專利名稱：粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體的說，是涉及一種粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
海龍(Syngnathus)為一常用中藥材，2005版《中華人民共和國藥典》規(guī)定為尖海龍Syngnathus acus Linnaeus、刁海龍Solenognathus hardwickii(Gray)和擬海龍Syngnathoides biaculeatus(Bloch)干燥體，用于陽萎遺精、癥瘕積聚、瘰疬痰核、跌撲損傷及癰腫疔瘡。除藥典收載品種外，粗吻海龍Trachyrhamphus serratus(Temminck et Schlegel)在我國不少地方也常作海龍藥用。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，李士敏等在海龍的體外抗腫瘤活性研究中發(fā)現(xiàn)，粗吻海龍經(jīng)95％乙醇提取，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，獲得的石油醚萃取物經(jīng)皂化后再用乙醚萃取，回收乙醚得非皂化物，其非皂化物部分具有不同程度的抑制人癌細(xì)胞株KB、Hela、Bcap37、K562、PAA細(xì)胞的作用，并有明顯的量效關(guān)系(李士敏，吳筱丹，曾蘇，等.海龍?bào)w外抗腫瘤活性研究[J].中國中藥雜志，2001，26(3)198-201)。目前粗吻海龍仍以全體入藥，用于跌打損傷和陽萎遺精的治療，而用于抗腫瘤和增強(qiáng)免疫的功能沒有得到充分研究和開發(fā)。近年來動(dòng)物類中藥中活性蛋白和多肽的研究日趨活躍，抗腫瘤蛋白和多肽成為研究開發(fā)新熱點(diǎn)。由于海洋生物和內(nèi)陸生物的差異性，來自于海洋動(dòng)物的蛋白質(zhì)組分更具有開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，目前國際上已有數(shù)百個(gè)海洋生物多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)入臨床研究。在文獻(xiàn)檢索中未見用于抗腫瘤和增強(qiáng)免疫的功能相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道，尤其是沒有關(guān)于粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白質(zhì)分離方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，使其以粗吻海龍為原料，經(jīng)提取分離制得，具有增強(qiáng)免疫的特點(diǎn)。具體的說是從粗吻海龍中分離純化了一種分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)，經(jīng)檢測(cè)具有抗腫瘤活性，同時(shí)有增強(qiáng)免疫的作用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟(1)以粗吻海龍為原料，粉碎后過篩，待用。
(2)在粗吻海龍粗粉中加入4～12倍量的體積百分比為0～90％的乙醇-水溶液，勻漿、低溫浸泡，離心后取上清液，即為海龍蛋白粗提液。
(3)將蛋白粗提液于20～60℃減壓蒸發(fā)濃縮后，與HZ-801大孔樹脂接觸，充分吸附后用蒸餾水洗脫，收集蛋白組分，得到海龍蛋白分離液。
(4)將海龍蛋白分離液減壓蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨粉末使硫酸銨濃度達(dá)到20％-90％飽和度，充分?jǐn)嚢韬?℃靜置，離心，收集沉淀，將沉淀用少量Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白。
(5)將海龍粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解后，與凝膠過濾介質(zhì)接觸，用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測(cè)，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白，蛋白質(zhì)成分含量達(dá)95-100％。
(6)將海龍抗腫瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，與離子交換介質(zhì)接觸，梯度NaCl緩沖液洗脫，得到數(shù)個(gè)不同濃度NaCl緩沖液的洗脫組分，第四個(gè)洗脫峰經(jīng)透析、濃縮、凍干后即為海龍抗腫瘤活性蛋白。
本發(fā)明為了提高蛋白質(zhì)提取率，采用勻漿攪拌提取方法。提取液與HZ-801大孔樹脂接觸，水洗，可以去除大量甾體、酯類、色素等小分子物質(zhì)。
本發(fā)明獲得的海龍抗腫瘤活性蛋白外觀為白色粉末，蛋白質(zhì)含量在99-100％之間，糖含量在0-1％之間。SDS-PAGE凝膠電泳顯示是單一條帶，分子量在10-100kDa之間。經(jīng)體外抗腫瘤活性測(cè)試，該蛋白具有良好的抗腫瘤活性，小鼠及人癌細(xì)胞株給藥劑量在0.1-100μg/ml范圍內(nèi)可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長；小鼠給藥劑量在lmg/kg-100mg/kg范圍內(nèi)可抑制動(dòng)物體內(nèi)移植腫瘤的生長，同時(shí)可以顯著改善荷瘤小鼠體征性狀。
本發(fā)明海龍抗腫瘤活性蛋白可以與傳統(tǒng)化療藥物配合組成抗癌復(fù)方制劑，包括甲胺蝶呤、5-氟脲嘧啶、順鉑、長春新堿、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素等。
用本發(fā)明制備的活性蛋白質(zhì)單獨(dú)或與其它藥物聯(lián)合使用均有抗腫瘤作用，主要用于各種癌癥的治療和輔助治療，如肺癌、肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、白血病等，尤其對(duì)A-549、Bel-7402、Hela、Lovo、P-388細(xì)胞株有較強(qiáng)殺傷作用。
采用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用本發(fā)明方法制備的海龍抗腫瘤活性蛋白蛋白質(zhì)含量在99-100％。
本發(fā)明采用蛋白質(zhì)SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量；海龍抗腫瘤活性蛋白質(zhì)分子量約為55kDa。
用本發(fā)明方法制備的活性蛋白質(zhì)與甲胺蝶呤、順鉑聯(lián)合使用，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行抗腫瘤活性體外測(cè)試，當(dāng)甲胺蝶呤濃度為2.5μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長抑制率增加40.3％，當(dāng)順鉑濃度為0.025μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長抑制率增加70.4％。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案提供以下實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)粗吻海龍藥材低溫烘干，粉碎，過40目篩。
(2)取200g粗吻海龍粉末，加入800ml水溶液，勻漿3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸8小時(shí)，4800rpm離心10min，移出上清液，即為海龍蛋白粗提液。
(3)將(2)中獲得的海龍蛋白粗提液于40℃減壓濃縮至200ml，上HZ-801大孔樹脂分離柱，用蒸餾水洗脫，收集洗脫組分，40℃減壓濃縮至200ml，得海龍蛋白分離液。
(4)在攪拌的同時(shí)向海龍蛋白分離液中加入硫酸銨粉末至20％飽和度，4℃靜置過夜使其充分沉淀，10000rpm離心10min，收集沉淀，將沉淀用少量pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白。
(5)海龍粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取5ml與Sephacryl-200(1.6×60cm)凝膠過濾層析柱接觸，用含0.2MNaCl的緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白。
(6)海龍抗腫瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取20ml，與DEAE-Sephadex離子交換介質(zhì)接觸，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的20mM Tris-HCl pH8.4緩沖液洗脫，收集0.5M NaCl的洗脫組分，對(duì)純水透析、PEG20000包埋濃縮至原體積的三分之一后冷凍干燥，即得到本發(fā)明所述海龍抗腫瘤活性蛋白2.75mg。
采用本發(fā)明所得的海龍抗腫瘤活性蛋白經(jīng)Lowry法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為99.4％。
采用MTT法測(cè)試本發(fā)明所得活性蛋白的抗腫瘤活性，當(dāng)藥物濃度為100μg/ml時(shí)，海龍抗腫瘤活性蛋白對(duì)Lovo(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)、A549(人肺癌細(xì)胞株)、Hela(人宮頸癌細(xì)胞株)、CCRF-CEM(人白血病細(xì)胞株)的抑制率分別為55.8％、69.8％、62.8％和52.7％。
采用動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法考察海龍抗腫瘤活性蛋白對(duì)ICR小鼠S180肉瘤的抑制率，當(dāng)給藥劑量為20mg/kg時(shí)，小鼠腫瘤抑制率為42.88％。
本發(fā)明所得蛋白還具有增強(qiáng)免疫活性通過測(cè)定海龍抗腫瘤活性蛋白治療、5-氟脲嘧啶治療、不治療以及正常小鼠的免疫指標(biāo)，研究本發(fā)明所得活性蛋白對(duì)荷瘤小鼠免疫的影響。當(dāng)海龍抗腫瘤活性蛋白給藥劑量為10mg/kg時(shí)與正常小鼠相比荷瘤小鼠肝重增加30.05％、脾重增加307.14％、胸腺重增加40.0％；白細(xì)胞和血小板分別增加451.3％和58.8％；淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性細(xì)胞分別增加370.4％、550.0％和582.3％，表明海龍活性蛋白質(zhì)能顯著提高荷瘤小鼠的免疫力。
實(shí)施例2(1)粗吻海龍藥材低溫烘干，粉碎，過20目篩。
(2)取200g粗吻海龍粉末，加入1400ml 45％乙醇溶液，勻漿3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸6小時(shí)，4800rpm離心10min，移出上清液，殘?jiān)俅渭尤?000ml 45％乙醇，同上操作，合并兩次提取液即為海龍蛋白粗提液。
(3)將(2)中獲得的海龍蛋白粗提液于20℃減壓濃縮至300ml，上HZ-801大孔樹脂分離柱，用蒸餾水洗脫，收集洗脫組分，50℃減壓濃縮至250ml，得海龍蛋白分離液。
(4)在攪拌的同時(shí)向海龍蛋白分離液中加入硫酸銨粉末至90％飽和度，4℃靜置過夜使其充分沉淀，10000rpm離心10min，收集沉淀，將沉淀用少量pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白。
(5)海龍粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取5ml與Sephacryl-200(1.6×60cm)凝膠過濾層析柱接觸，用含0.2MNaCl的緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白。
(6)海龍抗腫瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取20ml，與DEAE-Sephadex離子交換介質(zhì)接觸，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的20mM Tris-HCl pH8.4緩沖液洗脫，收集0.5M NaCl的洗脫組分，對(duì)純水透析、PEG20000包埋濃縮至原體積的三分之一后冷凍干燥，即得到本發(fā)明所述海龍抗腫瘤活性蛋白(2.06mg)。
采用本發(fā)明所得的海龍抗腫瘤活性蛋白經(jīng)Lowry法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為99.0％。
采用本發(fā)明所制備的活性蛋白具有顯著抗腫瘤作用，當(dāng)濃度為100μg/ml時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞株抑制率為62.8％。
實(shí)施例3(1)粗吻海龍藥材低溫烘干，粉碎，過20目篩。
(2)取200g粗吻海龍粉末，加入1600ml 90％乙醇溶液，勻漿3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸6小時(shí)，4800rpm離心10min，移出上清液，即為海龍蛋白粗提液。
(3)將(2)中獲得的海龍蛋白粗提液于60℃減壓濃縮至300ml，上HZ-801大孔樹脂分離柱，用蒸餾水洗脫，收集洗脫組分，50℃減壓濃縮至250ml，得海龍蛋白分離液。
(4)在攪拌的同時(shí)向海龍蛋白分離液中加入硫酸銨粉末至55％飽和度，4℃靜置過夜使其充分沉淀，10000rpm離心10min，收集沉淀，將沉淀用少量pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白。
(5)海龍粗蛋白用pH 7.2、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取5ml與Sephacryl-200(1.6×60cm)凝膠過濾層析柱接觸，用含0.2MNaCl的緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白。
(6)海龍抗腫瘤粗蛋白用pH 8.4、20mM Tris-HCl緩沖液溶解，取20ml，與DEAE-Sephadex離子交換介質(zhì)接觸，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的20mM Tris-HCl pH8.4緩沖液洗脫，收集0.5M NaCl的洗脫組分，對(duì)純水透析、PEG20000包埋濃縮至原體積的三分之一后冷凍干燥，即得到本發(fā)明所述海龍抗腫瘤活性蛋白1.65mg。
采用本發(fā)明所得的海龍抗腫瘤活性蛋白經(jīng)Lowry法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為99.7％。
采用本發(fā)明所制備的活性蛋白具有顯著抗腫瘤作用，當(dāng)濃度為100μg/ml時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞株抑制率為86.8％。
權(quán)利要求
1.一種粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)以粗吻海龍為原料，粉碎后過篩，待用；(2)在粗吻海龍粗粉中加入4～12倍量的乙醇-水溶液，勻漿、低溫浸泡，離心后取上清液，即為海龍蛋白粗提液；(3)將蛋白粗提液減壓蒸發(fā)濃縮后，與大孔樹脂接觸，充分吸附后依次用蒸餾水洗脫，收集蛋白組分，得到海龍蛋白分離液；(4)將海龍蛋白分離液減壓蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨粉末，充分?jǐn)嚢韬?℃靜置，離心，收集沉淀，將沉淀用少量Tris-HCl緩沖液溶解后透析、濃縮、冷凍干燥，即得到海龍粗蛋白；(5)將海龍粗蛋白用Tris-HCl緩沖液溶解后，與凝膠過濾介質(zhì)接觸，用Tris-HCl緩沖液洗脫，收集分子量在10-100kDa的蛋白質(zhì)洗脫液，透析、濃縮、冷凍干燥后，經(jīng)體外抗腫瘤活性檢測(cè)，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白，蛋白質(zhì)成分含量達(dá)95-100％；(6)將海龍抗腫瘤粗蛋白用Tris-HCl緩沖液溶解，與離子交換介質(zhì)接觸，梯度NaCl緩沖液洗脫，得到數(shù)個(gè)不同濃度NaCl緩沖液的洗脫組分，第四個(gè)洗脫峰經(jīng)透析、濃縮、凍干后即為海龍抗腫瘤活性蛋白，獲得蛋白質(zhì)含量在99--100％之間，糖含量在0-1％之間的白色粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的步驟(2)中，乙醇-水溶液的體積百分比為0～90％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的步驟(2)中，低溫浸泡，是指浸泡時(shí)置于4℃冰箱中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的步驟(3)中，蛋白粗提液減壓蒸發(fā)濃縮是在20～60℃條件下，然后與HZ-801大孔樹脂接觸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的步驟(4)中，加入硫酸銨粉末使硫酸銨濃度達(dá)到20％-90％飽和度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的(4)和(5)中，Tris-HCl緩沖液，是指pH7.2、20mM Tris-HCl緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，其特征是，所述的(6)，Tris-HCl緩沖液，是指pH8.4、20mM Tris-HCl緩沖液。
全文摘要
一種醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白的制備方法，步驟為(1)以粗吻海龍為原料，粉碎后過篩；(2)在粗吻海龍粗粉中加入4～12倍量的乙醇－水溶液，制取海龍蛋白粗提液；(3)將蛋白粗提液減壓蒸發(fā)濃縮后，與大孔樹脂接觸，制取海龍蛋白分離液；(4)將海龍蛋白分離液減壓蒸發(fā)濃縮，加入硫酸銨粉末，將沉淀用Tris－HCl緩沖液溶解，得到海龍粗蛋白；(5)將海龍粗蛋白用Tris－HCl緩沖液溶解后，與凝膠過濾介質(zhì)接觸，獲得海龍抗腫瘤粗蛋白；(6)將海龍抗腫瘤粗蛋白用Tris－HCl緩沖液溶解，與離子交換介質(zhì)接觸，梯度NaCl緩沖液洗脫獲得。本發(fā)明制得的粗吻海龍抗腫瘤活性蛋白，純度高，經(jīng)檢測(cè)具有抗腫瘤活性，同時(shí)有增強(qiáng)免疫的作用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1793168SQ20051011223
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者李曉波, 張朝暉, 秦孫星, 王威, 王夢(mèng)月 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)