲以上男性是逐步在前列腺體中產(chǎn)生小腫瘤(Stoller ML，CurrentMedical Diagnosis & Treatment 2002，M.S.P.M.Tierney LM，ed.Lange MedicalBooks/McGraw-Hill，pp.985-990.)。據(jù)估計在這些患者中間，只有16％的病人是通過screening方法診斷出前列腺癌，并經(jīng)放射線治療而獲益(McGregor et al.，(1998)，CMAJ.159，1368-1372.)。
因此，非常需要發(fā)展一種更為敏感和特異的方法來檢測前列腺癌。
前列腺癌診斷的一個革命性方法是直觀地估計腫瘤的存在和程度。理想的造影技術(shù)是能對患者傷害最小而且能夠高精確度和特異性地檢測出腫瘤的大小和位置。然而目前各種造影技術(shù)均無法達(dá)到這樣的效果，包括TRUS、CT、核磁共振、MRS和放射線標(biāo)記ProstaScint抗體成像技術(shù)(Moul et al.，(2001)，Urol.Clin.North Am.28，459-472.；Purohit et al.，(2003)，Urol.Clin.North Am.30，279-293.)。上述文獻(xiàn)顯示大量中間階段的前列腺癌病人，即使是用各種綜合的臨床方法仍無法顯示足夠精確的腫瘤階段和時期。因而需要一個新的方法來提高診斷的精確度和治療的效果。
此時，腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用便應(yīng)運(yùn)而生了。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞本身存在或分泌的特異性物質(zhì)，對腫瘤的早期診斷、觀察評價治療的效果及判斷愈后有極大的意義。一種合適的、用于前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)該是一種基因產(chǎn)物——能夠大量且持久地在前列腺癌以及大部分癌細(xì)胞中表達(dá)。AMACR就是符合這些條件的一個分子(Xu et al.，(2000)，Cancer Res.60，1677-1682.)。
AMACR，α-甲?；?輔酶A消旋酶(α-methylacyl-CoA racemase，即P504S)，是一個在前列腺癌中持久且大量表達(dá)的蛋白質(zhì)(Jiang et al.，(2001)，Am.J.Surg.Pathol.25，1397-1404.；Luo et al.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)。AMACR是在支鏈脂肪酸以及它們的衍生物的β-氧化過程中起基本作用的一種酶(Swinnen et al.，(2002)，Int.J.Cancer 98，19-22.)，它能催化幾種(2R)-甲基-支鏈脂酰輔酶A酯與(S)脂異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化(Schmitz et al.，(1994)，Eur.J.Biochem.222，313-323.；Wanders et al.，(2001)，Biochem.Soc.Trans.29，250-267.)。
P504S/AMACR在前列腺癌的mRNA和蛋白質(zhì)水平上均有大量表達(dá)(Xu et al.，(2000)，Cancer Res.60，1677-1682.)，其大量表達(dá)存在于癌的各個階段和時期(Luo etal.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)；同時研究表明，在95％甚至于100％的前列腺癌病例中，大部分腺體的AMACR經(jīng)免疫染色后結(jié)果均呈陽性；而只有3％-12％的正常前列腺上皮細(xì)胞染色為微弱陽性(Jiang et al.，2001；Luo et al.，2002；Rubin et al.，2002)；PIN(前列腺內(nèi)上皮腫瘤，一種前列腺癌的前體缺乏癥)染色為陽性結(jié)果也很普遍(Beach et al.，(2002)，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 29，933-938.；Luo et al.，(2002)，Cancer Res.62，2220-2226.；Rubin et al.，(2002)，JAMA 287，1662-1670.)，因此用AMACR來鑒定以及對初級前列腺腫瘤的定位有著無可比擬的優(yōu)勢(Yang et al.，2003)。同時，這種方法還能應(yīng)用于穿刺活檢中以輔助確定穿刺的方向、能估計腫瘤的程度以及幫助搜索癌的系統(tǒng)轉(zhuǎn)移(Jiang et al.，(2002)，Am.J.Surg.Pathol.26，1169-1174.；Magi-Galluzzi et al.，(2003)，Am.J.Surg.Pathol.27，1128-1133.)。可見AMACR在臨床上是一個應(yīng)用意義極大的分子。
因此，制備AMACR抗體并將其應(yīng)用于病理組織切片染色，會大大提高診斷前列腺癌的準(zhǔn)確度。美國已有這方面的報道及應(yīng)用，報道顯示免疫動物所用的抗原是合成多肽?？墒?，由于多肽分子量小，屬于半抗原，自身不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，必須通過物理吸附或化學(xué)合成法與載體結(jié)合后才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。合成免疫原性高的多肽抗原操作繁鎖。
考慮到制備抗原的簡易性以及獲得更高效價的抗體，本發(fā)明者使用體外重組蛋白質(zhì)作為抗原。本發(fā)明者應(yīng)用分子克隆技術(shù)從人體前列腺癌細(xì)胞中克隆得到AMACR編碼全基因，并在大腸桿菌中大量表達(dá)重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR，獲得重組蛋白AMACR。將所得重組蛋白作為抗原免疫家兔，制備得到抗AMACR抗體。將所得抗AMACR抗體應(yīng)用于體外檢測前列腺癌，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供重組蛋白AMACR。
本發(fā)明的第二個目的是提供重組蛋白AMACR的制備方法。
本發(fā)明的第三個目的是提供抗AMACR抗體。
本發(fā)明的第四個目的是提供抗AMACR抗體的制備方法。
本發(fā)明的第五個目的是提供重組蛋白AMACR在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用。
本發(fā)明的第六個目的是提供前列腺癌的體外檢測方法。
發(fā)明概述本發(fā)明第一方面提供的重組蛋白AMACR的氨基酸序列包含序列表中SEQ IDNO.1所示氨基酸序列。
本發(fā)明第二方面提供的重組蛋白AMACR的制備方法包括以下步驟1)提取雄性激素依賴型人癌細(xì)胞株LNCaP中所含總RNA，以其作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQ ID NO.2所示的AMACR編碼全基因序列；2)構(gòu)建增幅用重組質(zhì)粒pDrive-AMACR；3)構(gòu)建表達(dá)用重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR；4)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR至宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，得到表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白AMACR；5)Ni-NTA樹脂純化表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白AMACR。
本發(fā)明第三方面提供的抗AMACR抗體是以重組蛋白AMACR為抗原，經(jīng)免疫動物后所得的抗體。
本發(fā)明第四方面提供的抗AMACR抗體的制備方法包括以下步驟1)以重組蛋白AMACR為抗原，多次免疫動物；
2)采集免疫后全血，分離得血清。獲得抗AMACR抗體。
3)重組蛋白A瓊脂糖凝膠快速分離樹脂(rProtein A Sepharose Fast Flow)純化所得抗體。
本發(fā)明的第五方面提供重組蛋白AMACR在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用。
本發(fā)明的第六方面提供的前列腺癌體外檢測的方法包括以下步驟1)前列腺樣品的固定、包埋及切片；2)脫蠟和水化；3)用抗AMACR抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；4)脫水、透明、封片及鏡檢。
發(fā)明詳述本發(fā)明者首先對AMACR基因進(jìn)行擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pDrive構(gòu)建成增幅用重組質(zhì)粒pDrive-AMACR，轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒后，進(jìn)行DNA測序鑒定；之后將質(zhì)粒pDrive-AMACR與質(zhì)粒載體pRSET-B通過酶切、回收及連接構(gòu)建成在原核生物中表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR，轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒，DNA測序鑒定后將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，所得重組蛋白用Ni-NTA親和層析樹脂純化；將純化所得蛋白作為抗原，多次免疫家兔后，收集家兔血清，所得血清經(jīng)純化后得到抗AMACR抗體；將所得抗體應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色。
1.AMACR基因的克隆從雄性激素依賴型人癌細(xì)胞株LNCaP中抽提出總RNA。以序列表中SEQ IDNO.3所示的DNA序列為5’端引物、SEQ ID NO.4所示的DNA序列為3’端引物，經(jīng)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得編碼AMACR的全基因序列。
將所得AMACR基因PCR片段與質(zhì)粒載體pDrive酶切連接，構(gòu)建成增幅用重組質(zhì)粒pDrive-AMACR。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂布于含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板上。挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，抽提菌體中所含質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測序鑒定。
2.構(gòu)建可在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR挑選上述經(jīng)DNA測序鑒定正確的質(zhì)粒與表達(dá)載體pRSET-B酶切連接，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后涂布于含有Amp和氯霉素的LB平板上，只有帶有pRSET-B-AMACR的克隆才能在此平板中生長。挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，抽提菌體中所含質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測序鑒定，確認(rèn)在克隆過程中AMACR基因沒有發(fā)生變異及蛋白讀取框正確。
3.重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR在大腸桿菌中的表達(dá)與重組蛋白的制備挑選上述經(jīng)DNA測序鑒定正確的質(zhì)粒，于含有Amp和氯霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，隔天轉(zhuǎn)種至新鮮的上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)菌液至對數(shù)生長期，加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)，最后收集菌體沉淀。用變性劑溶解所得菌體沉淀，離心后保留上清液。由于重組質(zhì)粒含有6×His，因此選用Ni-NTA親和層析樹脂純化所得上清液。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果。
4.重組蛋白AMACR接種家兔誘導(dǎo)免疫反應(yīng)及所得抗體的純化以所得重組蛋白為抗原，對家兔進(jìn)行頸部皮下多點(diǎn)注射免疫，整個免疫過程分四次進(jìn)行。第一次將抗原與完全福氏佐劑混和后注射，第二、三、四次將抗原與不完全福氏佐劑混和后注射，每次免疫注射間隔時間為28-30天。待第一次免疫后100天采集家兔全血，分離血清獲得抗體。用rProtein A Sepharose Fast Flow純化所得抗體，透析純化產(chǎn)物。
5.抗AMACR抗體應(yīng)用于免疫組織化學(xué)染色及標(biāo)記物的檢測待測前列腺樣品經(jīng)福爾馬林固定、包埋、切片、脫蠟水化及微波爐抗原修復(fù)后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，再經(jīng)脫水、透明及封片后進(jìn)行鏡檢。上述免疫組織化學(xué)染色步驟均為常規(guī)方法。
本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明者選用Invitrogen的pRSETA，B，C Kit構(gòu)建重組蛋白。這是一個專門用于在大腸桿菌中高水平表達(dá)重組蛋白質(zhì)的工具包。其中pRSET是從pUC-衍生出的專門用于在大腸桿菌中高水平表達(dá)和純化重組蛋白質(zhì)的載體。
本發(fā)明者在構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR時，將(小)牛小腸堿性磷酸(酯)酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIAP)作用于雙酶切后的pRSET-B質(zhì)粒。其中，CIAP破壞開環(huán)后堿基末端的磷酸基，阻止載體的自我環(huán)化，大大提高了連接的效率。
本發(fā)明者將重組蛋白與佐劑混合后進(jìn)行免疫。這種組合方式使抗原充分發(fā)揮其免疫原性，從而所得抗體具特異性高，親和力大的特點(diǎn)。
本發(fā)明者通過標(biāo)記物檢測，所得結(jié)果顯示通過染色能很好的區(qū)分正常的前列腺切片和癌癥患者的前列腺切片，并且其染色有效率達(dá)到90％以上，也就是說在免疫組化染色過程中，每100例正常的前列腺切片的假陽性率低于10％。因此病理醫(yī)生能利用被染色的患者組織切片來輔助進(jìn)行前列腺癌的診斷。


圖1是AMACR全基因序列的擴(kuò)增結(jié)果。
圖2是重組蛋白AMACR的誘導(dǎo)結(jié)果。
圖3是重組蛋白AMACR的純化結(jié)果。
圖4是前列腺樣品的鏡檢結(jié)果。
具體實(shí)施方案下面用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實(shí)施中所作的任何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 AMACR基因的克隆1).材料細(xì)胞株LNCaP是一種雄性激素依賴型人細(xì)胞株，是為數(shù)不多的幾個前列腺癌研究的常用癌細(xì)胞株的一種。
培養(yǎng)液DMEM是GIBCO的產(chǎn)品，利用前需要添加10％的FBS。
2).步驟a.抽提總RNA用Rneasy Micro Kit(Qiagen公司)從LNCaP細(xì)胞中提取總RNA。
b.RT-PCR擴(kuò)增AMACR基因用One Step RT-PCR Kit(Qiagen公司)對步驟a所得RNA進(jìn)行AMACR基因的擴(kuò)增。
引物的設(shè)計Primer A5’GAGCTCGGCA CTGCAGGGCA TCTCGPrimer B5’GGTACCAAAT TCACTTGAGC CGTGGGCC引物Primer A(序列表中SEQ ID NO.3所示)為增幅AMACR基因的5’端引物，其中引入了Sac I酶切位點(diǎn)GAGCTC；
引物Primer B(序列表中SEQ ID NO.4所示)為增幅AMACR基因的3’端引物，其中引入KpnI酶切位點(diǎn)GGTACC。
反應(yīng)體系(總體積50μl)

反應(yīng)條件

其中變性、退火和伸長反應(yīng)為35個循環(huán)。
AMACR基因序列的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。其中，泳道1為PCR參照分子量；泳道2為AMACR基因的PCR擴(kuò)增條帶。結(jié)果顯示，泳道2所示條帶大小約為1149bp，與預(yù)計結(jié)果相符。
實(shí)施例2 AMACR基因PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證1)pDrive-AMACR增幅質(zhì)粒的構(gòu)建用PCR Cloning Kit(Qiagen公司)將實(shí)施例1所得AMACR基因與pDrive載體進(jìn)行連接。
連接體系(總體積10μl)

反應(yīng)條件將上述連接體系于16℃中反應(yīng)30min。
2)重組質(zhì)粒pDrive-AMACR轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中進(jìn)行篩選
緩慢解凍PCR Cloning Kit中所提供的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，加入1μl步驟1)所得連接液。冰浴30分鐘；42℃熱休克40秒；冰浴2分鐘之后，加入LB培養(yǎng)基，于37℃孵化1小時，隨后涂布于含有100μg/ml的Amp的LB平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃中培養(yǎng)12小時以上，直到長出明顯的菌落為止。
挑選5個菌落，于5ml含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用QIAprep SpinMiniprep kit(Qiagen公司)抽提菌體中所含重組質(zhì)粒。DNA測序鑒定所得質(zhì)粒的DNA序列。
測序鑒定結(jié)果顯示，與預(yù)計結(jié)果一致，含有完整的未變異的AMACR基因。
實(shí)施例3 在原核生物中表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR的構(gòu)建1)材料試劑盒pRSETA，B，C Kit(Invitrogen公司)，這是一個專門在大腸菌中高水平表達(dá)重組蛋白質(zhì)的工具包。
表達(dá)載體pRSET，這是一個從pUC-衍生出來的專門用于大腸桿菌中高水平表達(dá)和純化重組蛋白質(zhì)的載體。
2)步驟(具體步驟見操作手冊)a.酶切用Sac I和Kpn I酶于37℃中分別消化pDrive-AMACR和pRSET-B，反應(yīng)2小時以上，直到被完全切斷為止。
b.AMACR基因的回收純化用MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen公司)抽提雙酶切后所得的目標(biāo)片段。
c.pRSET-B載體的回收純化雙酶切后的pRSET-B質(zhì)粒經(jīng)純化去除這兩種酶的活性后，加入CIAP并于37℃中反應(yīng)1小時，破壞開環(huán)后堿基末端的磷酸基，阻止載體的自我環(huán)化，再純化，去除CIAP酶活性。
d.連接反應(yīng)體系(總體積20μl)

反應(yīng)條件將上述連接體系于16℃中反應(yīng)30min。
實(shí)施例4 pRSET-B-AMACR表達(dá)載體的鑒定根據(jù)實(shí)施例2中步驟2)的方法，將實(shí)施例3所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLys S菌株中，并且抽提菌體所含的重組表達(dá)質(zhì)粒。用DNA測序方法來鑒定所得質(zhì)粒。
測序鑒定結(jié)果顯示，與預(yù)計結(jié)果一致，并未發(fā)生變異，且蛋白讀取框正確。
實(shí)施例5 AMACR重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)由于只有帶有pRSET-B-AMACR的克隆才能在含有Amp和氯霉素的培養(yǎng)基中存活，因此可挑取平皿上的單菌落，于3ml含有50μg/ml Amp和35μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。隨后轉(zhuǎn)種至25ml的培養(yǎng)基(不含抗菌素)中，使所得菌液的OD600約為0.1。繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.4時，取出1ml菌液作為對照，其余菌液加入終濃度為1mM的異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-Dthiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)T7RNA聚合酶(T7RNA polymerase)的表達(dá)。對照菌液和誘導(dǎo)菌液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，誘導(dǎo)時間為20小時，使所得菌液的OD600為1。收集菌體。
重組蛋白AMACR的誘導(dǎo)電泳圖譜見圖2。其中，泳道1為未誘導(dǎo)表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR；泳道2為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道3及泳道4均為誘導(dǎo)表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR。結(jié)果顯示，在分子量為46KDa處，誘導(dǎo)后的菌體較誘導(dǎo)前的菌體呈現(xiàn)出明顯表達(dá)條帶，此處即為重組蛋白AMACR，分子量大小與理論值相符。
實(shí)施例5 AMACR重組蛋白的純化1)使用試劑純化試劑盒為The QIAexpressionist Kit(Qiagen公司)。包含緩沖液A-E、2×SDS-PAGE樣品緩沖液、Ni-NTA樹脂以及空層析柱。
2)步驟a.破碎將實(shí)施例4所得菌體沉淀按照每克濕菌體加入5ml緩沖液的比例加入一定量的緩沖液B，充分混勻后于12,000rpm離心20分鐘，收集上清液。
b.純化取5倍柱體積的緩沖液B平衡樹脂。取4ml步驟a所得上清液與1ml 50％的Ni-NTA樹脂結(jié)合，室溫輕柔混合15分鐘以上。收集流穿液。用5ml的緩沖液C洗滌兩次，直至OD280低于0.01。用0.5ml的緩沖液D洗脫4次后，再用0.5ml的緩沖液E洗脫4次。收集所有洗脫液。
c.SDS-PAGE鑒定表達(dá)與純化預(yù)制膠——Bis-Tris-HCl(pH 6.4)聚丙烯酰胺凝膠制備(Invitrogen公司提供)。
電泳條件200V。染色考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色。
重組蛋白AMACR的純化結(jié)果見圖3。其中，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道2為純化蛋白(濃度為1×)；泳道3為純化蛋白(濃度為1/2×)；泳道4為純化蛋白(濃度為1/4×)；泳道5為純化蛋白(濃度為1/8×)。結(jié)果顯示，經(jīng)洗脫得到的純化蛋白，其分子量約為46KDa，與理論值相符。經(jīng)DC Protein Assay Kit(BioRad公司)測定，所得純化蛋白(濃度為1×)的濃度為300μg/ml。
實(shí)施例6 AMACR重組蛋白接種家兔誘導(dǎo)免疫反應(yīng)1)家兔數(shù)量兩只。
2)抗原注射量每只家兔需要50-200μg實(shí)施例5所得抗原。
3)免疫步驟a.第一次免疫免疫原根據(jù)2)所示抗原注射量，取等倍體積的完全福氏佐劑(Sigma公司)與之混合，于6000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铏C(jī)上攪拌5分鐘，使兩者充分混勻，待注射家兔；免疫注射方式家兔頸部皮下多點(diǎn)注射；b.第二次免疫免疫時間第一次免疫之后的28-30天后；免疫原根據(jù)2)所示抗原注射量，取等倍體積的不完全福氏佐劑(Sigma公司)與之混合，于6000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铏C(jī)上攪拌5分鐘，待兩者充分混勻，待注射家兔；免疫注射方式家兔頸部皮下多點(diǎn)注射；c.第三次免疫免疫時間第一次免疫之后的58-60天后；免疫原同步驟b.所示免疫原；免疫注射方式同步驟b.所示方式；d.第四次免疫
免疫時間第一次免疫之后的88-90天后；免疫原同步驟b.所示免疫原；免疫注射方式同步驟b.所示方式；e.采家兔血獲得抗體采血時間第一次免疫之后的第100天；抗體的獲得離心所得家兔全血，收集血清，所得抗體待純化。
實(shí)施例7 AMACR重組蛋白免疫家兔后所得抗體的純化1)試劑和材料a.rProtein A Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences#17-1279-01)；b.0.1M Tris-HCl，pH 8.0；c.0.05M甘氨酸-鹽酸，pH 2.8；d.1M Tris-HCl，pH 8.02)純化步驟a.樹脂平衡用10倍柱體積的0.1M Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液平衡樹脂；b.上樣根據(jù)實(shí)施例6所得血清量，加入等倍體積的0.1M Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液，混勻后上樣；c.洗滌用0.1M Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液洗滌，至流穿液的OD280＜0.05；d.洗脫用0.05M甘氨酸-鹽酸(pH 2.8)緩沖液分管洗脫，收集洗脫液；e.透析將步驟d.所得洗脫液按1∶10的比例加至含有1M Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液的試管內(nèi)，測定OD280；合并OD280＞0.1的洗脫所得液，隨后于1×PBS中透析過夜。
通過測定透析所得抗體OD280，換算得到抗體的濃度，即抗體濃度(mg/ml)＝OD280×0.8。結(jié)果顯示，抗體OD280＝1，則抗體濃度(mg/ml)＝0.8mg/ml實(shí)施例7 免疫組織化學(xué)染色1)前列腺樣品的固定通常利用福爾馬林來固定樣品。
2)切片通常制作6μm厚的切片。
3)染色a.脫蠟和水化脫蠟前，將組織切片在60℃恒溫箱中烘烤30～60分鐘；組織切片置于二甲苯中浸泡5分鐘，更換二甲苯后再浸泡5分鐘；無水乙醇中浸泡3分鐘，更換無水乙醇再浸泡3分鐘；95％乙醇中浸泡3分鐘；80％乙醇中浸泡3分鐘；70％乙醇中浸泡3分鐘；純水中浸泡3分鐘；PBS緩沖液中浸泡3分鐘；3％H2O2(80％甲醇)滴加在組織樣品上，室溫靜置10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS洗滌2次各5分鐘。
b.微波爐抗原修復(fù)將步驟a所得組織切片放入0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)，于微波爐中加熱至沸騰，保持沸騰5～6分鐘；在緩沖液中冷卻30分鐘；PBS洗滌2次各5分鐘。
c.免疫組織化學(xué)染色在步驟b所得組織切片中滴加正常山羊血清封閉液(不可有氣泡)，室溫反應(yīng)45分鐘；滴加I抗，(即抗AMACR抗體，1∶100稀釋)50μl，4℃反應(yīng)過夜；用PBS緩沖液洗滌2次各10分鐘；滴加II抗(山羊抗家兔，1∶200稀釋)40～50μl，室溫靜置1小時；PBS緩沖液洗滌2次各10分鐘；DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗10分鐘；蘇木精復(fù)染2分鐘后，放在PBS緩沖液中直到變藍(lán)，隨后用自來水沖洗。
d.脫水、透明、封片、鏡檢將步驟c所得組織切片依次于70％乙醇中浸泡3分鐘；80％乙醇中浸泡3分鐘；95％乙醇中浸泡3分鐘；無水乙醇中浸泡3分鐘，更換無水乙醇再浸泡3分鐘；置于二甲苯中浸泡5分鐘，更換二甲苯后再浸泡5分鐘；最后封片。
實(shí)施例8 標(biāo)記物的檢測根據(jù)正常組織不被染色、癌組織被染成棕色的顯色反應(yīng)，結(jié)合實(shí)施例7所得結(jié)果，即可確定待測前列腺樣品是否癌變。
前列腺樣品鏡檢結(jié)果見圖5。其中，A為細(xì)胞角蛋白；B為癌細(xì)胞；C為癌細(xì)胞(High Grade)；D為正常細(xì)胞；E為正常細(xì)胞。根據(jù)結(jié)果顯示，未著色細(xì)胞為正常細(xì)胞，深色為癌細(xì)胞。
SEQUENCE LISTING<110>上海普洛康裕藥物研究院有限公司張，輝羅，宏偉<120>重組蛋白AMACR及其在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用<130>CN051013<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>382<212>PRT<213>人工合成<400>1Met Ala Leu Gln Gly Ile Ser Val Met Glu Leu Ser Gly Leu Ala Pro1 5 10 15Gly Pro Phe Cys Ala Met Val Leu Ala Asp Phe Gly Ala Arg Val Val20 25 30Arg Val Asp Arg Pro Gly Ser Arg Tyr Asp Val Ser Arg Leu Gly Arg35 40 45Gly Lys Arg Ser Leu Val Leu Asp Leu Lys Gln Pro Arg Gly Ala Ala50 55 60Val Leu Arg Arg Leu Cys Lys Arg Ser Asp Val Leu Leu Glu Pro Phe65 70 75 80Arg Arg Gly Val Met Glu Lys Leu Gln Leu Gly Pro Glu Ile Leu Gln85 90 95Arg Glu Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Ser Gly Phe Gly Gln100 105 110Ser Gly Ser Phe Cys Arg Leu Ala Gly His Asp Ile Asn Tyr Leu Ala115 120 125Leu Ser Gly Val Leu Ser Lys Ile Gly Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr130 135 140Ala Pro Leu Asn Leu Leu Ala Asp Phe Ala Gly Gly Gly Leu Met Cys145 150 155 160Ala Leu Gly Ile Ile Met Ala Leu Phe Asp Arg Thr Arg Thr Asp Lys165 170 175Gly Gln Val Ile Asp Ala Asn Met Val Glu Gly Thr Ala Tyr Leu Ser180 185 190Ser Phe Leu Trp Lys Thr Gln Lys Ser Ser Leu Trp Glu Ala Pro Arg195 200 205Gly Gln Asn Met Leu Asp Gly Gly Ala Pro Phe Tyr Thr Thr Tyr Arg210 215 220
Thr Ala Asp Gly Glu Phe Met Ala Val Gly Ala Ile Glu Pro Gln Phe225 230 235 240Tyr Glu Leu Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Lys Ser Asp Glu Leu Pro245 250 255Asn Gln Met Ser Met Asp Asp Trp Pro Glu Met Lys Lys Lys Phe Ala260 265 270Asp Val Phe Ala Lys Lys Thr Lys Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Asp275 280 285Gly Thr Asp Ala Cys Val Thr Pro Val Leu Thr Phe Glu Glu Val Val290 295 300His His Asp His Asn Lys Glu Arg Gly Ser Phe Ile Thr Ser Glu Glu305 310 315 320Gln Asp Val Ser Pro Arg Pro Ala Pro Leu Leu Leu Asn Thr Pro Ala325 330 335Ile Pro Ser Phe Lys Arg Asp Pro Phe Ile Gly Glu His Thr Glu Glu340 345 350Ile Leu Glu Glu Phe Gly Phe Ser Arg Glu Glu Ile Cys Gln Leu Asn355 360 365Ser Asp Lys Ile Ile Glu Ser Asn Lys Val Lys Ala Ser Leu370 375 380<210>2<211>1149<212>DNA<213>人工合成<400>2atggcactgc agggcatctc ggtcatggag ctgtccggcc tggccccggg cccgttctgt60gctatggtcc tggctgactt cggggcgcgt gtggtacgcg tggaccggcc cggctcccgc120tacgacgtga gccgcttggg ccggggcaag cgctcgctag tgctggacct gaagcagccg180cggggagccg ccgtgctgcg gcgtctgtgc aagcggtcgg atgtgctgct ggagcccttc240cgccgcggtg tcatggagaa actccagctg ggcccagaga ttctgcagcg ggaaaatcca300aggcttattt atgccaggct gagtggattt ggccagtcag gaagcttctg ccggttagct360ggccacgata tcaactattt ggctttgtca ggtgttctct caaaaattgg cagaagtggt420gagaatccgt atgccccgct gaatctcctg gctgactttg ctggtggtgg ccttatgtgt480gcactgggca ttataatggc tctttttgac cgcacacgca ctgacaaggg tcaggtcatt540gatgcaaata tggtggaagg aacagcatat ttaagttctt ttctgtggaa aactcagaaa600tcgagtctgt gggaagcacc tcgaggacag aacatgttgg atggtggagc acctttctat660acgacttaca ggacagcaga tggggaattc atggctgttg gagcaataga accccagttc720tacgagctgc tgatcaaagg acttggacta aagtctgatg aacttcccaa tcagatgagc780atggatgatt ggccagaaat gaagaagaag tttgcagatg tatttgcaaa gaagacgaag840
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權(quán)利要求
1.重組蛋白AMACR，其特征在于包含序列表中SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
2.重組蛋白AMACR的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)提取雄性激素依賴型人細(xì)胞株LNCaP中所含總RNA，以其作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQ ID NO.2所示的AMACR全基因序列；2)構(gòu)建增幅用重組質(zhì)粒pDrive-AMACR；3)構(gòu)建表達(dá)用重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR；4)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pRSET-B-AMACR至宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，獲得重組蛋白AMACR。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中還包括純化步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其中所述的純化步驟采用Ni-NTA樹脂。
5.抗AMACR抗體，其特征在于以重組蛋白AMACR為抗原，經(jīng)免疫動物后所得的抗體。
6.抗AMACR抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)以重組蛋白AMACR為抗原，多次免疫動物；2)采集免疫后全血，分離得血清，獲得抗AMACR抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述抗原還包括免疫佐劑。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中還包括采用rProtein A Sepharose Fast Flow樹脂進(jìn)行純化的步驟。
9.權(quán)利要求1所述重組蛋白AMACR在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用。
10.前列腺癌的體外檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)前列腺樣品的固定、包埋及切片；2)脫蠟和水化；3)用抗AMACR抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；4)脫水、透明、封片及鏡檢。
全文摘要
本發(fā)明提供AMACR的基因序列及其獲得方法、可在宿主細(xì)胞表達(dá)的重組質(zhì)粒pRSET－B－AMACR及其獲得方法、在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白AMACR及其制備方法。本發(fā)明還提供以重組蛋白AMACR與佐劑的混合物為抗原免疫動物的過程，以及免疫所得抗體及其制備方法。本發(fā)明還提供重組蛋白AMACR在制備前列腺癌診斷標(biāo)記物上的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/18GK101077886SQ20061002684
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日
發(fā)明者張輝, 羅宏偉 申請人:上海普洛康裕藥物研究院有限公司, 張輝, 羅宏偉