專利名稱：人HS5AR－iso基因序列、其編碼蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人基因和蛋白，尤其涉及一種人HS5AR-iso基因的核酸序列、其編碼蛋白；此外，本發(fā)明還涉及該基因編碼蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
類固醇5α還原酶(steroid 5-alpha-reductase，SRD5A，EC1.3.99.5)是微粒體蛋白，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為更具生物活性的二氫睪酮(DHT)，因此，該酶在性分化及雄激素生理中發(fā)揮著中心作用。90年代初，Andersson首先克隆了SRD5A兩種異構(gòu)體的全長cDNA，先后命名為1型與2型，這兩種酶各自的結(jié)構(gòu)及生物學活性均不盡相同。
結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，在基因結(jié)構(gòu)及染色體定位方面，SRD5A1cDNA全長為2.1Kb，編碼259個氨基酸；SRD5A2為2.4Kb，編碼254個氨基酸，且含有較長的3i非翻譯區(qū)(Andersson S，et al.Nature 1991；354159-1161)。SRD5A的兩個異構(gòu)酶均有5個外顯子，SRD5A2的5個外顯子的長度分別為352、164、102、151和1695bp，它們之間由4個內(nèi)含子間隔，與SRD5A1相對應(yīng)外顯子的同源性為43.8-64.1％(Labrie F，etal.Endocrinology 1992；1311571-1573)。通過原位雜交及連鎖分析將SRD5A1定位在5p15，SRD5A2定位在2p23(Morissette J，et al.Cytogenet Cell Genet1996；73304-307)。
在器官及組織表達方面的研究顯示，SRD5A2主要表達在生殖系統(tǒng)，而SRD5A1主要表達在周圍組織(Normington K，et al.J Biol Chem 1992；26719548-19554)。Yokoi用SRD5A1的多克隆抗體作免疫組化分析，顯示無論性別在腎上腺皮質(zhì)束狀帶網(wǎng)狀帶均呈強陽性反應(yīng)，腎上腺髓質(zhì)陽性反應(yīng)在支持細胞(supporting cell)，而不在嗜鉻細胞表達(Yokoi H，et al.Histochem Cell Biol 1998；109127-134)。Berman用原位雜交方法顯示在新生前列腺腹部，SRD5A1表達在基底層上皮細胞，而SRD5A2主要定位在基質(zhì)細胞且在胚胎期表達水平接近成年，附睪兩者均表達在上皮細胞，其表達水平亦與成年相仿，而肝臟，皮膚僅有SRD5A1表達(Ellsworth K，et al.BiochemBiophys Res Commun 1995；2157740780)。上述資料表明SRD5A表達具有組織或細胞的特異性，提示該酶在雄激素生理功能的差異及重疊(Berman，et al.Proc Natl AcadSci USA 1993；909369-9363)。
進一步的功能研究表明，SRD5A具有特定的生化特點及生理功能。性激素主要由睪丸分泌，而在周圍靶組織主要由其代謝產(chǎn)物-二氫睪酮(DHT)發(fā)揮生理作用。SRD5Al為259氨基酸的疏水性蛋白，分子量為29KD，與大鼠同源性為60％(Andersson S，etal.Proc Natl Acad Sci USA 1990；873640-3644)，SRD5A2為254氨基酸。SRD5A2對類固醇底物有較高的親和力(Km為nmol范圍)，而SRD5A1的親和力則較低(Km在μmol水平)，對各種SRD5A的抑制劑結(jié)合亦不同，1型與一種非類固醇性SRD5A抑制劑-LY306089顯示特異性結(jié)合，2型與偶氮類固醇的衍生物-finasteride有極高的親和力(Andersson S，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；873640-3644，NormingtonK，et al.J Biol Chem 1992；26719548-19554)。Anderson進一步用體外方法研究證實了SRD5A的生理作用，將含有人及鼠SRD5Al cDNA表達載體，轉(zhuǎn)染到猴的COS細胞可導致SRD5A酶活性顯著增高(Andersson S，et al.Proc Natl Acad Sci USA1990；873640-3644)。此外兩種異構(gòu)酶作用的最適pH也不相同，SRD5A1作用pH似乎更接近生理性pH水平為6.0-8.0，而SRD5A2的pH值較窄且呈酸性(5.0-5.5)(Span PN，et al.J Steroid Biochem Mol Biol 1995；54185-192)。SRD5A能催化各種底物的Δ-4，5雙鍵還原，在類固醇激素代謝中既可發(fā)揮分解，也可發(fā)揮合成代謝作用，有報道顯示，SRD5A2產(chǎn)生合成作用，SRD5A1起降解作用(NormingtonK，et al.J Biol Chem 1992；26719548-19554)。
在表達調(diào)控方面，SRD5A的活性及其基因表達也受到許多因子調(diào)節(jié)。在生殖系統(tǒng)，睪酮可刺激SRD5A2的基因表達，同時該酶的產(chǎn)物DHT亦可刺激該基因表達，后者被稱為前饋調(diào)節(jié)(feedforward regulation)(Berman，et al.Mol Endocrinol1995；91561-1570)。在腎上腺，SRD5A1也受性激素狀態(tài)影響，大鼠切除性腺后6周，無論性別該酶表達水平都增高，用性激素替代2周后表達水平接近正常，髓質(zhì)中該基因表達則不受影響(Yokoi H，et al.Histo-chem Cell Biol 1998；109127-134)。
SRD5A與一些疾病存在密切的關(guān)聯(lián)性(1)、男性假兩性畸形SRD5A2作為細胞信號通路中的一員，能決定哺乳類(包括人類)胚胎生殖道原生體細胞的命運，DHT結(jié)合雄激素受體啟動外生殖器及前列腺的發(fā)育，若該酶缺陷勢必男性性分化障礙。1994年報道了21例SRD5A2缺陷所致的性分化障礙病例，通過基因分析顯示2例為大片斷缺失，1例為小片斷缺，16例為點突變(包括5例堿基置換，11例堿基顛換)，1例突變引起翻譯終止提前，1例突變導致mRNA無法剪接(Kostyrko A，et al.Ginekol Pol 1994；65400-406)。Hochberg報道一個8例患SRD5A2缺乏癥的家系，其中男性表現(xiàn)為假兩性畸形，女性呈現(xiàn)生殖能力低下，但月經(jīng)周期尚正常，經(jīng)PCR-SSCP及測序顯示外顯子1存在一個T-A突變(導致亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０?(Hochberg Z，et al.J Clin Endo-crinol Metab 1996；812821-2827)。最近，Anwar報道一個在第200密碼子新的點突變(GAA-AAA)，氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?Anwar R，et al.Mol Pathol 1997；5050-51)。通過對各種突變體的功能研究顯示，發(fā)生在外顯子2、5的突變可導致酶與睪酮親和力降低，而外顯子1、4的突變可降低酶與NADPH的親和力。此外，為確定SRD5A1是否參與性分化作用，將小鼠胚胎干細胞作同源重組，致使SRD5A1基因斷裂，雄性新生鼠似乎顯示無異常，而雌性鼠成年后呈現(xiàn)分娩缺陷，若給予5α-雄烷-3α，17-β-diol(3α-Adiol)可恢復(MohendrooMS，et al.Mol Endocrinol 1996；10380-392)。這提示SRD5A1雖然不參與性分化，但亦某些生殖功能有關(guān)。
(2)、前列腺增生癥雄激素能刺激前列腺生長和發(fā)育，因而雄激素與前列腺疾病(前列腺增生癥及前列腺癌)的關(guān)聯(lián)性早已引起關(guān)注。人們曾試圖應(yīng)用雌激素對抗雄激素以緩解癥狀。近年來對SRD5A的深入研究發(fā)現(xiàn)，偶氮類固醇及其衍生物可與睪酮競爭性結(jié)合SRD5A，從而抑制雄激素正常發(fā)揮生理作用。目前該類藥物已廣泛用于前列腺疾病的治療。Uygur給予前列腺增生癥患者finasteride(每日5mg)，3月后癥狀均有改善，DHT水平下降60％，睪酮增加15％，F(xiàn)SH及LH分別降低24％與16％，但有22％出現(xiàn)陽萎(UygurMC，et al.Steroid 1998；63208-213)，可見上述變化均與抑制SRD5A2活性有關(guān)。
(3)、前列腺癌目前，有關(guān)前列腺癌與SRD5A表達水平的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果尚不一致。用免疫組化方法研究顯示前列腺癌組織中SRD5A酶表達高于周圍正常前列腺組織，SRD5A1活性在胞漿明顯增強，核內(nèi)則保持不變，SRD5A2在胞漿及胞核均明顯增加(Bankhalf H，et al.Prostate 1996；29261-267)。然而，Bjelfman用溶液雜交法對50例前列腺活檢標本作SRD5A2基因表達定量，結(jié)果顯示14例前列腺癌SRD5A2mRNA水平(3.5amol/ng)顯著低于非癌組織(12.0amol/ng)(Bjelfman J，et al.J Clin EndocrinolMetab 1997；822210-2214)。用DU145人前列腺癌細胞經(jīng)Northern blot分析顯示，SRD5A1mRNA呈高水平表達，而SRD5A2表達未增高(Kaefer M，et al.J SteroidBiochem Mol Biol 1996；58195-205)。流行病資料顯示前列腺癌在黑人發(fā)病率最高，白人次之，黃種人最低，增高的DHT水平將增加前列腺癌的危險性，遺傳學研究顯示SRD5A2二核苷酸重復的分布某些等位基因具有特異性，提示SRD5A2的遺傳學變異與前列腺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)(Reichart JK，et al.Cancer Res 1995；553973-3975)。
(4)、其它雄激素相關(guān)疾病SRD5A也與其它內(nèi)分泌異常相關(guān)疾病相關(guān)，如在男性方式禿頂、座瘡及多毛癥發(fā)病中起作用(Andersson S，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；873640-3644)。
鑒于類固醇5α還原酶(SRD5A，EC1.3.99.5)在性分化及雄激素生理中的重要作用。本領(lǐng)域迫切需要獲得SRD5A的各種異構(gòu)體，并闡明它們的結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種新的人基因HS5AR-iso(GenbankAccession No.AF113128)，該基因是一個類固醇5a還原酶I型基因。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種新的人蛋白，該蛋白被命名為HS5AR-iso蛋白。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種生產(chǎn)上述的新的人類固醇5a還原酶I型蛋白的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人HS5AR-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人HS5AR-iso蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在一個實例中該宿主細胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細胞是真核細胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人HS5AR-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人HS5AR-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人HS5AR-iso蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人HS5AR-iso蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人HS5AR-iso蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人HS5AR-iso蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第154-789位的序列。
本發(fā)明還提供了與HS5AR-iso蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人HS5AR-iso蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人HS5AR-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第154-789位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第154-789位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第154-789位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，“嚴緊條件”是指核苷酸序列在膜上雜交后的洗膜條件。例如，在本領(lǐng)域中，低嚴緊度洗膜可以在雜交管中倒入150ml左右洗液，放入雜交膜，室溫持續(xù)搖動20分鐘左右，而高嚴緊度洗膜可以是在雜交管中倒入200ml左右洗液，放入雜交膜，50℃搖床中持續(xù)搖動20分鐘左右。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HS5AR-iso相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人HS5AR-iso蛋白或多肽”指具有HS5AR-iso蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人HS5AR-iso相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C術(shù)端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括HS5AR-iso蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人HS5AR-iso多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人HS5AR-iso DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HS5AR-iso多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人HS5AR-iso多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人HS5AR-iso多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HS5AR-iso多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“HS5AR-iso保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明還包括人HS5AR-iso蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HS5AR-iso多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人HS5AR-iso多肽時，可以將HS5AR-iso編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成人HS5AR-iso蛋白表達載體。
在本發(fā)明中，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
本發(fā)明還提供了對人HS5AR-iso特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對HS5AR-iso特異的抗體。例如，將提純的人HS5AR-iso基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達人HS5AR-iso或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑HS5AR-iso功能的抗體，也可以是不影響人HS5AR-iso功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人HS5AR-iso基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人HS5AR-iso基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的HS5AR-iso基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有HS5AR-iso核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HS5AR-iso的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在HS5AR-iso核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于HS5AR-iso核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的HS5AR-iso核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選HS5AR-iso同源基因或同源蛋白。
為了得到與HS5AR-iso基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對HS5AR-iso的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人腎上腺組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與HS5AR-iso相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選HS5AR-iso同源物可以按如下方法完成。人體腎上腺cDNA文庫，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含HS5AR-iso基因序列的全部或部分的隨機引物化DNA探針篩選。要完成對與HS5AR-iso序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。DNA測序來評價它與HS5AR-iso基因的相似性。組織表達的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
HS5AR-iso同源物也可以用針對HS5AR-iso蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標準的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細胞或者組織例如腎上腺的表達文庫進行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人HS5AR-iso抗體進行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進行分析以評價它與HS5AR-iso基因的相似性。新識別的基因的組織表達分布可以同樣地按上述方法進行分析。
本發(fā)明的人HS5AR-iso核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認為人類固醇5a還原酶的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有類固醇5a還原酶高度保守的氨基酸序列，其差別僅在于48個氨基酸的缺失。所以，本發(fā)明的HS5AR-iso是人類固醇5型還原酶I型的一個異構(gòu)體而具有相似的功能。
本發(fā)明的人HS5AR-iso蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人HS5AR-iso缺失、無功能或異常而導致的有關(guān)病癥，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。


圖1是本發(fā)明的人HS5AR-iso與人類固醇5α還原酶I型基因核酸序列(GenBankAccession No.M32313)的同源比較(GAP)圖。其中，相同的核苷酸用“|”標出。
圖2是本發(fā)明的人HS5AR-iso蛋白與人類固醇5α還原酶I型蛋白的氨基酸序列(SwissProt Accession No.P18405)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。
圖3是本發(fā)明的人HS5AR-iso基因的組織表達柱狀圖。其中，橫坐標代表不同的組織，縱坐標代表人HS5AR-iso基因在不同組織中的相對表達水平，可以發(fā)現(xiàn)人HS5AR-iso基因在腦、胰島、淋巴結(jié)及皮膚等組織中都有較高表達。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1HS5AR-iso基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)腎上腺來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內(nèi)取出腎上腺組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補平末端后，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時，再進行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(OpenReading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取HS5AR-iso基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5’或3’端設(shè)計引物，在人類腎上腺Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5’和3’端已知的序列，中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計引物，3’端引物采用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫中進行擴增。然后對產(chǎn)物進行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人HS5AR-iso蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引物R15’-AGCCTGACTTGAGAACCCTTT-3’(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25’-CAGAGCTTGAAATTCTGACCTG-3’(SEQ ID NO.5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段長度為1018bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2HS5AR-iso基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明的人HS5AR-iso全長cDNA(GenBank Accession No.AF113128。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為1018bp，詳細序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于154-789位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導出HS5AR-iso的氨基酸序列，共211個氨基酸殘基，分子量24074.40，pI為8.80。詳細序列見SEQ ID NO.7。用PSORT(Prediction of Protein Sorting Signals and Localization Sites in AminalAcid Sequence)WWW服務(wù)器http://psort.nibb.ac.jp8800/psort/中的細胞質(zhì)/核區(qū)分的Reinhardt’s方法進行分析，預(yù)測HS5AR-iso編碼的氨基酸序列的亞細胞定位屬于細胞質(zhì)蛋白(可靠性94.1％)。
將HS5AR-iso的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人、猴、大鼠的基因都存在較高的同源性。在核苷酸水平上，它與人類固醇5還原酶I型基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.M32313)的153-1176位堿基有95.2％的相同性(圖1)。在氨基酸水平上，它與人類固醇5α還原酶I型蛋白序列(SwissProt Accession No.P18405)的第1-211位氨基酸殘基有81.5％的相同性(圖2)。其區(qū)別為本發(fā)明cDNA序列與同源序列相比缺失144bp(211-254)，多肽鏈缺失48aa(29-76aa)。因此，本發(fā)明與人類固醇5α還原酶I型基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。
實施例3HS5AR-iso蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1.HS5AR-iso蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果1 MATATGVAEE RLLAALAYLQ CAVGCAVFPR LRSAPNCILL AMFLVHYGHR51 CLIYPFLMRG GKPMPLLACT MAIMFCTCNG YLQSRYLSHC AVYADDWVTD101 PRFLIGFGLW LTGMLINIHS DHILRNLRKP GDTGYKIPRG GLFEYVTAAN151 YFGEIMEWCG YALASWSVQG AAFAFFTFCF LSGRAKEHHE WYLRKFEEYP
201 KFRKIIIPFL F(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)黑體區(qū)(182-184)蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinase Cphosphorylation site)(ii)斜體區(qū)(128-135)酪氨酸激酶磷酸化位點(Tyrosine kinasephosphorylation site)(iii)下劃線區(qū)(108-113，113-118，170-175)N-豆蔻?；稽c(N-myristoylation site)(2)功能分析N-豆蔻酰化位點，蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點均與翻譯后修飾(post-translational modifications)有關(guān)。
2.將HS5AR-iso蛋白的氨基酸序列在profile數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://www.isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN_form.html)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果1MATATGVAEE RLLAALAYLQ CAVGCAVFPR LRSAPNCILL AMFLVHYGHR51 CLIYPFLMRG GKPMPLLACT MAIMFCTCNG YLQSRYLSHC AVYADDWVTD101 PRFLIGFGLWLTGMLINIHS DHILRNLRKP GDTGYKIPRG GLFEYVTAAN151YFGEIMEWCG YALASWSVQG AAFAFFTFCFLSGRAKEHHE WYLRKFEEYP201 KFRKIIIPFL F在上述氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)域區(qū)下劃線區(qū)(106-186)類固醇5α還原酶C末端結(jié)構(gòu)域(Steroid 5-alphareductase，C-terminal domain)綜上所述，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學原理，而本發(fā)明與人類固醇5α還原酶I型在核酸和蛋白質(zhì)水平都有很高的同源性，所以本發(fā)明的人類類固醇5α還原酶I型異構(gòu)體可能具有類固醇5α還原酶I型相似或相同的功能。
實施例4HS5AR-iso基因的組織表達譜電子Northern表達譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997Dec 16；96(12)4146-4203)，將HS5AR-iso cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值<10e-10、相同性>95％的EST有41個，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達本，由此得出表達該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在腦、胰島、淋巴結(jié)及皮膚等組織中都有較高表達(圖3)。
實施例5HS5AR-iso多肽的制備和提純在該實施例中，將全長的HS5AR-iso編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.原核表達載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌HS5AR-iso蛋白或多肽可以以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
根據(jù)人HS5AR-iso的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將HS5AR-iso基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-HS5AR-iso表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-HS5AR-iso。
2.表達GST-HS5AR-iso重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-HS5AR-iso工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-HS5AR-iso融合蛋白的工程菌。
3.GST-HS5AR-iso融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-HS5AR-iso融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-HS5AR-iso。誘導后的細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm/min離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-HS5AR-iso的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm/min離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。
在24kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為HS5AR-iso蛋白。
實施例6HS5AR-iso蛋白或多肽在昆蟲細胞中進行真核細胞表達1.HS5AR-iso桿狀病毒表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞株根據(jù)人HS5AR-iso的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將HS5AR-isocDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2.轉(zhuǎn)入重組表達載體的昆蟲細胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細胞用新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細胞。
收集感染的細胞進行Western鑒定。將細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗HS5AR-iso的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標記的抗HS5AR-iso一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達HS5AR-iso的Sf9細胞克隆。
3.HS5AR-iso蛋白的提取純化用高表達HS5AR-iso的Sf9細胞克隆的上清大量感染Sf9細胞，感染48小時后收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進行SDS-PAGE電泳檢測提取的HS5AR-iso蛋白的純度。在24kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為HS5AR-iso蛋白。
實施例7人HS5AR-iso抗體的制備1.免疫小鼠和脾細胞的制備將實施例5和實施例6中獲得的HS5AR-iso蛋白用層析法進行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)》(同上)，第211頁中的方法，制備飼養(yǎng)細胞。
3.按《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4.抗體的檢測在細胞融合10-15天后，需逐孔進行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細胞集落生長，就應(yīng)用HS5AR-iso蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發(fā)射免疫試驗(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
本發(fā)明的人HS5AR-iso抗體可以用來鑒定表達人HS5AR-iso蛋白或多肽的細胞，如Jurkat T細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標記HS5AR-iso特異抗體，然后讓人HS5AR-iso特異抗體與細胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與HS5AR-iso特異抗體結(jié)合的細胞。
除了在細胞表面檢測人HS5AR-iso外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細胞裂解液可以從培養(yǎng)細胞或取自病人的組織標本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的人HS5AR-iso多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測HS5AR-iso多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人HS5AR-iso基因序列、其編碼蛋白及制備方法<130>NP-1924<160>7<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>2AATTCGGCAC GA G 13
<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>3GCCGTGCTC9<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4AGCCTGACTT GAGAACCCTT T 21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>5CAGAGCTTGAAATTCTGACCTG22<210>6<211>1018<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(154)..(789)<400>61 AGCCTGACTT GAGAACCCTT TCTGCAGAGT CCCGGCAGTG CGGGACTCCG51 GTAGCCGCCC CTCCGGTAGC CGCCCCTCCT GCCCCCGCGC CGCCGCCCTA101 TATGTTGCCC GCCGCGGCCT CTGGGGCATG GAGCACGCTG CCCAGCCCTG151 GCGATGGCAA CGGCGACGGG GGTGGCGGAG GAGCGCCTGC TGGCCGCGCT201 CGCCTACCTG CAGTGCGCCG TGGGCTGCGC GGTCTTCCCG CGTCTCCGCA251 GCGCGCCCAA CTGCATCCTC CTGGCCATGT TCCTCGTCCA CTACGGGCAT301 CGGTGCTTAA TTTACCCATT TCTGATGCGA GGAGGAAAGC CTATGCCACT351 GTTGGCGTGT ACAATGGCGA TTATGTTCTG TACCTGTAAC GGCTATTTGC401 AAAGCAGATA CTTGAGCCAT TGTGCAGTGT ATGCTGATGA CTGGGTAACA451 GATCCCCGTT TTCTAATAGG TTTTGGCTTG TGGTTAACAG GCATGTTGAT501 AAACATCCAT TCAGATCATA TCCTAAGGAA TCTCAGAAAA CCAGGAGATA551 CTGGATACAA AATACCAAGG GGAGGCTTAT TTGAATACGT AACTGCAGCC601 AACTATTTTG GAGAAATCAT GGAGTGGTGT GGCTATGCCC TGGCCAGCTG651 GTCTGTCCAA GGCGCGGCTT TTGCTTTCTT CACGTTTTGT TTTTTATCTG
701 GTAGAGCAAA AGAGCATCAT GAGTGGTACC TCCGGAAATT TGAAGAGTAT751 CCAAAGTTCA GAAAAATTAT AATTCCATTT TTGTTTTAAG TGCGTTTTTC801 ATGAAATTAT CTTCAACTTG AAGCTTTCCA ATGGCGCTTC TCTATGGACT851 TTGTAAATAA GTTATATCTT TGTAATTTTC CTGCTACTTT ATCATTTTCA901 AGATGTCCTC TAGGAATTTT TTTTCTAGTA ATTTTGCAAT CTACCTAATA951 AGTACCTAAA TACGCTGAAA TGGAGGTTGA ATATCCTACT GTGTAACAGG1001 TCAGAATTTC AAGCTCTG<210>7<211>211<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>71 Met Ala Thr Ala Thr Gly Val Ala Glu Glu Arg Leu Leu Ala Ala16 Leu Ala Tyr Leu Gln Cys Ala Val Gly Cys Ala Val Phe Pro Arg31 Leu Arg Ser Ala Pro Asn Cys Ile Leu Leu Ala Met Phe Leu Val46 His Tyr Gly His Arg Cys Leu Ile Tyr Pro Phe Leu Met Arg Gly61 Gly Lys Pro Met Pro Leu Leu Ala Cys Thr Met Ala Ile Met Phe76 Cys Thr Cys Asn Gly Tyr Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Ser His Cys91 Ala Val Tyr Ala Asp Asp Trp Val Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile106 Gly Phe Gly Leu Trp Leu Thr Gly Met Leu Ile Asn Ile His Ser121 Asp His Ile Leu Arg Asn Leu Arg Lys Pro Gly Asp Thr Gly Tyr136 Lys Ile Pro Arg Gly Gly Leu Phe Glu Tyr Val Thr Ala Ala Asn151 Tyr Phe Gly Glu Ile Met Glu Trp Cys Gly Tyr Ala Leu Ala Ser166 Trp Ser Val Gln Gly Ala Ala Phe Ala Phe Phe Thr Phe Cys Phe181 Leu Ser Gly Arg Ala Lys Glu His His Glu Trp Tyr Leu Arg Lys196 Phe Glu Glu Tyr Pro Lys Phe Arg Lys Ile Ile Ile Pro Phe Leu211 Phe
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HS5AR-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人HS5AR-iso蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.一種產(chǎn)生具有人HS5AR-iso蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人HS5AR-iso蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人HS5AR-iso蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第154-789位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人HS5AR-iso蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人HS5AR-iso蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人HS5AR-iso蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求7所述的人HS5AR-iso蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在人正常腎上腺組織中表達的新的類固醇5α還原酶異構(gòu)體HS5AR－iso的基因序列及其編碼蛋白，本發(fā)明還公開了該蛋白和核酸序列的制備方法，以及制備與所述的人HS5AR－iso蛋白特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的人HS5AR－iso蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人HS5AR－iso缺失、無功能或異常而導致的有關(guān)病癥，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
文檔編號C07H21/00GK1912119SQ20051002873
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心