專利名稱：固相多肽合成亮丙瑞林的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及亮丙瑞林的制備方法，尤其涉及固相多肽合成亮丙瑞林的制備方法。
背景技術(shù)：
亮丙瑞林，中文名稱為醋酸亮丙瑞林，或簡稱其他名稱亮丙瑞林，英文名為Leuprorelin，結(jié)構(gòu)式為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHC2H5，分子式C59H84N16O12·C2H4O2，分子量為1269.48。
亮丙瑞林臨床用于治療相關(guān)性激素病癥，包括晚期前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位、中樞性性早熟癥等。
醋酸亮丙瑞林是一種促性腺激素釋放激素類似物，主要作用于垂體前葉，大劑量應(yīng)用初期可以引起一過性黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)釋放增多，后期則導(dǎo)致垂體敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌減少。醋酸亮丙瑞林用于治療相關(guān)性激素病癥，包括晚期前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位、中樞性性早熟癥。
1974年日本武田化工的Fujino Masahiko等人首先發(fā)明促黃體激素釋放激素的九肽酰胺類似物的合成工藝。并在日本、德國、美國等國家申請專利，專利號分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。
目前的方法均存在著一定的缺陷，每一輪脫帽須用三氟醋酸，故接肽收率低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高；三廢污染多，并使用三氟醋酸進行純化，污染環(huán)境，純化收率一般在25％以下。因此目前的方法限制了醋酸亮丙瑞林的大規(guī)模生產(chǎn)和使用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成亮丙瑞林的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟以.Wang或CTC樹脂樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護九肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，獲得粗品，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，制得亮丙瑞林精品。
按照本發(fā)明，依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護九肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Pro-Wang樹脂取Wang樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干，然后加入溶解于接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW337.4)、TBTU/HBTU(FW321)、HOBT(FW153，)的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Pro-Wang樹脂；加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。
所說的Wang樹脂取代量為0.5-1.1mmol/g；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP∶DMF＝1∶2～5，體積比，下同；混合物中Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；HOBT＝的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g；(2)制備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(1)的Fmoc-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
HOBT摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；(3)制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(2)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(3)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Leu-OH(FW354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-D-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(4)的Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(5)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(6)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(7)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(9)制備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(8)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，20～30℃反應(yīng)5～30分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，20～30℃反應(yīng)0.5～1.5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；pGlu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上。
按照本發(fā)明，所說的切肽包括如下步驟將上述步驟(9)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加入預(yù)冷至0～10℃的切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)中，20～30℃反應(yīng)1～3小時，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的粗品；按照本發(fā)明，所說的乙胺/HOBT接上乙胺基的方法包括如下步驟將HOBT、水和乙胺的混合物冷凍干燥，獲得HOBt-乙胺混合物；
將HOBt-乙胺混合物加入切肽后的粗品中，再加入DIC，20～30℃反應(yīng)8～24小時，加乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗滌，獲得亮丙瑞林粗品，收率80％；HOBT、水和乙胺的重量比例為HOBT∶水∶乙胺＝1∶50～100∶0.5～2；按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將亮丙瑞林粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18(或C8)柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為100-650ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品(MW1209)，總收率27.6％(以Wang樹脂的60mmol計)。
乙酸的重量濃度為0.5～10％，乙酸中亮丙瑞林粗品的重量濃度為1～50％。
本發(fā)明的亮丙瑞林工藝路線有下列特點，具備規(guī)模化生產(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，三廢少，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，極具市場競爭力，接肽收率高(每步接肽收率為≥99％)，降低了成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)進行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱進行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進行純化，減少三廢，純化收率高達25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為95.4％，總收率為21.9％。
具體實施例方式
實施例1實施例和前述過程中所采用的原料列表如下
實施例中所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶10，體積比；所說的脫帽試劑為PIP∶DMF＝1∶3.5，體積比；合成肽鏈制備Fmoc-Pro-Wang樹脂1)取75gWang樹脂(0.8mmol/g樹脂，60mmol)，用1000mlDMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干。
2)取81g(FW337.4，240mmol)Fmoc-Pro-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。
3)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干，約得85g。
制備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂1)加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
2)加入155.7g(FW648.8，240mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。
3)吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。
制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加84.9g(FW354，240mmol)Fmoc-Leu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
制備Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加84.9g(FW354，240mmol)Fmoc-D-Leu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
制備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加110.4g(FW459.5，240mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加92.1g(FW383.4，240mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。
制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加126.3g(FW426.5，240mmol)Fmoc-Trp-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
制備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加148.7g(FW619.7，240mmol)Fmoc-His(Trt)-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。加入1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)10分鐘。
制備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加1000ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，吹干，分別用DMF、無水乙醇和DMF各洗滌三次，吹干。加30.9g(FW129，240mmol)pGlu-OH、77.1g(FW321，240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW153，240mmol)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。
切肽將保護九肽轉(zhuǎn)移至1000ml反應(yīng)器中，加入事先配制好并預(yù)冷至約5℃的試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)，25℃攪拌2小時。減壓除溶劑至小體積，加入1000ml冷乙醚沉淀，離心收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥。
乙胺化HOBt-乙胺的制備67.5gHOBT加6000ml水，加入67ml乙胺攪拌至HOBt溶解。冷凍干燥。將HOBt-乙胺轉(zhuǎn)移到切肽后的粗品中，再加入DIC 48g，25℃攪拌過夜。乙醚沉淀。過濾，用乙醚洗滌三次，得亮丙瑞林粗品58g(48.0mmol)，收率80％。
分離純化將亮丙瑞林粗品溶于5％乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為500ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，約得20g白色塊狀物成品(MW1209，6.2mmol)，總收率27.6％(以Wang樹脂的60mmol計)。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成亮丙瑞林的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以.Wang樹脂或CTC樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護九肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，獲得粗品，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，制得亮丙瑞林精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護九肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Pro-Wang樹脂取Wang樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，吹干，然后加入溶解于接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW337.4)、TBTU/HBTU(FW321)、HOBT(FW153)的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Pro-Wang樹脂；所說的接肽試劑為NMM∶DMF＝1∶5～15，下同；所說的脫帽試劑為PIP∶DMF＝1∶2～5，下同；混合物中Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Pro-OH的的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；(2)制備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(1)的Fmoc-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Fmoc-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；(3)制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(2)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(4)制備Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(3)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Leu-OH(FW354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-D-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(4)的Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Fmoc-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(5)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。Fmoc-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(6)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(7)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹于，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍。Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(9)制備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂在步驟(8)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂重量體積濃度為5～20ml/g；pGlu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～5倍；Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5～20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第一步的反應(yīng)溫度為20～30℃，反應(yīng)時間為0.5～1.5小時，第二步的反應(yīng)溫度為20～30℃，反應(yīng)時間為5～30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的切肽包括如下步驟將上述步驟(9)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Wang樹脂加入預(yù)冷至0～10℃的切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝680ml/18ml/18ml/3.6ml)中，20～30℃反應(yīng)1～3小時，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的乙胺/HOBT接上乙胺基的方法包括如下步驟將HOBT、水和乙胺的混合物冷凍干燥，獲得HOBt-乙胺化合物；將HOBt-乙胺混合物加入切肽后的粗品中，再加入DIC或TBTU、HBTU，20～30℃反應(yīng)8～24小時，加乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗滌，獲得亮丙瑞林粗品，收率80％；HOBT、水和乙胺的重量比例為HOBT∶水∶乙胺＝1∶50～100∶0.5～2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，粗品經(jīng)C18或C8柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將亮丙瑞林粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18或C8柱純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為100-650ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品(MW1209)，總收率27.6％(以Wang樹脂的60mmol計)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，乙酸銨的重量濃度為0.01～10％。乙腈的重量濃度為10～40％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成亮丙瑞林的制備方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟以Wang樹脂或CTC樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護九肽樹脂，其間依次脫去Fmoc－保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，最后用乙胺/HOBT接上乙胺基，獲得粗品，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，制得亮丙瑞林精品。本發(fā)明的方法，具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，采用C18(或C8)柱進行分離純化，純化收率高達25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為95.4％，總收率為21.9％。
文檔編號C07K1/04GK1865280SQ20051002604
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者周達明 申請人:周達明