專利名稱：源自響尾蛇crotalus durissus terrificus蛇毒的止痛肽的類似化合物、它們的用途、組 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起痛覺喪失或在哺乳動物內(nèi)作用于阿片樣物質(zhì)受體的化合物。更具體而言，本發(fā)明涉及來自Crotalus durissusterrificus蛇毒并且具有止痛作用的肽的類似化合物、它們的用途、藥物組合物以及制備和純化方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)來自Sociedade Brasileira para o Estudo da Dor[巴西疼痛研究學(xué)會](SBED，2004 http://www.dor.org.br/dor_impactos.asp)的資料，至少有30％的個體在其一生中的某些時刻會受到疼痛的侵襲，而且這些個體中有10％至40％的人疼痛持續(xù)一天以上。疼痛是病痛、喪失工作能力的主要原因，并且它引起了嚴(yán)重的社會心理學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)后果。這些個體中大約有40％的人有許多天不能工作。盡管沒有有關(guān)巴西人口中疼痛病癥影響的官方統(tǒng)計，但它們的出現(xiàn)在近些年確實存在上升的趨勢。此外，世界范圍內(nèi)慢性疼痛的發(fā)生率在人口的7％至40％之間浮動。結(jié)果，遭受慢性疼痛折磨的那些人群中有50％至60％的個體變得部分或完全、暫時或永久性的喪失勞動能力，顯著影響了生活質(zhì)量。
有關(guān)在人類中觀察到蛇毒的治療效用可以回溯到20世紀(jì)初(Brasil，V.Biol.Med.So Paulo，17-21，1934，Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，60398-408，1950；Klobusitzky D.Anais doInstituto Pinheiros，13-23，1938)，而且文獻(xiàn)介紹了利用這些蛇毒作為治療劑的重要綜述。這些綜述描述了，例如，利用Crotalusadamanteus的蛇毒治療癲癇癥以及利用來自Agkistrodonpiscivorus，Vipera ruselli和Notechis scutatus的蛇毒作為止血劑(Klobusitzky，D.Anais do Instituto Pinheiros，13-23，1938)。
有關(guān)在人類中觀察到蛇毒的止痛特性的報道可以回溯到30年代初(Monaelesser & Taguet，1933，a pud on Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，6O398-408，1950)。就南美響尾蛇(Crotalus durissusterrificus)蛇毒(下文稱為”CdtV”)的止痛作用而言，最初的研究工作是由Vital Brazil博士進(jìn)行的。在這些研究中，Vital Brazil博士制備了高度稀釋的響尾蛇蛇毒溶液，命名為響尾蛇溶解物。所述的響尾蛇溶液被分發(fā)給巴西和國外的幾名醫(yī)師并用于治療不同的疼痛病癥和不適，主要是腫瘤來源的疼痛。該研究的結(jié)果證明了響尾蛇的蛇毒在不同疼痛綜合癥的治療中非常有效(Brazil，V.Biol.Med. Paulo，17-21，1934，Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，60398-4O8，1950)。
關(guān)于蛇毒來源產(chǎn)物在治療引起疼痛的疾病中的用途，InstituteButantan研究所通過將這些蛇毒與甲醛的混合對所謂減毒毒液產(chǎn)品的開發(fā)是值得強(qiáng)調(diào)的。這些產(chǎn)品預(yù)計用于治療不同的疼痛性疾病，尤其是在通常的止痛劑無效的情況下。由于此產(chǎn)品可取代嗎啡用于治療，所以此產(chǎn)品被證實具有強(qiáng)止痛效用。減毒毒液還被證實具有持久的止痛效果，因為患者在接受減毒毒液治療時通常在兩次給藥之間間隔1至3天。
盡管Vital Brazil博士所觀察到的結(jié)果顯示了Crotalusdurissus terrificus蛇毒的止痛作用，但天然蛇毒中存在的導(dǎo)致止痛效果的活性物質(zhì)仍然是未知的。
利用疼痛評估的實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行此蛇毒止痛作用機(jī)制的研究始于1990年。
當(dāng)用熱板試驗進(jìn)行評估時，這些研究顯示出施用于小鼠中的CdtV誘發(fā)了持久的抗疼痛效果，表明此蛇毒通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)能引起痛覺喪失(Giorgi R.等，Toxicon，311257-65，1993；Picolo G.等Toxicon 36223-227，1998)。藥理學(xué)研究顯示在熱板試驗中所觀察到的抗疼痛作用中涉及κ阿片樣物質(zhì)受體(Giorgi R.等，Toxicon，311257-65，1993；Brigatte P.等Toxicon 391399-1410，2001)。長期利用蛇毒進(jìn)行治療在熱板試驗中引起了對抗疼痛作用的耐受性，但不是驅(qū)體依賴。耐受性是通過藥效機(jī)制介導(dǎo)的。未觀察到與嗎啡的交叉耐受性(Brigatte P.等Toxicon 391399-1410，2001)。另一方面，由于所述蛇毒的持久抗疼痛作用(單次用藥5天后)，在開始治療后長達(dá)65天內(nèi)，如果每隔5天施用一次所述蛇毒則不顯現(xiàn)出耐受現(xiàn)象(Brigatte P.等，Toxicon 391399-1410，2001)。
除了在熱板試驗中觀察到的效果之外，在兩個炎性疼痛的實驗?zāi)Ｐ椭凶C實了天然蛇毒的止痛作用在乙酸誘發(fā)的腹部扭曲(abdominalcontortions)模型中(Giorgi R.等，Toxicon，311257-65，1993)和角叉菜膠誘發(fā)的痛覺過敏模型中(Picolo G.et al.，Eur JPharmacol 39155-62，2000)。在角叉菜膠模型中，蛇毒的止痛效果也是長效的，在施用單劑所述蛇毒后效果持續(xù)至多達(dá)5天。此效果涉及外周δ阿片樣物質(zhì)受體的參與(Picolo G.等.，Eur J Pharmacol39155-62，2000)。
另一方面，在前列腺素所誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中，響尾蛇蛇毒的抗疼痛作用是由κ和δ阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的(Picolo G.等，Eur JPharmacol 46957-64，2003)。在兩個痛覺過敏模型中(角叉菜膠和前列腺素)，CdtV所誘導(dǎo)的抗疼痛作用還涉及L-精氨酸/一氧化氮(NO)/cGMP途徑的激活、cGMP-依賴性蛋白激酶的激活以及ATP-敏感性鉀通道的活化(Picolo G.等Eur J Pharmacol 46957-64，2003，Picolo和Cury，Life Science 75559-73，2004)。
應(yīng)重點強(qiáng)調(diào)的是所述蛇毒還能在持續(xù)疼痛的模型中誘發(fā)抗疼痛作用，如在大鼠坐骨神經(jīng)慢性收縮引起的神經(jīng)性疼痛模型中(Gutierrez，V.P.，Chacur，M.，Sampaio，S.C.，Picolo，G.，Cury，Y.Memórias do Instituto Butantan vol.60，p.50，2003)和在大鼠足底內(nèi)注射Walker 256癌細(xì)胞引起的癌癥疼痛模型中(Brigatte，P.，Sampaio S.C.，Gutierrez，V.，Curi，R.Rangel-Santos，A.C.，Guerra，J.L.，Cury Y.，XXXVI Congresso Brasileiro deFarmacologia e Terapêutica Experimental，Programa e Resumos，p.195，2004)。神經(jīng)性疼痛模型中的蛇毒作用效果也是長期的，因為在施用單劑量蛇毒后長達(dá)3天時間都能檢測到此效果。正如在角叉菜膠或前列腺素所誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中所觀察到的，κ和δ阿片樣物質(zhì)受體、L-精氨酸/NO/cGMP途徑以及ATP-敏感型鉀通道的開放是造成此模型中蛇毒產(chǎn)生效果的原因(Gutierrez，V.P.，Chacur，M.，Sampaio，S.C.，Picolo，G.，Cury，Y.Memórias do InstitutoButantan，vol.60，p.50，2003)。
蛇的毒液是由蛋白質(zhì)和生物學(xué)活性肽的復(fù)雜混合物組成的。從這些蛇毒中已分離了幾種具有不同治療指征的活性物質(zhì)。例如，我們擁有專利US5182260(Maraganore，J.H.，1993)，其中從南美水腹蛇(Water Moccasin)蛇毒中分離了血小板活化的多肽抑制劑；或者專利US5763403(Lyan，E.C.Y.，1998)，其中從Agkistrodon halysbrevicaudus蛇的毒液中獲取了狼瘡抗凝蛋白；或者專利US6489451(Li，B.X.，2002)，其中從白花蛇(Agkistrodon acutus)的毒液中純化出抗血栓形成酶。關(guān)于疼痛治療中所用的產(chǎn)物，美國專利US6555109(Shulov，A.，2003)描述了一種分離自Vipera xanthinapalestinae蛇毒液的非毒性片斷，及其用于控制包括慢性疼痛在內(nèi)的不同類型疼痛的衍生產(chǎn)物。此外，美國專利US6613745(Gopalakrishnakone，P.，2003)介紹了所具有的氨基酸序列來自或基于眼鏡王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒中存在的止痛因子氨基酸序列的肽。
一種存在于Crotalus durissus terrificus蛇毒液中的毒素-響尾蛇胺的止痛活性也可在文獻(xiàn)中找到。研究證實，當(dāng)通過皮下或腹膜內(nèi)途徑給小鼠注射純化的響尾蛇胺時，存在止痛的劑量-反應(yīng)關(guān)系。止痛作用受納洛酮抑制，表明其中涉及了阿片樣物質(zhì)受體(Mancin C.A.等，Toxin 3612，1927-1937，1998)。
鴉片及其衍生產(chǎn)物是有效的止痛劑，它們還具有其它的藥理學(xué)效應(yīng)。內(nèi)源和外源的阿片樣物質(zhì)是用于控制疼痛，特別是慢性或難治的疼痛的最常用的止痛劑之一，例如，用于控制癌癥疼痛、神經(jīng)性疼痛和慢性炎癥疼痛。這些藥物，通過作用于特異的受體，在人類和動物中引起了痛覺喪失，改變了對有害化學(xué)、機(jī)械或熱刺激的病理生理學(xué)響應(yīng)(Yaksh，T.L.Acta Anaesth.Scand.4194-111，1997)。
至少有三個不同的內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)肽家族被確定腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽。各家族來自獨特的多肽前體并且具有特有的解剖學(xué)分布。這些前體被命名為前腦啡肽、阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原和強(qiáng)啡肽原，具有Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu氨基酸序列(其中Tyr、Gly、Phe、Met和Leu分別對應(yīng)于酪氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸)，位于阿片樣物質(zhì)肽的N末端部分(Przewlocki R.和Przewlocka B.Eur.J.Pha rmacol.42979-91，2001，Reisine T.和Pasternak，G.InThe Pharmacolcogical Basis of Therapeutics，Hardman J.G.e Limbird L.E.eds，9thed，New York，McGraw-Hill，pp.521-555，1996)。
阿片樣物質(zhì)通過作用于傳入神經(jīng)末梢，抑制腺苷酰環(huán)化酶，減少了cAMP的產(chǎn)生(Schultz，J.E.J.和Gross，G.J.Pharmacol.Ther.，89123-137，2001)并抑制了鈣通道的開放，從而阻斷了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放(Junien，J.L.和Wettstein，J.G.Life Science，512009-18，1992；Zaki，P.A.等Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，36379-401，1996；Yak sh，T.L.Acta Anaesth.Scand.4194-111，1997)。
此外，阿片樣物質(zhì)激活了L-精氨酸-一氧化氮-cGMP途徑，引起鉀通道開放，隨后細(xì)胞膜超極化(Ferreira，S.H.等，Eur.J.Pha rmacol.，1217225-7，1991；Ferreira，S.H.等Br.J.Pharmacol.，114303-8，1995；Nozaki-Taguchi，N.和Yamamoto，T.Anesth.Anal.，87388-93，1998；Amarante，L.H and Duarte，I.D.Eur JPharmacol.，45419-23，2002)。阿片樣物質(zhì)激動劑對K+通道的抗疼痛效應(yīng)涉及ATP敏感性和電壓依賴性K+通道(Welch，S.和Dunlow，L.D.J.Pharmacol.Exp.Ther.，267390-399，1993；Rodrigues，A.R A.和Duarte I.D.G.Br.J.Pharmacol，129110-114，2000；Schultz，J.E.J.和Gross，G.J.Pharmacol.Ther.，89123-137，2001)。
此外，幾項研究已顯示包括κ阿片樣物質(zhì)激動劑在內(nèi)的阿片樣物質(zhì)止痛劑影響了分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)(Li，J.G.等，J.Biol.Chem.，27412087-12094，1999；Eitan，S.等，J.Neuroscience，238360-8369，2003；Lesscher，H.M.B.等，Neuroscience，116139-144，2003)。
除了存在多種呈現(xiàn)阿片樣物質(zhì)活性的肽之外，多種阿片樣物質(zhì)受體的存在也是藥理學(xué)上得到表征的。因此，研究者認(rèn)為阿片樣物質(zhì)止痛劑通過與特異的受體相互作用發(fā)揮效用，所述受體由至少3個主要的種類組成μ(mu)、κ(kappa)和δ(delta)(Yaksh，T.L.Eur.J.Anaesthesiol.1201-243，1984)，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，具有獨特的藥理學(xué)活性、解剖學(xué)分布和功能(Junien，J.L.和Wettstein，J.G.Life Science，512009-2018，1992；Yaksh，T.L.Acta Anaesth.Scand.4194-111，1997)。
阿片樣物質(zhì)的中樞和外周作用是它們治療效用的重要組成部分。μ受體是造成阿片樣物質(zhì)的大部分止痛作用以及它們的某些不良影響的原因，諸如呼吸和心血管抑制、欣快癥、依賴性、鎮(zhèn)靜和幾種神經(jīng)內(nèi)分泌功能的改變[Brownstein，M.J.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，905391-5393，1993]。
這些二次效應(yīng)主要作為這些激動劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用的后果發(fā)生。這是疼痛控制中阿片樣物質(zhì)止痛劑使用不當(dāng)?shù)闹饕颉＆陌⑵瑯游镔|(zhì)受體可能在外圍更重要，盡管它們也引起中樞的痛覺喪失。除了痛覺喪失之外，這些受體調(diào)制胃腸運(yùn)動性和幾種激素功能。另一方面，κ阿片樣物質(zhì)受體誘發(fā)痛覺喪失而不引起μ受體所特有的不良影響，諸如便秘、發(fā)癢、呼吸抑制、驅(qū)體依賴和/或成癮。不過，κ受體保持某些中樞介導(dǎo)的作用，諸如鎮(zhèn)靜和煩躁不安，但不涉及驅(qū)體依賴(Vanvoigtlander等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2247-12，1983；Wood，P.L.和Iyengar，S.InThe opioid receptors.Pasternak，G.W.ed.Humana press，Clifion，N.Y.，1988)。這些受體負(fù)責(zé)平衡液體吸取、食物攝取、腸運(yùn)動性、溫度控制和幾種內(nèi)分泌功能(Leander，J.Pharmacol.Exp.Ther.，22735-41，1983；Leander等，J.Pharmacol.Exp.Ther.234，463-469，1985；Morley等.，Peptides 4，797-800，1983；Manzanares等，Neuroendocrinology52，200-205，1990；Iyengar等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，238，429-436，1986)。
嗎啡和可待因是臨床上最常用的阿片樣物質(zhì)止痛劑，被用作μ阿片樣物質(zhì)受體的激動劑。這些阿片樣物質(zhì)造成了眾所周知的不合需要的不良影響，例如，驅(qū)體依賴的產(chǎn)生。κ或δ受體激動劑分別通過作用于κ和δ阿片樣物質(zhì)受體達(dá)到止痛效果。這些激動劑超過例如嗎啡等典型μ受體激動劑的優(yōu)勢在于它們能夠造成痛覺喪失但不引起不合需要的針對嗎啡所描述的二次行為效應(yīng)。已知阿片樣物質(zhì)受體與其配體之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系是造成所述受體選擇性和特異性的原因。不過，有幾項研究表明阿片樣物質(zhì)受體與幾個膜區(qū)室的特異相互作用可有助于這些阿片樣物質(zhì)選擇性的與特異受體相互作用的能力(Janecka A.等Mini Rev Med Chem.2565-572，2002；Naito A.和Nishimura K.CurrTop Med Chem.4135-145，2004；Singh VK等Neuroimmunomodulation.4285-297，1997)。本發(fā)明涉及與腦啡肽、內(nèi)啡肽或強(qiáng)啡肽不同源的新肽，還涉及對κ阿片樣物質(zhì)受體具有優(yōu)先活性的合成肽。
通過文獻(xiàn)已知當(dāng)阿片樣物質(zhì)針對特異類型或亞型受體的特異性和選擇性提高時，用于治療目的的阿片樣物質(zhì)發(fā)生副作用的概率會下降。那些與κ和/或δ阿片樣物質(zhì)受體具有親和力的激動劑已被證實具有強(qiáng)止痛活性，而不出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，諸如驅(qū)體依賴、呼吸抑制和平滑肌組織運(yùn)動抑制等嗎啡和μ受體激動劑衍生物通常觀察到的效應(yīng)(Nagase，H.；Kawai，K.；Kawamura，K.；Hayakawa，J.；Endoh，T.；patent US6323212，2001)。阿片樣物質(zhì)引起的諸如驅(qū)體依賴和呼吸抑制等副作用是與這些藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用相關(guān)的。類似嗎啡、納洛酮、羥甲左嗎南、腦啡肽、內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽及類似物等傳統(tǒng)的阿片樣物質(zhì)通常是疏水分子。因此，這些阿片樣物質(zhì)能透過諸如血腦屏障等膜，很容易積聚在脂肪組織和器官內(nèi)。此滲透性還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的副作用相關(guān)，諸如欣快癥和成癮。此外，這些肽必須以高劑量施用，這樣就會引起與長期接觸阿片樣物質(zhì)有關(guān)的毒性反應(yīng)(專利US5602100；Brown，W.L.，1997)。在本領(lǐng)域中找到的某些專利建議聯(lián)合使用多種拮抗劑和激動劑，制劑形式或非制劑形式的，作為抗疼痛和抗炎制劑。這些研究建議利用在不同的疼痛途徑和/或發(fā)炎機(jī)制中具有伴隨作用的藥物組合物干擾這兩種過程(疼痛和發(fā)炎)的起因，例如，在諸如口腔和/或牙齒處置等外科手術(shù)過程中使用。這些制劑可以是5HT-2受體拮抗劑、5HT-3受體拮抗劑、組胺拮抗劑、五羥色胺激動劑、環(huán)加氧酶抑制劑、神經(jīng)激肽1受體拮抗劑、神經(jīng)激肽2受體拮抗劑、嘌呤受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑、緩激肽B1受體拮抗劑、緩激肽B2受體拮抗劑和μ阿片樣物質(zhì)受體激動劑。此外，在這些專利(專利US6420432；Demopulos，G.，2002；US2003096807 A1；Demopulos，G.，2003)中還介紹了所述的聯(lián)合使用藥物治療軟骨損傷。
在本領(lǐng)域中可發(fā)現(xiàn)許多有關(guān)阿片樣物質(zhì)肽、阿片樣物質(zhì)受體和阿片樣物質(zhì)受體激動劑和拮抗劑的分子藥理學(xué)和遺傳操作的工作。這些研究覆蓋了阿片樣物質(zhì)的生化和分子效應(yīng)、內(nèi)源阿片樣物質(zhì)神經(jīng)化學(xué)定位以及它們與行為相關(guān)的受體。此外，對這些阿片樣物質(zhì)與痛覺喪失和疼痛、壓力、耐受性和依賴性、學(xué)習(xí)和記憶、酒精和藥物濫用、性活動和激素活性、懷孕和內(nèi)分泌變化、一般的腦活動和運(yùn)動力、神經(jīng)系統(tǒng)障礙、胃腸、腎和肝功能以及心血管響應(yīng)的關(guān)系也進(jìn)行了研究(Bodnar，R和Hadjimarkou，Peptides，24，1241-1302，2003)。
在專利US5866346(Yu.L.，1999)中，Lei Yu介紹了利用強(qiáng)啡肽作為XOR1受體的配體的方法。因此，優(yōu)選作為κ阿片樣物質(zhì)受體激動劑的化合物可以是XOR1受體的配體。
盡管文獻(xiàn)中已描述了蛇毒以及作用于阿片樣物質(zhì)受體的肽的用途，但以純化形式包括口服途徑在內(nèi)施用時，存在于Crotalusdurissus terrificus蛇毒中的活性止痛物質(zhì)的特性或其效能仍然是未確定的。這些資料同樣并未解釋所述活性物質(zhì)的化合物類似物的效能以及它們對阿片樣物質(zhì)受體的特異作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于Crotalus durissus terrificus蛇毒液中存在的活性止痛物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及表征。它還確認(rèn)了所述物質(zhì)在以純化形式施用、包括口服途徑施用時的止痛作用。本發(fā)明還基于Crotalus durissusterrificus蛇毒中存在的活性物質(zhì)的類似化合物具有止痛效力的事實，以及基于所述化合物對阿片樣物質(zhì)受體發(fā)揮作用的事實。
就第一個主要的獨立方面而言，本發(fā)明涉及存在于Crotalusdurissus terrificus蛇毒液中的止痛物質(zhì)的新類似化合物，它們具有酷似結(jié)構(gòu)如下化合物的藥理學(xué)特性Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQID NO1)其中Xaa通常是焦谷氨酸，R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，R2＝Pro或Arg，R3＝Glx或Asx或Gly，R4＝Asn或Gln或Leu，R5＝Glx或Asx，R6＝Glx或Lys，它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，除了當(dāng)所述的化合物是十四肽，其中的R1＝Phe，R2＝Pro，R3＝Glu，R4＝Asn，R5＝Glu以及R6＝Gln時，第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO2)。
更具體而言，本發(fā)明涉及相應(yīng)于SEQ ID NO1的化合物，其特征在于第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO4)；尤其是具有氨基酸序列Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys的十四肽的類似化合物，其中Xaa是焦谷氨酸，且第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋相連(SEQ ID NO2)；例如呈現(xiàn)肽序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的十四肽。
依照本發(fā)明，“類似化合物”的概念適用于具有部分化學(xué)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)(即使是部分)序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4肽的與其止痛作用相關(guān)的藥理學(xué)特性或者其與阿片樣物質(zhì)受體直接或間接相互作用(激動劑或拮抗劑)的化合物。
作為補(bǔ)充的方面，本發(fā)明還包括模擬包含SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO 4的肽的藥理學(xué)特性的化合物，其特征在于增加、刪除或改變模擬肽性質(zhì)以調(diào)節(jié)它們的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性，包括用一個或多個L型氨基酸替代D型氨基酸或非常規(guī)氨基酸，或者甚至在第4位出現(xiàn)脯氨酸殘基或在第5或第10位出現(xiàn)γ-羧化的谷氨酸殘基。D型氨基酸和非常規(guī)氨基酸的例子在文獻(xiàn)中有所描述(不局限于此)，例如，在專利US6613745(新加坡國立大學(xué)，2003)或書籍“A Textbook of Drug Design and Development”，第二版，Harwood Academic Publishers，Singapore中。
作為另一補(bǔ)充方面，本發(fā)明包括呈現(xiàn)序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽的類似化合物，其特征在于被純化或是純化形式的。
依照本發(fā)明，術(shù)語“純化的”相當(dāng)于化合物基本上無細(xì)胞成分、蛇毒的其它組分、培養(yǎng)基或所述“化合物”化學(xué)合成中所用試劑等其它物質(zhì)產(chǎn)生的污染物。優(yōu)選的，“純化的化合物”在量上大于所述混合物干重的50％，更優(yōu)選的，它的量大于混合物干重的90％，尤其是大于95％。
作為第二個主要的獨立方面，本發(fā)明包括藥物組合物，其特征在于含有一種或多種藥用可接受載體或稀釋劑以及包含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物，它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，優(yōu)選純化的。
本發(fā)明中所包括的藥物組合物的例子有，例如，溶液、懸浮液、糊劑、膠囊、凝膠、片劑、粉劑、顆粒劑、親媒膠體、控釋體系、微粒、微球體或毫微球體、脂質(zhì)體和有機(jī)物涂層相關(guān)制劑，等等。本發(fā)明中涉及的藥物組合物的可能性施用途徑有口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部、肺部、鼻內(nèi)、口腔、直腸、舌下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)等等，以即時的、延時的、延長的或控釋的形式。本發(fā)明中所涉及的藥物形式、載體、稀釋劑和施用途徑的例子可參閱文獻(xiàn)(但不局限于此)，例如，書籍Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，USA。
作為補(bǔ)充方面，本發(fā)明還包括特征在于在同一劑量單位或以試劑盒形式含有一種或多種活性成分的藥物組合物，所述的活性成分與呈現(xiàn)序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的肽的類似化合物相關(guān)。
作為另一特定的方面，當(dāng)組合物是液體、半固體或用于重構(gòu)的干燥形式時，這些組合物中包含水基稀釋劑。作為本發(fā)明的另一具體方面，所述組合物可用于口服，這種組合物呈現(xiàn)出超過可注射組合物的優(yōu)勢，因為使用這些施用途徑能減輕患者痛苦并更具有治療可接受性。
就第三個主要的獨立方面而言，本發(fā)明包括使用一種或多種含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，優(yōu)選為純化的或純的，用于制備止痛用藥物組合物或用于治療、診斷或預(yù)防由阿片樣物質(zhì)受體所調(diào)控的疾病。
作為一個特定的方面，本發(fā)明包括使用一種或多種含序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，優(yōu)選為純化的或純的，用于制備具有直接或間接的阿片樣物質(zhì)受體，尤其是κ阿片樣物質(zhì)受體的激動劑或拮抗劑特性的組合物。
作為另一具體方面，本發(fā)明包括使用一種或多種含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，優(yōu)選為純化的或純的，作為止痛物質(zhì)，尤其是用于口服藥物組合物和/或在使用后長達(dá)5天內(nèi)具有長期止痛效用的化合物。
作為另一具體方面，本發(fā)明包括利用一種或多種含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，優(yōu)選已純化的或純的，制備組合物用于治療、診斷或預(yù)防急性或慢性疼痛，包括癌癥相關(guān)性疼痛、神經(jīng)性疼痛如三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、交感神經(jīng)性營養(yǎng)不良、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、后腦血管意外(中風(fēng))、糖尿病神經(jīng)病變、瘤形成相關(guān)性疼痛、纖維肌痛、牙疼、痛經(jīng)、腎絞痛、月經(jīng)絞痛或膽絞痛、關(guān)節(jié)痛、包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎、眼內(nèi)高壓、關(guān)節(jié)鏡檢查后疼痛、婦產(chǎn)科腹腔鏡檢查后疼痛、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)所產(chǎn)生的疼痛、前列腺切除術(shù)后后陰部根疼痛、胸廓切開術(shù)后疼痛、兒科患者扁桃體切除術(shù)后疼痛、子宮切除術(shù)后疼痛、剖腹產(chǎn)術(shù)后疼痛或燒傷痛、可卡因或阿片樣驅(qū)體依賴、細(xì)胞增殖、小細(xì)胞肺癌、抑郁癥和精神病、炎癥、由于血管發(fā)生增加造成的相關(guān)疾病、創(chuàng)傷、冠狀動脈局部缺血性疾病、帕金森氏癥和運(yùn)動障礙、肝腦病、認(rèn)知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝膽汁郁積造成的發(fā)癢或多囊卵巢婦女的高胰島素血癥。
就第四個主要的獨立方面而言，本發(fā)明包括利用含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物(優(yōu)選為純化的或純的)治療、診斷和預(yù)防疼痛性疾病或由阿片樣物質(zhì)受體所介導(dǎo)的疾病的方法。
作為一特定方面，本發(fā)明包括利用含序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物治療、診斷和預(yù)防由阿片樣物質(zhì)受體所調(diào)控的疾病的方法，所述的化合物對于阿片樣物質(zhì)受體，尤其是對κ阿片樣物質(zhì)受體具有直接或間接的激動劑或拮抗劑的特性。
就另一特定方面而言，本發(fā)明包括特征在于利用含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物，通過口服途徑和/或利用在施用后至多達(dá)5天內(nèi)具有持久止痛效果的藥物組合物治療、診斷和預(yù)防疼痛性疾病的方法。
就另一特定方面而言，本發(fā)明包括利用含序列SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物治療、診斷和預(yù)防諸如急性或慢性疼痛等病癥的方法，所述疼痛包括癌癥疼痛、神經(jīng)性疼痛如三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、交感神經(jīng)性營養(yǎng)不良、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、后腦血管意外(中風(fēng))、糖尿病神經(jīng)病變、瘤形成相關(guān)性疼痛、纖維肌痛、牙疼、痛經(jīng)、腎絞痛、月經(jīng)絞痛或膽絞痛、關(guān)節(jié)痛、包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎、眼內(nèi)高壓、關(guān)節(jié)鏡檢查后疼痛、婦產(chǎn)科腹腔鏡檢查后疼痛、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)所產(chǎn)生的疼痛、前列腺切除術(shù)后后陰部根疼痛、胸廓切開術(shù)后疼痛、兒科患者扁桃體切除術(shù)后疼痛、子宮切除術(shù)后疼痛、剖腹產(chǎn)術(shù)后疼痛或燒傷痛、可卡因或阿片樣驅(qū)體依賴、細(xì)胞增殖、小細(xì)胞肺癌、抑郁癥和精神病、炎癥、由于血管發(fā)生增加造成的相關(guān)疾病、創(chuàng)傷、冠狀動脈局部缺血性疾病、帕金森氏癥和運(yùn)動障礙、肝腦病、認(rèn)知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝膽汁郁積造成的發(fā)癢或多囊卵巢病婦女的高胰島素血癥。
就第五個主要的獨立方面而言，本發(fā)明包括含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽的類似化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物的生產(chǎn)和純化方法。
作為一個特定方面，本發(fā)明包括含序列SEQ ID NO 4的化合物、它們的鹽和類似化合物的生產(chǎn)方法，所述的化合物在第7和14位的半胱氨酸殘基之間含有一個分子內(nèi)二硫橋，其特征在于涉及利用酶促試劑或通過氧化劑(諸如碘、空氣、氧氣或鐵氰化鉀)的氧化作用氧化第7和第14位巰基的步驟，或者甚至其特征在于涉及其結(jié)構(gòu)中含所述氨基酸序列的化合物的純化步驟。
其中R5＝Glx或Asx，R6＝Glx或Lys其中半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋聯(lián)接。
另一特定的方面是，本發(fā)明包括含有序列SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物的純化方法，通過利用選擇性沉淀和/或色譜法分離純化合成的、半合成的或生物來源的化合物的混合物來完成，所述的生物來源混合物有例如Crotalus durissus terrificus蛇的天然毒液或甚至重組微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物或它們相應(yīng)的裂解產(chǎn)物。
在選擇性沉淀的情況下，使用了溶于乙腈和水混合物中的三氟乙酸溶液，尤其是在大約1∶2比例的乙腈和水的混合物中三氟乙酸的濃度大約為0.1％特別有效。
就色譜分離而言，利用反相HPLC柱并應(yīng)用具有梯度濃度的流動相，使用溶于乙腈和水的三氟乙酸溶液作為流動相尤其有效。
具有序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4的肽的類似化合物的合成和純化方法的例子包括，例如(但不局限于)，以下出版物中所描述的“Amino Acid and PeptideSynthesis”，2ndEdition，Oxford University Press，Bath，GreatBritain；Principles of Biochemistry，3rdEdition，WorthPublishers，USA。
就第六個主要的獨立方面而言，本發(fā)明包括模擬具有氨基酸序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的肽的止痛活性的化合物的鑒定方法。
作為第六個特定方面，本發(fā)明包括用于鑒定模擬具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽的止痛活性的化合物的方法，其特征在于包括以下步驟a)具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽的生物學(xué)活性的評估，以測定其止痛活性，b)測試化合物(對照)的生物學(xué)活性評估，以測定止痛活性和c)將所獲得的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的生物學(xué)活性的結(jié)果與所獲得的測試化合物(對照)的結(jié)果進(jìn)行比較。
或者a)引入已標(biāo)記的具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽使其接觸測試樣品，b)將測試化合物加入與已標(biāo)記的具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽接觸的測試樣品中，和c)評估已標(biāo)記的氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO4與測試樣品之間的肽連接。
模擬肽的止痛活性的化合物的鑒定方法的例子參閱(不局限于)，例如，專利US5877026(Lampe R.A.，1999)。
具體實施例方式
通過以下非限制性的實驗實施例對本發(fā)明進(jìn)行補(bǔ)充性說明實施例1.從Crotalus durissus terrificus的蛇毒中分離和純化ENPAK-k將來自Crotalus durissus terrificus蛇的20mg凍干未精制的毒液(由Butantan研究所的爬蟲學(xué)實驗室提供)稀釋于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的1.5ml比例為1∶2的乙腈/水溶液中。上清液用Sep-Pak C18(2g，12cc，Millipore)柱分級分離并用不同濃度的乙腈/水(含0.1％的TFA)洗脫。此步驟重復(fù)60次并將獲自各個乙腈/水濃度級分的收集液凍干。
將獲自20％乙腈/水(含0.1％的三氟乙酸-TFA)洗脫的級分溶于水中并加到HPLC反相柱(Shimadzu Co.Ltd.)上，用6mm×150mm的CAPCELL PAK C18柱(Shiseido Co.Ltd.)，洗脫液為線性梯度15％至35％的乙腈/水(含0.1％的TFA)，以1ml/分鐘流速在室溫下洗脫25分鐘。用紫外分光光度儀監(jiān)測，在215nm波長處收集獲自保留時間為10.7分鐘的級分。
所獲得的級分再次進(jìn)行HPLC，利用6mm×150mm的CAPCELL PAKC18柱，洗脫液為15％乙腈/水(含0.1％的TFA)的恒溶劑，流速1ml/分鐘室溫洗脫，用紫外分光光度儀監(jiān)測，在215nm波長處收集獲自保留時間為14分鐘的級分。用Ettan MALDI-Tof/Pro(AmershamBiosciences)通過MALDI-TOF質(zhì)譜測定法證實了所得到的級分具有高純度，分子離子峰[(M+H)+，單一同位素的]在m/z 1534.6處。將此級分凍干并在本發(fā)明中被命名為ENPAK-k。
實施例2.ENPAK-k氨基酸序列的測定由于N末端封閉，序列不能通過Edman降解獲得，所以通過質(zhì)譜測定法測定所產(chǎn)生肽的氨基酸序列。
最初，將二硫橋還原并烷基化。將得到的純ENPAK-k試樣溶于10μl水中。在此溶液中加入溶于25mM碳酸氫銨緩沖液中的5mM二硫蘇糖醇10μl，將溶液在60℃保溫30分鐘。冷卻至室溫后，加入溶于25mM碳酸氫銨緩沖液中的55mM碘乙酰胺溶液10μl，然后室溫放置30分鐘。此產(chǎn)物的MALDI-TOF MS顯示出在m/z1650.7處的分子離子峰[(M+H)+，單一同位素的]，證明了在天然肽中存在二硫橋。
通過ESI串聯(lián)質(zhì)譜法用Q-Tof UltimaTM(Micromass)分析還原的烷基化肽。來自m/z 825.90處的雙電荷離子[(M+2H)2+，單一同位素的]的串聯(lián)質(zhì)譜提供了b和y離子系列，給出了14個假定氨基酸殘基的序列，表示為pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys/Gln-Gly-Glu-Ser-Lys/Gln-Pro-Cys，分析用質(zhì)譜測定法獲得的數(shù)據(jù)，其中pGlu表示焦谷氨酸殘基，而Lys/Gln意味著在此位置可能是Lys或Gln。兩個Cys殘基通過二硫橋相互連接。
這樣，就會有4種可能的序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO6、SEQ ID NO7對應(yīng)于ENPAK-k。以下是獲得的序列 其中半胱氨酸殘基通過分子內(nèi)二硫橋連接，而由三字母代碼表示的氨基酸分別相應(yīng)于pGlu＝焦谷氨酸Phe＝苯丙氨酸Ser＝絲氨酸Pro＝脯氨酸Glu＝谷氨酸Asn＝天冬酰胺Cys＝半胱氨酸Gln＝谷氨酰胺Lys＝賴氨酸Gly＝甘氨酸當(dāng)將這些氨基酸序列與保存于Swiss Prot數(shù)據(jù)庫中的已知蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較時，顯示出肽SEQ ID NO2與crotapotin的C末端部分的氨基酸序列具有同一性，crotapotin是來自Crotalus durissusterrificus種的蛇毒的響尾蛇毒素的無毒酸性亞基(Faure G，Guillaume JL，Camoin L，Saliou B，Bon C.Biochemistry，1991，13，8074-8083)；除了crotapotin的C末端部分中半胱氨酸殘基不象在肽SEQ ID NO2中那樣存在分子內(nèi)二硫橋之外。
來自Crotalus durissus terrificus種蛇毒的響尾蛇毒素的無毒酸性亞基crotapotin的C末端部分pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys(SEQ ID NO8)實施例3.肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQID NO7的合成，作為非限制性的例子通過Fmoc策略，用H-Cys(Trt)-2-ClTrt樹脂作為固相支持物以人工固相肽合成獲得肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
然后通過在室溫加入乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷(1∶1∶8)使各個合成的肽從樹脂上裂解下來，歷時1小時，隨后通過TFA/硫苯甲醚/1，2-乙二硫醇(94∶5∶1)溶液在室溫作用2小時脫保護(hù)。經(jīng)所述處理后，在TFA溶液中加入乙醚以沉淀所述的肽。用乙醚將沉淀洗3次以獲得SH-游離的未精制肽。通過用0.1M的甲醇和碘溶液室溫處理30分鐘，然后加入0.1M抗壞血酸的水溶液使二硫橋形成。之后，用20×150mm的YMC-Pak ODS(Yamamura Kagaku Co.Ltd.)通過反相HPLC純化所獲取的粗肽，洗脫液為含0.1％TFA的線性梯度15％至35％的乙腈/水，以流速8ml/分鐘室溫洗脫25分鐘。在HPLC和質(zhì)譜測定中將所產(chǎn)生的合成肽與天然ENPAK-k肽進(jìn)行比較
其中的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接，證明了肽SEQ ID NO2與天然ENPAK-k相同。更進(jìn)一步的，肽SEQ ID NO2顯示出與天然ENPAK-k相同的止痛活性。肽SEQ ID NO3也被證明有止痛活性，而另兩種肽(SEQ ID NO6和SEQ ID NO7)則在相似的條件下顯示出無活性。
基于序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的分子模擬研究，證實了本發(fā)明的其它重要序列Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQID NO1)尤其是 其中Xaa通常是焦谷氨酸，R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，R2＝Pro或Arg，R3＝Glx或Asx或Gly，R4＝Asn或Gln或Leu，R5＝Glx或Asx，R6＝Glx或Lys。
實施例4.在各純化階段的止痛組分的鑒定大鼠爪壓力試驗為了評估動物的疼痛敏感性，使用了由Butantan研究所的Biotério中心提供的重量在170-190g之間的Wistar雄性大鼠。將動物供養(yǎng)在實驗室中，使其處于光照和黑暗各12小時的循環(huán)，并將溫度控制在22±1℃，動物可隨意攝取水和食物。所用的方案得到Butantan研究所的學(xué)會動物保護(hù)委員會(CEUAIB)的認(rèn)可，方案編號是019/2000。
使用大鼠爪壓力試驗評估疼痛敏感性(Analgesy-Meter ugoBasile，Italy)，按照Randall & Selitto所述的方法進(jìn)行(RandallL.O.和Selitto J.J.Arch.Intern.Pharmacodyn.111209-219，1957)。
在此試驗中，將克(g)級別并強(qiáng)度漸增(16g/s)的力持續(xù)施加于大鼠后爪之一的背部表面，當(dāng)動物作出反應(yīng)“抽回”爪子時此作用力被中斷。在此模型中，疼痛閾值表示為引起反應(yīng)所必需的力(g)。此試驗在誘發(fā)痛覺過敏之前(初始測量)和之后3小時(最終測量)時進(jìn)行。
制備前列腺素E2(PGE2)貯液用于誘發(fā)痛覺過敏，即，將500μg的PGE2溶于1ml乙醇中。在使用的時候，將此貯液重稀釋于無菌鹽水中。所用的前列腺素的劑量是100μl鹽水中含100ng，通過腹膜內(nèi)注射途徑施用。在注射PGE2后3小時評估痛覺過敏情況。
在每步純化中，將所獲得的物質(zhì)稀釋于11ml體積的鹽水中。每只動物接受2ml的此溶液，在臨誘發(fā)痛覺過敏之前通過口服途徑給予。用給予鹽水的動物作為對照。
實施例5.分離自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽ENPAK-k的抗疼痛作用效力及持續(xù)時間的評估將依照實施例1純化60mg粗蛇毒分離的天然肽ENPAK-k稀釋于33ml體積的鹽水中。在臨誘發(fā)痛覺敏感之前通過口服(p.o.)使每只動物接受2ml此溶液。將口服接受鹽水的動物用作對照。
使用大鼠爪壓力試驗評估疼痛敏感性。疼痛閾值由縮回爪子所必需的力(以克計)表示，在口服天然肽(ENPAK-k)或鹽水(對照組)之前(0時間點)和之后3、72和120小時(最終測量)時測定此值。在每次最終測量之前3小時注射用作痛覺過敏劑的前列腺素(100ng/只爪子)。表1給出的數(shù)據(jù)是每組5只動物的平均值±S.E.M。
表1分離自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽(ENPAK-k)的抗疼痛作用的效力和持續(xù)時間

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量此實施例顯示了分離自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽ENPAK-k的有效性和持久的抗疼痛作用。
實施例6.在作為非限制性例子的前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中合成肽SEQ ID NO2的止痛活性的劑量-反應(yīng)曲線將不同劑量的合成肽SEQ ID NO2稀釋于鹽水中并在臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前通過不同途徑給予。將通過同一途徑接受鹽水的動物用作對照。
通過足底內(nèi)注射途徑(i.pl.)給予100ng/只爪子劑量的前列腺素E2誘導(dǎo)痛覺過敏。在注射PGE2之前(初始測量-IM)和注射之后3小時(最終測量-FM)時評估痛覺過敏情況。
使用大鼠爪壓力試驗評估疼痛敏感性。疼痛閾值由抽回爪子所必需的力(以克計)表示，在足底內(nèi)注射前列腺素E2(100ng/條腿)之前(初始測量)和注射之后3小時(最終測量)時測定此值。在痛覺過敏刺激之前通過以下途徑和劑量給予合成肽A)口服途徑，2ml體積，劑量為0.0016；0.008；0.04；0.2；1；5和25μg/kg，在臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前給予(表2)。
B)足底注射途徑，50μl體積，劑量為0.00000256；0.0000128；0.00032和0.0016μg/只爪子，在臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前給予(表3)。
C)靜脈內(nèi)注射途徑，200μl體積，劑量為0.0000128，0.000064，0.00032，0.0016和0.008μg/kg，臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前給予(表4)。
D)測試一個附加的組，以嗎啡作為陽性對照。口服嗎啡，劑量為0.004；0.2；1和5μg/kg(表5)。
通過各個途徑給予鹽水用作所有實驗中的對照。
結(jié)果分析是比較初始測量和最終測量的平均值，或者在測定時，比較不同實驗組獲取的平均值。此數(shù)據(jù)用于確定ED50、ED60和ED90。
在表2、3、4和5中IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克表示的重量；當(dāng)口服和靜脈注射時，肽劑量以μg/kg表示，或者當(dāng)足底途徑給予時，劑量以μg/只爪子表示。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M。
表2.在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中經(jīng)口服途徑給予合成肽SEQ ID NO2的止痛活性的劑量-反應(yīng)曲線

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異這些結(jié)果顯示了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中口服給予合成肽SEQ ID NO2的強(qiáng)止痛作用。為了測定50、60和90％的有效劑量，分析數(shù)據(jù)確定疼痛閾值(痛覺過敏)降低的百分率，比較最終和初始測量值，然后確定痛覺過敏逆轉(zhuǎn)的百分率，比較處理組(肽)和對照組(鹽水)。用CurveExpert 1.3程序分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)果證明在此例中所述肽的50、60和90％有效劑量分別是0.004146、0.006348和0.02106μg/kg。特別值得注意的是只有0.0016、0.008、0.04和0.2的劑量被用于確定有效劑量。
表3在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中經(jīng)足底內(nèi)注射途徑給予合成肽SEQ ID NO2的止痛活性的劑量-反應(yīng)曲線

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異這些結(jié)果顯示了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中通過足底內(nèi)注射途徑給予合成肽SEQ ID NO2的強(qiáng)止痛作用。為了測定50、60和90％的有效劑量，分析數(shù)據(jù)確定疼痛閾值(痛覺過敏)降低的百分率，比較最終和初始測量值，然后確定痛覺過敏逆轉(zhuǎn)的百分率，比較處理組(肽)和對照組(鹽水)。用CurveExpert 1.3程序分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)果證明在此例中所述肽的50、60和90％有效劑量分別是0.000002327、0.000004904和0.0028758μg/kg。
表4在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中經(jīng)靜脈內(nèi)注射途徑給予合成肽SEQ ID NO2的止痛活性的劑量-反應(yīng)曲線

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異這些結(jié)果顯示了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中通過靜脈內(nèi)注射途徑給予合成肽SEQ ID NO2的強(qiáng)止痛作用。為了測定50、60和90％的有效劑量，分析數(shù)據(jù)確定疼痛閾值(痛覺過敏)降低的百分率，比較最終和初始測量值，然后測定痛覺過敏逆轉(zhuǎn)的百分率，比較處理組(肽)和對照組(鹽水)。用CurveExpert 1.3程序分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)果證明在此例中所述肽的50、60和90％有效劑量分別是0.0000458、0.0002144和0.002701μg/kg。
表5在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中經(jīng)口服途徑給予嗎啡的止痛活性的劑量-反應(yīng)曲線

嗎啡劑量＝μg/kg*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異這些結(jié)果顯示了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中通過口服途徑施加嗎啡的止痛作用。為了測定50、60和90％的有效劑量，分析數(shù)據(jù)確定疼痛閾值(痛覺過敏)降低的百分率，比較最終和初始測量值，然后測定痛覺過敏逆轉(zhuǎn)的百分率，比較處理組(肽)和對照組(鹽水)。用CurveExpert 1.3程序分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)果證明在此例中所述肽的50、60和90％有效劑量分別是0.0551516、0.100504和0.326728μg/kg。
實施例7.在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中合成肽SEQ IDNO2的抗疼痛作用持續(xù)時間的評估在證明了所述合成肽在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中的抗疼痛作用之后，進(jìn)一步研究此作用的持續(xù)時間。用大鼠爪壓力試驗評估疼痛敏感性。疼痛閾值由抽回爪子的反應(yīng)所必需的力(以克計)表示，在口服合成肽(1μg/kg)或鹽水(對照組)之前(初始測量)和之后24、48、72、96、120和144小時(最終測量)時測定此值。在每次最終測量前3小時對不同的組給予劑量為100ng/只爪子的PGE2(表6)。
表6在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用的持續(xù)時間

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量這些結(jié)果表明所述肽的抗疼痛作用在單次給藥后長達(dá)120小時仍能檢測到。
實施例8.在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中阿片樣物質(zhì)受體參與合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用的評估使用大鼠爪壓力試驗評估疼痛敏感性。疼痛閾值由誘使其抽回爪子所必需的力(以克計)表示，在足底內(nèi)注射前列腺素E2(100ng/只爪子)之前(初始測量，IM)和之后3小時(最終測量，F(xiàn)M)時測定此值。在臨給予痛覺過敏刺激物(PGE2)之前口服合成肽(1μg/kg)或鹽水(對照組)。通過足底內(nèi)注射途徑(i.pl.)給予ICI174，864-ICI(10μg/只爪子)、δ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑、nor-Binalthorphimine-BNI(50μg/條腿)、κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑和CTOP(20μg/條腿)、μ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑，同時伴隨著注射PGE2(表7)。數(shù)據(jù)顯示的是每組5只動物的平均值±S.E.M。
此外，在以5μg/kg劑量的所述肽誘發(fā)的抗疼痛作用中還檢測了κ和δ阿片樣物質(zhì)受體(表8)。數(shù)據(jù)顯示的是每組5只動物的平均值±S.E.M。
表7在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中阿片樣物質(zhì)受體參與合成肽(1μg/kg)的抗疼痛作用的評估

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量這些數(shù)據(jù)表明了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中，κ阿片樣物質(zhì)受體與合成肽SEQ ID NO2(1μg/kg)的抗疼痛作用有關(guān)。
表8在前列腺素E2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中阿片樣物質(zhì)受體參與合成肽(5μg/kg)的抗疼痛作用的評估

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量這些數(shù)據(jù)表明了在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中，甚至在使用高劑量(5μg/kg)合成肽時，κ阿片樣物質(zhì)受體也與合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用有關(guān)。
實施例9.在作為非限制性例子的角叉菜膠誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中合成肽SEQ ID NO2的止痛活性在角叉菜膠誘導(dǎo)的炎性痛覺過敏中評估所述合成肽的抗疼痛作用。在角叉菜膠-誘導(dǎo)炎性痛覺過敏(200μg/只爪子)之前(初始測量)和之后3小時(最終測量)時進(jìn)行大鼠爪壓力試驗。在臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前以1μg/kg的劑量經(jīng)口服途徑給予所述的合成肽(2ml)(表9)。將以相同途徑給予的鹽水用作對照。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M.。
表9在角叉菜膠誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量此結(jié)果表明合成肽也能在角叉菜膠誘導(dǎo)的炎性痛覺過敏模型中產(chǎn)生抗疼痛作用。
實施例10.在角叉菜膠-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中測定鴉片樣物質(zhì)受體參與合成肽SEQ ID NO2的止痛活性的情況如同在PGE2模型中所測定的，研究了在角叉菜膠-誘導(dǎo)的痛覺過敏中阿片樣物質(zhì)受體參與肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用的情況(表10)。因此，用特異的μ受體拮抗劑CTOP(20μg/只爪子)、特異的κ受體拮抗劑nor-BNI(50μg/只爪子)或特異的δ受體拮抗劑ICI174.864(10μg/只爪子)處理動物，經(jīng)足底內(nèi)途徑伴隨著角叉菜膠注射。在臨加角叉菜膠之前口服1μg/kg劑量的肽。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M.。
表10在角叉菜膠-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中評估阿片樣物質(zhì)受體參與合成肽(1μg/kg)的抗疼痛作用的情況

*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異IM＝初始測量；FM＝最終測量；g＝以克為單位的重量正如在PGE2-誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中所觀察到的，只有κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑能干擾所述肽的抗疼痛作用。
實施例11.在坐骨神經(jīng)慢性收縮引起的痛覺過敏-一種持久的疼痛模型中合成肽SEQ ID NO2的止痛活性依照Bennett，G.J和Xie，Y.K.(Pain，3387-107，1988)所述方法在坐骨神經(jīng)處進(jìn)行手術(shù)誘發(fā)神經(jīng)性疼痛。用氟烷麻醉動物。在大腿中間區(qū)域移開股骨二頭肌暴露坐骨神經(jīng)。接近坐骨神經(jīng)的三根分叉部，在離三根分叉部7mm遠(yuǎn)的部位，在其周圍做4個松散的結(jié)扎(鉻腸線4-0)，相互之間間隔大約1mm。沿神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎，直至離最初的點4-5mm處。用4-0號絲縫合線分層縫合切口。
實施例11A.痛覺過敏的評估依照Randall & Sellito(1957)描述的方法進(jìn)行大鼠爪壓力試驗(Analgesy-Meter ugo Basile，Italy)以評估痛覺過敏。在手術(shù)之前(BM-基礎(chǔ)測量)和之后第14天進(jìn)行此試驗以鑒定神經(jīng)性疼痛的發(fā)展情況。手術(shù)后第14天，在口服施用0.0016、0.008、0.04、0.2、1和5μg/kg劑量的合成肽或作為對照的鹽水之前(初始測量-IM)和之后1、3、24、48、72和96小時進(jìn)行此試驗(表11)。
通過比較基礎(chǔ)測量平均值和初始測量平均值或者通過比較初始測量平均值和最終測量平均值，或者當(dāng)測完時，通過比較不同實驗組所獲得的平均值，對結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為每組5只動物的平均值±S.E.M。
表11合成肽SEQ ID NO2對坐骨神經(jīng)所誘導(dǎo)的痛覺過敏的止痛作用的持續(xù)時間

BM＝手術(shù)前的基礎(chǔ)測量，IM＝手術(shù)后第14天，給予所述肽之前的初始測量，F(xiàn)M＝手術(shù)后第14天，在給予肽或鹽水之后不同時間的最終測量，g＝以克為單位的重量肽劑量以μg/kg表示。
在第14天IM測定之后立即給予肽或鹽水。BM、IM和FM的值以克(g)±S.E.M.表示。
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異
§p＜0.05與第14天的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
所獲得的數(shù)據(jù)表明在單次給予后長達(dá)3天時在神經(jīng)性疼痛模型中仍檢測到所述肽能引起抗痛覺過敏的作用。
用以0.0016、0.008、0.04、0.2和1μg/kg劑量的合成肽處理動物后1小時獲得的結(jié)果確定50、60和90％的有效劑量。分析數(shù)據(jù)確定疼痛閾值(痛覺過敏)降低的百分率，比較基礎(chǔ)測量和初始測量值，然后測定痛覺過敏逆轉(zhuǎn)的百分率，比較處理組(肽)和對照組(鹽水)。用CurveExpert 1.3程序分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)果證明在此例中所述肽的50、60和90％有效劑量分別是0.205517、0.283173和0.5747158μg/kg。
實施例11B.異常性疼痛的測定依照Chaplan等(1994)所述方法加以修改后進(jìn)行定量試驗評估異常性疼痛對施加于大鼠爪上的觸覺刺激的反應(yīng)。在此試驗中，將大鼠分別放置在底部有金屬絲網(wǎng)眼的塑料籠中，使得可以接觸到這些動物的爪。簡而言之，對右后爪施加對數(shù)級數(shù)的10根校準(zhǔn)的Semmes-Weinstein單絲(von Frey hairs，AesthesiometerSemmer-Weinstein，Stoelting Co.，E.U.A)以測定引起爪抽回反應(yīng)所必需的刺激強(qiáng)度極限勁度。以log 10(mg×10)計的頭發(fā)的對數(shù)勁度值如下(括弧之間是以克數(shù)表示的值)3.61(0.407g)；3.84(0.692g)；4.08(1.202g)；4.17(1.479g)；4.31(2.041g)；4.56(3.630g)；4.74(5.495g)；4.93(8.511g)；5.07(11.749g)和5.18(15.136g)。應(yīng)重點指出的是在異常性疼痛的研究中不使用重量大于15.136g的細(xì)絲。
將所述細(xì)絲逐一垂直擺放于雙后爪足底區(qū)下并保持8秒的時間長度。連續(xù)兩次能造成其抽回爪子的所述細(xì)絲被認(rèn)為是引起反應(yīng)(100％反應(yīng))所必需的力(以克數(shù)計)。沒有對更大刺激(15.135g)的反應(yīng)時，此細(xì)絲被認(rèn)為是切割值。
用行為反應(yīng)計算50％爪抽回的閾值(絕對閾值)，計算方法是用最大可能性擬合方法擬合高斯積分心理測量函數(shù)。此擬合方法可以進(jìn)行參數(shù)分析。
進(jìn)行此試驗和此處理的時間與測定痛覺過敏所用的時間相同(表12)。
通過比較基礎(chǔ)測量平均值和初始測量平均值，或者當(dāng)測完時，通過比較不同實驗組獲得的平均值對結(jié)果進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M.。
表12合成肽SEQ ID NO2對坐骨神經(jīng)收縮誘導(dǎo)的異常性疼痛的抗疼痛作用的測定

BM＝手術(shù)前的基礎(chǔ)測量；IM＝手術(shù)后第14天給予所述肽之前的初始測量；FM＝手術(shù)后第14天在給予肽或鹽水后不同時間的最終測量；數(shù)據(jù)表示為log 10(mg×10)±S.E.M.
肽劑量以μg/kg表示。
在第14天IM測定之后立即給予肽或鹽水。
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第14天的平均值有顯著差異
#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
數(shù)據(jù)表明在單次給予后長達(dá)3天時在神經(jīng)性疼痛模型中仍檢測到所述肽能引起抗異常性疼痛的作用。
實施例11C.自發(fā)性疼痛的測定在坐骨神經(jīng)收縮手術(shù)后第14天、口服給予肽(5μg/kg)或鹽水之前和之后1、3、24、48、72、96、120和144小時觀察大鼠以評估自發(fā)性疼痛(表13和14)。為了觀察自發(fā)性疼痛的特征癥狀，將動物一只接一只放在透明塑料箱中。在30分鐘適應(yīng)期之后，觀察大鼠10分鐘，測定其舔食(以秒計)的持續(xù)時間和舉起的時間。作為動物正常理毛行為的一部分而進(jìn)行的舔食和舉起動作不算。
表13.合成肽CNF021.03對坐骨神經(jīng)收縮誘導(dǎo)的自發(fā)性疼痛的抗疼痛作用-爪子舔食持續(xù)時間(以秒計)

IM＝手術(shù)后第14天給予所述肽之前的初始測量；FM＝手術(shù)后第14天在給予肽或鹽水后不同時間的最終測量數(shù)據(jù)表示為舔食爪子的時間(以秒計)。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
表14.合成肽CNF021.03對坐骨神經(jīng)收縮誘導(dǎo)的自發(fā)性疼痛的抗疼痛作用-爪子舉起的持續(xù)時間(以秒計)

IM＝手術(shù)后第14天給予所述肽之前的初始測量；FM＝手術(shù)后第14天在給予肽或鹽水后不同時間的最終測量數(shù)據(jù)表示為舉起爪子的時間(以秒計)。數(shù)據(jù)表示每組5只動物的平均值±S.E.M.。
*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
這些結(jié)果表明肽能干擾舔食和舉起時間(表13和14)，顯示了在神經(jīng)性疼痛模型中此肽對自發(fā)性疼痛的抑制作用。
實施例12.在坐骨神經(jīng)收縮模型中合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用涉及到阿片樣物質(zhì)受體證明了所述肽對坐骨神經(jīng)慢性收縮誘導(dǎo)的痛覺過敏和異常性疼痛中有抗疼痛作用之后，進(jìn)一步研究了此作用中涉及到阿片樣物質(zhì)。為此，用特異的μ受體拮抗劑CTOP(20μg/只爪子)、特異的κ受體拮抗劑nor-BNI(50μg/只爪子)或特異的δ受體拮抗劑ICI 174,864(10μg/只爪子)處理動物。通過足底內(nèi)途徑注射拮抗劑。在臨注射阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑之前給予劑量為5μg/kg的所述肽。
比較基礎(chǔ)測量平均值和初始測量平均值，或初始測量平均值和最終測量平均值，或者當(dāng)測完時，通過比較用不同實驗組獲得的平均值進(jìn)行結(jié)果分析(表15和16)。
表15.在神經(jīng)性疼痛模型中，合成肽SEQ ID NO2的抗痛覺過敏作用中涉及到阿片樣物質(zhì)受體的鑒定

BM＝手術(shù)前的基礎(chǔ)測量；IM＝手術(shù)后第14天給予所述肽之前的初始測量；FM＝手術(shù)后第14天在給予肽或鹽水后不同時間的最終測量；數(shù)據(jù)表示為克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第14天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
數(shù)據(jù)表明δ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑在坐骨神經(jīng)慢性收縮模型中阻斷了所述肽的抗痛覺過敏作用。κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑部分抑制了此作用。μ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑不影響所述肽的作用。
表16.在神經(jīng)性疼痛模型中，合成肽SEQ ID NO2的抗異常性疼痛作用中涉及到阿片樣物質(zhì)受體的鑒定

BM＝手術(shù)前的基礎(chǔ)測量；IM＝手術(shù)后第14天給予所述肽之前的初始測量；FM＝手術(shù)后第14天在給予肽或鹽水(對照)后不同時間的最終測量；在第14天測定IM值后立即給予所述肽或鹽水。IM和FM值表示為log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第14天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
數(shù)據(jù)表明δ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑在坐骨神經(jīng)慢性收縮模型中阻斷了所述肽的抗異常性疼痛作用。κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑部分抑制了此作用，而μ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑不影響所述肽的作用。
實施例13.合成肽SEQ ID NO2在癌癥疼痛，一種持久性疼痛模型中的止痛活性-用WALKER 256腫瘤進(jìn)行的研究Walker 256腫瘤細(xì)胞由 Paulo大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所生理學(xué)和生物物理學(xué)系的Dr.Rui Curi.教授惠贈。處死攜帶腫瘤的動物并切下腫瘤組織，放置于含0.9％鹽水的皮氏培養(yǎng)皿中。然后，將腫瘤切成小塊，轉(zhuǎn)移入含鹽水的燒杯中。用細(xì)切工具將此材料切碎，直至腫瘤完全成碎片。然后，用紗布過濾此材料并收集液體至燒杯中。所有的步驟均在冰上進(jìn)行。將燒杯里的材料轉(zhuǎn)移到50ml塑料管中并在4℃1200rpm離心10分鐘。離心后，棄去上清液并將沉淀重懸于0.9％的鹽水中。為了進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸浮液稀釋(1∶100)于鹽水中。將試樣(200μ1)取出并放置于含20Oμl 1％臺盼藍(lán)的試管中。用Neubauer’s盒在光學(xué)顯微鏡下測定細(xì)胞數(shù)目。折射光的細(xì)胞被認(rèn)為是活的，由此測定細(xì)胞存活率。
在確定細(xì)胞數(shù)目后，在大鼠右側(cè)腹膜內(nèi)注射含1×107個細(xì)胞的懸浮液1ml以獲得液態(tài)瘤(腹水)。
注射后5天，處死有腹水的大鼠并從腹膜腔中收集腹水液，放置在含EDTA的試管中。此液體用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH 7.4稀釋100倍。如上所述用臺盼藍(lán)稀釋后完成細(xì)胞計數(shù)。通過用PBS進(jìn)行稀釋確定腫瘤細(xì)胞計數(shù)達(dá)到100μl中1×106個細(xì)胞。在預(yù)備試驗中確定此細(xì)胞數(shù)目用于在大鼠中誘導(dǎo)癌癥疼痛。在該最后的細(xì)胞數(shù)目調(diào)整中，需考慮加入懸浮液中的抗生素(Benzetacil)的量(150,000個單位抗生素/10ml懸浮液)。使用抗生素是為了避免微生物污染。通過足底內(nèi)注射途徑將細(xì)胞注入大鼠后爪。對照動物是在相同實驗條件下將PBS注射入對側(cè)爪。
為了評估合成肽在此動物模型中的抗疼痛作用，在Walker腫瘤細(xì)胞注射后5天，用劑量為6μg/kg的所述肽或鹽水(對照)口服處理動物。在注射腫瘤細(xì)胞之前(BM-基礎(chǔ)測量)以及注射后5天、給予所述肽之前(IM-初始測量)和之后2小時(FM-最終測量)檢測痛覺過敏、異常性疼痛和自發(fā)性疼痛。
比較基礎(chǔ)和初始測量平均值，或初始和最終測量平均值，或當(dāng)測完時，通過比較不同實驗組中所獲得的平均值對結(jié)果進(jìn)行分析(表17、18、19)。
表17.合成肽CNF021.03對WALKER 256腫瘤所誘導(dǎo)的痛覺過敏的抗疼痛作用

BM＝注射腫瘤前的基礎(chǔ)測量；IM＝植入腫瘤后第5天給予所述肽之前的測量；FM＝植入腫瘤后第5天在給予肽后2小時的測量；數(shù)據(jù)表示為克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第5天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
表18.合成肽CNF021.03對WALKER 256腫瘤所誘導(dǎo)的異常性疼痛的抗疼痛作用。

BM＝注射腫瘤前的基礎(chǔ)測量；IM＝植入腫瘤后第5天給予所述肽之前的測量；FM＝植入腫瘤后第5天在給予肽后2小時的測量；數(shù)據(jù)表示為log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第5天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
表19.合成肽CNF021.03對WALKER 256腫瘤所誘導(dǎo)的自發(fā)性疼痛的抗疼痛作用

BM＝注射腫瘤前的基礎(chǔ)測量；IM＝植入腫瘤后第5天給予所述肽之前的測量；FM＝植入腫瘤后第5天在給予肽后2小時的測量；數(shù)據(jù)表示為舉起或舔食后爪的持續(xù)時間(以秒計)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第5天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
結(jié)果表明所述肽阻斷了Walker腫瘤所誘導(dǎo)的痛覺過敏(表17)、異常性疼痛(表18)和自發(fā)性疼痛(表19)。這些數(shù)據(jù)顯示所述的肽能抑制癌癥疼痛。
實施例14.在WALKER 256腫瘤誘導(dǎo)的癌癥疼痛模型中合成肽SEQID NO2的抗疼痛作用涉及到阿片樣物質(zhì)受體的評估證實所述肽對Walker 256腫瘤所誘導(dǎo)的痛覺過敏和異常性疼痛的抗疼痛作用之后，進(jìn)一步對此作用中涉及到阿片樣物質(zhì)受體進(jìn)行了研究。為此，用特異的μ受體拮抗劑CTOP(20μg/只爪子)、特異的κ受體拮抗劑nor-BNI(50μg/只爪子)或特異的δ受體拮抗劑ICI 174,864(10μg/只爪子)處理動物。通過足底內(nèi)途徑注射這些拮抗劑。在臨注射阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑之前口服給予劑量為6μg/kg的所述肽。比較基礎(chǔ)測定平均值和初始測定平均值，或初始測定平均值和最終測定平均值，或者當(dāng)測完時，通過比較用不同實驗組獲得的平均值進(jìn)行結(jié)果分析(表20)。
表20.在WALKER 256誘導(dǎo)的癌癥模型中合成肽SEQ ID NO2的抗痛覺過敏作用涉及到阿片樣物質(zhì)受體的鑒定

BM＝注射腫瘤前的基礎(chǔ)測量；IM＝植入腫瘤后第5天給予所述肽之前的測量；FM＝植入腫瘤后第5天在給予肽后2小時的測量；數(shù)據(jù)表示為克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第5天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
數(shù)據(jù)表明κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑阻斷了所述肽的抗痛覺過敏作用。δ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑部分抑制了此作用，而μ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑不影響所述肽的作用。
表21.在WALKER 256誘導(dǎo)的癌癥模型中合成肽SEQ ID NO2的抗異常性疼痛作用涉及到阿片樣物質(zhì)受體的鑒定

BM＝注射腫瘤前的基礎(chǔ)測量；IM＝植入腫瘤后第5天給予所述肽之前的測量；FM＝植入腫瘤后第5天在給予肽后2小時的測量；數(shù)據(jù)表示為log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05與基礎(chǔ)測量的平均值有顯著差異§p＜0.05與第5天的初始測量平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
數(shù)據(jù)表明κ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑阻斷了所述肽的抗異常性疼痛作用。δ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑部分抑制了此作用，而μ阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑不影響所述肽的作用。
實施例15.在熱板試驗中合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用的評估此試驗用于評估干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)中疼痛感受的藥物，例如，嗎啡及其衍生產(chǎn)物，因為熱刺激直接激活疼痛感受器，避免了組織損傷以及隨后的炎癥。此試驗中所獲得的數(shù)據(jù)表明某化合物的抗疼痛作用主要是由脊椎上的綜合反應(yīng)造成的。
此試驗依照J(rèn)acob，J.J.C.和Ramabadran，K.(Br.J.Pharmacol.，6491-8，1978)所述的方法進(jìn)行。為了進(jìn)行此試驗，將小鼠放置在50℃±1的金屬表面。結(jié)果表示為觀察到舔食雙前足的等待時間(以秒-s計)(反應(yīng)時間)。在給動物口服生理鹽水(對照)或合成肽(1和3μg/kg，體積200μl)之前(初始測量-IM)和之后2小時(最終測量-FM)進(jìn)行此試驗。各動物被認(rèn)為是其自身的對照。比較IM和FM的平均值，或者當(dāng)測定完成時，通過比較不同實驗組之間的平均值對結(jié)果進(jìn)行分析(表22)。
表22.用熱板試驗評估的合成肽SEQ ID NO2的抗疼痛作用

IM＝初始測量；FM＝最終測量；數(shù)據(jù)表示為克(g)的平均值±S.E.M*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異。
此結(jié)果證明了合成肽也可通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)抗疼痛作用。
實施例16.修飾的合成肽SEQ ID NO3的抗疼痛活性通過足底內(nèi)途徑(i.pl.)給予劑量為100ng/只爪子的前列腺素E2以誘導(dǎo)痛覺過敏。在注射PGE2之前(初始測量-IM)和之后3小時(最終測量-FM)評估痛覺過敏情況。
用大鼠爪壓力測試評估痛覺過敏情況。疼痛閾值表示為使動物作出反應(yīng)抽回爪子所需施加的力(以克計)，在足底內(nèi)注射前列腺素E2(100ng/條腿)之前(初始測量)和之后3小時(最終測量)進(jìn)行測定。
將修飾的合成肽SEQ ID NO3稀釋于體積為11ml的鹽水中。在臨誘導(dǎo)痛覺過敏之前通過口服(p.o.)使各動物接受2ml的所述溶液。用口服了鹽水的動物作為對照。

數(shù)據(jù)表示為克(g)的平均值±S.E.M*p＜0.05與初始測量的平均值有顯著差異#p＜0.05與對照組(鹽水)的平均值有顯著差異。
結(jié)果表明修飾的合成肽SEQ ID NO3在PGE2誘導(dǎo)的痛覺過敏中具有抗疼痛作用。
序列表<110>申請人Laboratório Biosintética Ltda.等<120>發(fā)明名稱源自響尾蛇cortalus durissus terrificus蛇毒的止痛肽的類似化合物、它們的用途、組合物、制備和純化方法<130>文件參考號PI0401702-1<140>目前的專利申請<141>目前的提交日期2005-05-06<150>早期的專利申請BR PI0401702-1<151>早期專利提交日期2004-05-06<160>序列數(shù)8<170>軟件PatentIn<210>SEQ ID NO 1<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息止痛劑；作用于阿片樣物質(zhì)受體；Xaa(1)通常是焦谷氨酸；Xaa(2)＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr；Xaa(4)＝Pro或Arg；Xaa(5)＝Glx或Asx或Gly；Xaa(6)＝Asn或Gln或Leu；Xaa(10)＝Glx或Asx；Xaa(12)＝Glx或Lys<400>序列1Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys1 5 10<210>SEQ ID NO 2<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽
<222>位置<223>其它信息止痛劑；分離自響尾蛇CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS毒液；作用于阿片樣物質(zhì)受體；Xaa(1)通常是焦谷氨酸<400>序列2Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Gln Pro Cys1 5 10<210>SEQ ID NO 3<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息止痛劑；作用于阿片樣物質(zhì)受體；Xaa(1)通常是焦谷氨酸<400>序列3Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Lys Pro Cys1 5 10<210>SEQ ID NO 4<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息Xaa(1)通常是焦谷氨酸；Xaa(2)＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr；Xaa(4)＝Pro或Arg；Xaa(5)＝Glx或Asx或Gly；Xaa(6)＝Asn或Gln或Leu；Xaa(10)＝Glx或Asx；Xaa(12)＝Glx或Lys；<400>序列4Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys1 5 10
<210>SEQ ID NO 5<211>長度8<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息止痛劑化合物制備的中間物或作用于阿片樣物質(zhì)受體的中間物；Xaa(4)＝Glx或Asx；Xaa(6)＝Glx或Lys<400>序列5Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys1 5<210>SEQ ID NO 6<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息Xaa(1)通常是焦谷氨酸<400>序列6Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Gln Pro Cys1 5 10<210>SEQ ID NO 7<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列7Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Lys Pro Cys1 5 10<210>SEQ ID NO 8<211>長度14<212>類型肽<213>生物體<220>特征<221>名稱/關(guān)鍵詞肽<222>位置<223>其它信息CROTAPOTIN的C末端部分，來自響尾蛇CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS種蛇毒的響尾蛇毒蛋白的無毒酸性亞基(SWISS PROT/P08878)；Xaa(1)通常是焦谷氨酸<400>序列8Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Gln Pro Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.以呈現(xiàn)以下氨基酸序列為特征的化合物Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQ IDNO1)其中Xaa通常是焦谷氨酸，R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，R2＝Pro或Arg，R3＝Glx或Asx或Gly，R4＝Asn或Gln或Leu，R5＝Glx或Asx，以及R6＝Glx或Lys，它們的鹽、溶劑化物或類似化合物，除了當(dāng)化合物是十四肽，其中R1＝Phe，R2＝Pro，R3＝Glu，R4＝Asn，R5＝Glu和R6＝Gln時，第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO2)。
2.依照權(quán)利要求1的化合物，其特征在于第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO4)。
3.依照權(quán)利要求1的化合物，其特征在于與具有氨基酸序列Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys的十四肽類似，其中第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQID NO2)。
4.依照權(quán)利要求1至3的化合物，其特征在于模擬肽的添加、刪除或改變，以調(diào)節(jié)它的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性。
5.依照權(quán)利要求1至4的化合物，其特征在于用一個或多個L型氨基酸取代D型氨基酸或非常規(guī)氨基酸。
6.依照權(quán)利要求1至4的化合物，其特征在于出現(xiàn)第4位脯氨酸殘基的羥基化或第5或10位谷氨酸殘基的γ羧化。
7.依照權(quán)利要求1的化合物，其特征在于是具有以下氨基酸序列的十四肽Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQ IDNO1)其中Xaa通常是焦谷氨酸，R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，R2＝Pro或Arg，R3＝Glx或Asp或Gly，R4＝Asn或Gln或Leu，R5＝Glx或Asp，以及R6＝Glx或Lys，它們的鹽或溶劑化物，除了當(dāng)R1＝Phe，R2＝Pro，R3＝Glu，R4＝Asn，R5＝Glu和R6＝Gln的時候，第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO2)。
8.依照權(quán)利要求7的化合物，其特征在于第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ ID NO4)。
9.依照權(quán)利要求8的化合物，其特征在于是具有氨基酸序列Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys的十四肽，其中第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ IDNO2)。
10.依照權(quán)利要求8的化合物，其特征在于是具有氨基酸序列Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Lys-Pro-Cys的十四肽，其中第7位和第14位的半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接(SEQ IDNO3)。
11.依照權(quán)利要求1至10的化合物，其特征在于是已純化的。
12.藥物組合物，其特征在于包含一種或多種藥用可接受載體或稀釋劑和含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物，它們的鹽、溶劑化物或類似化合物。
13.藥物組合物，其特征在于包含一種或多種藥用可接受載體或稀釋劑和含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物，它們的鹽、溶劑化物或純化的類似化合物。
14.依照權(quán)利要求12和13的藥物組合物，其特征在于該組合物形式是溶液、懸浮液、糊劑、膠囊、凝膠、片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、親媒膠體、控釋體系、微粒、微球體或毫微球體、脂質(zhì)體或與有機(jī)物涂層相結(jié)合。
15.依照權(quán)利要求12至14的藥物組合物，其特征在于包含水基稀釋劑。
16.依照權(quán)利要求12至15的藥物組合物，其特征在于所述的組合物適于以下施用途徑口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、局部、肺部、鼻內(nèi)、口腔、直腸、舌下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)施用。
17.依照權(quán)利要求16的藥物組合物，其特征在于該組合物是供口服使用的。
18.含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物的用途，其特征在于它們被用于制備止痛劑類藥物組合物或用于治療、診斷或預(yù)防受阿片樣物質(zhì)受體調(diào)控的病癥。
19.含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物、它們的鹽、溶劑化物或已純化的類似化合物的用途，其特征在于它們被用于制備止痛劑類藥物組合物或用于治療、診斷或預(yù)防受阿片樣物質(zhì)受體調(diào)控的病癥。
20.依照權(quán)利要求18至19的用途，其特征在于包含序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物是直接或間接的阿片樣物質(zhì)受體激動劑。
21.依照權(quán)利要求18至19的用途，其特征在于包含序列SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物是直接或間接的阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑。
22.依照權(quán)利要求18至21的用途，其特征在于被用于制備治療、診斷或預(yù)防受阿片樣物質(zhì)受體調(diào)控的疾病的有用的藥物組合物。
23.依照權(quán)利要求18至21的用途，其特征在于被用于制備治療、診斷或預(yù)防受κ型阿片樣物質(zhì)受體調(diào)控的疾病的有用的藥物組合物。
24.依照權(quán)利要求18和19的用途，其特征在于被用于制備止痛用藥物組合物。
25.依照權(quán)利要求24的用途，其特征在于被用于制備口服止痛用藥物組合物。
26.依照權(quán)利要求24和25的用途，其特征在于被用于制備具有持久止痛作用的藥物組合物。
27.依照權(quán)利要求24至25的用途，其特征在于被用于制備止痛作用至多達(dá)5天的藥物組合物。
28.依照權(quán)利要求18至27的用途，其特征在于用于制備可有效治療、診斷或預(yù)防急性和慢性疼痛的組合物，所述疼痛包括癌癥相關(guān)性疼痛、神經(jīng)性疼痛如三叉神經(jīng)痛、交感神經(jīng)性營養(yǎng)不良、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、后腦血管意外、糖尿病神經(jīng)病變、瘤形成相關(guān)性疼痛、纖維肌痛、牙疼、痛經(jīng)、腎絞痛、月經(jīng)絞痛和膽絞痛、關(guān)節(jié)痛、包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎、眼內(nèi)高壓、關(guān)節(jié)鏡檢查后疼痛、婦產(chǎn)科腹腔鏡檢查后疼痛、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)所產(chǎn)生的疼痛、前列腺切除術(shù)后后陰部根疼痛、胸廓切開術(shù)后疼痛、兒科患者扁桃體切除術(shù)后疼痛、子宮切除術(shù)后疼痛、剖腹產(chǎn)術(shù)后疼痛或燒傷痛、可卡因或阿片樣驅(qū)體依賴、細(xì)胞增殖、小細(xì)胞肺癌、抑郁癥和精神病、炎癥、由于血管發(fā)生增加造成的相關(guān)疾病、創(chuàng)傷、冠狀動脈局部缺血性疾病、帕金森氏癥和運(yùn)動障礙、肝腦病、認(rèn)知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝膽汁郁積造成的發(fā)癢或多囊卵巢婦女的高胰島素血癥。
29.用于治療、診斷和預(yù)防疼痛病癥或由阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于使用含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物。
30.用于治療、診斷和預(yù)防疼痛病癥或由阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于使用含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4的一種或多種化合物、它們的鹽、溶劑化物或純化的類似化合物。
31.依照權(quán)利要求30至31的方法，其特征在于含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物是直接或間接的阿片樣物質(zhì)受體激動劑。
32.依照權(quán)利要求30至31的方法，其特征在于含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物是直接或間接的阿片樣物質(zhì)受體拮抗劑。
33.依照權(quán)利要求29至32的方法，其特征在于被用于治療、診斷或預(yù)防由阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的疾病。
34.依照權(quán)利要求33的方法，其特征在于被用于治療、診斷或預(yù)防由κ阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的疾病。
35.依照權(quán)利要求29至30的方法，其特征在于被用于治療、診斷或預(yù)防疼痛性疾病。
36.依照權(quán)利要求29至35的方法，其特征在于所述化合物的口服使用。
37.依照權(quán)利要求29-36的方法，其特征在于具有延長的作用時間。
38.依照權(quán)利要求29至37的方法，其特征在于作用時間至多達(dá)5天。
39.依照權(quán)利要求29至38的方法，其特征在于用于治療、診斷或預(yù)防急性和慢性疼痛，包括癌癥相關(guān)性疼痛、神經(jīng)性疼痛如三叉神經(jīng)痛、偏頭痛、交感神經(jīng)性營養(yǎng)不良、皰疹后神經(jīng)痛、幻肢痛、后腦血管意外相關(guān)性疼痛、糖尿病神經(jīng)病變、瘤形成相關(guān)性疼痛、纖維肌痛、牙疼、痛經(jīng)、腎絞痛、月經(jīng)絞痛和膽絞痛、關(guān)節(jié)痛、包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或變性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的關(guān)節(jié)炎、眼內(nèi)高壓、關(guān)節(jié)鏡檢查后疼痛、婦產(chǎn)科腹腔鏡檢查后疼痛、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)所產(chǎn)生的疼痛、前列腺切除術(shù)后后陰部根疼痛、胸廓切開術(shù)后疼痛、兒科患者扁桃體切除術(shù)后疼痛、子宮切除術(shù)后疼痛、剖腹產(chǎn)術(shù)后疼痛或燒傷痛、可卡因或阿片樣驅(qū)體依賴、細(xì)胞增殖、小細(xì)胞肺癌、抑郁癥和精神病、炎癥、由于血管發(fā)生增加造成的相關(guān)疾病、創(chuàng)傷、冠狀動脈局部缺血性疾病、帕金森氏癥和運(yùn)動障礙、肝腦病、認(rèn)知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝膽汁郁積造成的發(fā)癢或多囊卵巢婦女的高胰島素血癥。
40.依照權(quán)利要求2的化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于涉及巰基的氧化步驟，隨之在相應(yīng)于第7和第14位的半胱氨酸殘基之間形成分子內(nèi)二硫橋。
41.依照權(quán)利要求40的生產(chǎn)方法，其特征在于使用碘作為氧化劑。
42.依照權(quán)利要求2的化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于涉及其結(jié)構(gòu)中含以下氨基酸序列的化合物的純化步驟 其中R5＝Glx或Asx，R6＝Glx或Lys其中半胱氨酸殘基由分子內(nèi)二硫橋連接。
43.含序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的化合物、它們的鹽、溶劑化物或類似化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于包括固相的肽合成步驟。
44.依照權(quán)利要求43的生產(chǎn)方法，其特征在于利用H-Cys(Trt)-2-ClTrt樹脂作為固相支持物。
45.依照權(quán)利要求11的化合物的生產(chǎn)方法，其特征在于包括純化合成或半合成來源的化合物的混合物。
46.依照權(quán)利要求11的生產(chǎn)方法，其特征在于包括純化生物來源的化合物的混合物。
47.依照權(quán)利要求46的生產(chǎn)方法，其特征在于生物來源的化合物的混合物由來自Crotalus durissus terrificus蛇的未精制蛇毒組成。
48.依照權(quán)利要求46的生產(chǎn)方法，其特征在于生物來源的化合物的混合物獲自細(xì)胞培養(yǎng)物或重組微生物。
49.依照權(quán)利要求45至48的生產(chǎn)方法，其特征在于包括肽的選擇性沉淀步驟。
50.依照權(quán)利要求49的生產(chǎn)方法，其特征在于使用溶于乙腈和水中的三氟乙酸溶液作為選擇性沉淀的試劑。
51.依照權(quán)利要求50的生產(chǎn)方法，其特征在于使用在大約1份乙腈與2份水的混合物中含約0.1％的三氟乙酸的溶液。
52.依照權(quán)利要求45至48的生產(chǎn)方法，其特征在于包括色譜分離步驟。
53.依照權(quán)利要求52的生產(chǎn)方法，其特征在于使用反相HPLC柱。
54.依照權(quán)利要求52的生產(chǎn)方法，其特征在于使用具有梯度濃度的流動相。
55.依照權(quán)利要求54的生產(chǎn)方法，其特征在于使用溶于水和乙腈混合物中的三氟乙酸作為流動相。
56.模擬具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽的止痛活性的化合物的鑒定方法。
57.依照權(quán)利要求56的方法，其特征在于以下步驟a)評估具有氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的肽的生物學(xué)活性以確定其止痛活性，b)評估測試化合物(對照)的生物學(xué)活性以確定其止痛活性，和c)將所獲得的SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4的生物學(xué)活性的結(jié)果與所獲得的測試化合物(對照)的結(jié)果進(jìn)行比較。
58.依照權(quán)利要求57的方法，其特征在于所述的肽具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
59.依照權(quán)利要求57的方法，其特征在于所述的肽具有SEQ IDNO3的氨基酸序列。
60.依照權(quán)利要求56的方法，其特征在于包括以下步驟a)引入氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的標(biāo)記肽使其接觸測試樣品，b)在與氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4標(biāo)記肽接觸的測試樣品中加入測試化合物，和c)評估已標(biāo)記的氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4與測試樣品之間的肽連接。
61.依照權(quán)利要求60的方法，其特征在于所述的肽具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
62.依照權(quán)利要求60的方法，其特征在于所述的肽具有SEQ IDNO3的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO3或SEQ ID NO4的肽的類似化合物，包括來源于諸如Crotalusdurissus terrificus等種類蛇的止痛肽；它們在治療、診斷和預(yù)防由阿片樣物質(zhì)受體介導(dǎo)的疼痛病癥中的用途，它們的藥物組合物以及它們的制備和純化方法，包括它們在止痛劑化合物鑒定中的用途。
文檔編號C07K14/46GK101048170SQ200580021319
公開日2007年10月3日 申請日期2005年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月6日
發(fā)明者Y·屈里, G·皮科洛, K·孔諾, R·喬治, P·布里加特, V·古鐵雷斯, A·卡馬戈 申請人:生物合成實驗室有限公司, 圣保羅國情研究援助基金會, 亞拉·屈里