專(zhuān)利名稱(chēng)：使用微流體裝置和濃縮步驟的核酸分離用方法和試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
核酸(例如，DNA和RNA)從復(fù)合基質(zhì)如血液、組織樣品、細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基、和法醫(yī)學(xué)樣品的分離和純化在遺傳研究、核酸探針診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)DNA檢驗(yàn)、和需要核酸擴(kuò)增的其它領(lǐng)域中是重要的方法。本領(lǐng)域中已知多種制備擴(kuò)增過(guò)程用核酸的方法，然而，每一種方法都有各自的局限性。
從全血分離DNA的最常用方法涉及使用密度梯度分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。雖然這種方法對(duì)于研究應(yīng)用有效，但是其通常不適合用于常規(guī)的一體化高通量微流體裝置。
包含非離子型清潔劑的低滲緩沖液可用于將紅細(xì)胞(RBC)以及白細(xì)胞(WBC)裂解而保持細(xì)胞核完整無(wú)損。在另一種方法中，當(dāng)全血經(jīng)過(guò)凍融時(shí)，只有RBC裂解。完整無(wú)損的WBC或它們的核可以通過(guò)離心回收。對(duì)于將RBC裂解而不破壞WBC，還可以使用水性稀釋物作為一種方法。用于RBC的選擇性裂解的其它方法包括使用氯化銨或季銨鹽，以及在低滲緩沖液的存在下使RBC經(jīng)過(guò)低滲性休克。然而，在使用這些方法之一的常規(guī)方法中，抑制PCR的物質(zhì)(如，酶抑制劑)與核和/或核酸共沉淀。必需在常規(guī)的高通量微流體裝置中進(jìn)行分析之前除去這些抑制劑。
雖然例如煮沸、用蛋白酶類(lèi)水解、暴露于超聲波、清潔劑、或強(qiáng)堿下的處理已被用于DNA的提取，但是堿提取是最簡(jiǎn)單的方法之一。例如，美國(guó)專(zhuān)利5,620,852(Lin等人)描述了在短達(dá)1分鐘的時(shí)間內(nèi)在室溫下用堿(如，NaOH)處理從全血有效提取DNA。然而，為了得到潔凈的DNA，除去血紅蛋白以及血漿蛋白是必要的。這已經(jīng)通過(guò)使用短暫的水洗步驟實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)將血液懸浮在水中，隨后進(jìn)行離心，棄去上清液，然后用NaOH提取小球(pellet)(參見(jiàn)例如，Biotechniques，Vol.25，No.4(1998)，第588頁(yè))。用來(lái)裂解細(xì)胞的大量的水使得該方法不適合用于標(biāo)準(zhǔn)的微流體裝置。
美國(guó)專(zhuān)利5,010,183(Kellogg等人)描述了使用堿裂解法從血液提取DNA的離心微流體基平臺(tái)。該方法涉及將原始樣品(如，5微升(μL)的全血或E.Coli懸浮液)與5μL的10毫摩(mM)NaOH混合，加熱到95℃，維持1-2分鐘以使細(xì)胞裂解，釋放DNA和使蛋白質(zhì)變性以抑制PCR，通過(guò)與5μL的16mM TRIS-HCl(pH7.5)混合將裂解產(chǎn)物中和，將中和后的裂解產(chǎn)物與8-10μL的液體PCR試劑和引物混合，隨后熱循環(huán)。令人遺憾的是，雖然試劑量小并且適于微流體裝置，但是微流體裝置中DNA的下游處理仍是挑戰(zhàn)。
另一個(gè)常規(guī)方法使用苯酚氯仿提取。然而，其需要使用有毒并具有腐蝕性的化學(xué)品，并且不容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
固相提取也被用于核酸分離。例如，從核酸來(lái)源分離核酸的一個(gè)方法涉及在反應(yīng)容器中將二氧化硅粒子的懸浮液與經(jīng)過(guò)緩沖的離液劑如硫氰酸胍混合，隨后加入樣品。在離液劑的存在下，核酸被吸附到二氧化硅上，通過(guò)離心使其從液相分離，用醇水混合物洗，最后使用稀的緩沖劑水溶液洗脫。二氧化硅固相提取需要使用醇洗滌步驟以除去殘留的離液劑而不洗脫核酸；然而必需非常小心以除去所有痕量的醇(熱蒸發(fā)或用另一種非常易揮發(fā)和易燃的溶劑洗)以防止抑制在隨后步驟中用來(lái)對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增或改性的敏感性酶。然后用水或洗脫緩沖液洗脫核酸。這種結(jié)合、漂洗、和洗脫方法是許多市售試劑盒的原理，如Qiagen(Valencia，CA)；然而，這種方法非常麻煩并且包括多個(gè)洗滌步驟，使得其難以適用于微流體裝置。
離子交換法產(chǎn)生高質(zhì)量的核酸。然而，離子交換法導(dǎo)致高水平的鹽的存在，必須在核酸可被進(jìn)一步使用之前將其除去。
國(guó)際公開(kāi)WO 01/37291 Al(MagNA Pure)描述了磁性玻璃粒子的應(yīng)用和其中通過(guò)與包含離液鹽和蛋白酶K的專(zhuān)用緩沖液培養(yǎng)而將樣品裂解的分離方法。加入磁性玻璃粒子，包含在樣品中的全部核酸結(jié)合于粒子的表面。通過(guò)若干洗滌步驟除去未結(jié)合的物質(zhì)。最后，在高溫下用低鹽緩沖液洗脫，得到純化的全部核酸。
還有另一個(gè)常規(guī)方法涉及將生物樣品施用于疏水性有機(jī)聚合物固相上以選擇性地截留核酸，和隨后用非離子型表面活性劑除去被截留的核酸。另一個(gè)方法涉及用非離子型表面活性劑處理疏水性有機(jī)聚合物材料，洗滌表面，并且隨后使經(jīng)過(guò)處理的固體有機(jī)聚合物材料接觸生物樣品，以減少結(jié)合于有機(jī)聚合物固相上的核酸的量。雖然這些固相方法對(duì)于從生物樣品分離核酸是有效的方法，但是仍然需要其它方法，特別是適合微流體裝置的方法。
對(duì)前述公開(kāi)和現(xiàn)有技術(shù)的討論不構(gòu)成對(duì)這些資料作為公開(kāi)的、已知的或普通常識(shí)的一部分承認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于分離核酸，優(yōu)選純化和回收核酸的方法。
根據(jù)本發(fā)明分離的核酸可用于例如檢測(cè)樣品中具體核酸的存在的試驗(yàn)中。這種試驗(yàn)在疾病的預(yù)測(cè)和診斷、法醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、和公共衛(wèi)生中具有重要性。例如，分離的DNA可經(jīng)過(guò)雜交和/或擴(kuò)增，用于檢測(cè)個(gè)體中傳染性病毒或突變基因的存在，用于測(cè)定該個(gè)體患有傳染性疾病或遺傳學(xué)起源的疾病的概率。檢測(cè)被篩選的數(shù)百或數(shù)千個(gè)樣品中的一個(gè)樣品中的傳染性病毒或突變的能力對(duì)于處于疾病危險(xiǎn)下的群體的早期診斷或流行病學(xué)有顯著的重要性，例如，HIV感染、癌癥、或?qū)Π┌Y的易感性的早期檢測(cè)，或在新生兒的疾病普查中，其中早期檢測(cè)可能有助于診斷和治療。另外，本發(fā)明的方法還可以用于基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室，用于從培養(yǎng)的細(xì)胞或生物化學(xué)反應(yīng)中分離核酸。核酸可用于酶促修飾如限制性?xún)?nèi)切酶消化、測(cè)序、和擴(kuò)增。
本發(fā)明提供用于從包括核酸(如，DNA、RNA、PNA)的樣品分離核酸的方法和試劑盒，所述核酸可包括或不包括在含核細(xì)胞(如，白細(xì)胞)內(nèi)。這些方法涉及從抑制劑如血紅素(heme)及其降解產(chǎn)物(如，鐵離子或其鹽)最終分離核酸，抑制劑是不希望的，因?yàn)樗鼈兛梢砸种茢U(kuò)增反應(yīng)(如，在PCR反應(yīng)中的情況)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供包括核酸和抑制劑的樣品；將樣品置于加料室中；將樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成樣品濃縮區(qū)，其中樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使樣品濃縮區(qū)與樣品次濃縮區(qū)分離，從而從樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；任選地用水或緩沖液稀釋分離的樣品濃縮區(qū)，任選地進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，任選地分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以降低抑制劑的濃度到不會(huì)妨礙擴(kuò)增過(guò)程的水平；在任選加熱下任選地將如果存在的含核酸的物質(zhì)裂解以釋放核酸；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和任選的細(xì)胞外抑制劑(所述含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同)的樣品；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑的裂解樣品的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；任選地用水(優(yōu)選用不含核糖核酸酶的無(wú)菌水)或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，任選地進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，任選地分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸(任選地加熱以使蛋白質(zhì)變性)；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH(和任選地進(jìn)行擴(kuò)增如PCR)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和任選的細(xì)胞外抑制劑(所述含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同)的樣品；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑的裂解樣品的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；用水(優(yōu)選用不含核糖核酸酶的無(wú)菌水)或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；進(jìn)一步使用強(qiáng)堿和加熱裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
本發(fā)明還提供用于實(shí)施本發(fā)明的各種方法的試劑盒。
定義“核酸”應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域中已知的含義，并且是指DNA(如，基因組DNA、cDNA、或質(zhì)粒DNA)、RNA(如，mRNA、tRNA、或rRNA)、和PNA。其可為多種形式，包括但不限于雙股或單股結(jié)構(gòu)、環(huán)狀、質(zhì)粒、相對(duì)短的寡核苷酸、肽核酸(也稱(chēng)為PNA)(如Nielsen等人，Chem.Soc.Rev.，26，73-78(1997)中所述的)，等等。核酸可為基因組DNA，其可包括完全染色體或染色體的一部分。DNA可以包括編碼序列(如，用于編碼mRNA、tRNA、和/或rRNA)和/或非編碼序列(如，著絲粒、端粒、基因間區(qū)、基因內(nèi)區(qū)、轉(zhuǎn)位子、和/或微衛(wèi)星序列)。核酸可包括任何天然存在的核苷酸以及進(jìn)行人工或化學(xué)修飾的核苷酸、突變核苷酸等。核酸可包括非核酸組分，如肽(如在PNA中)、標(biāo)記物(放射性同位素或熒光標(biāo)識(shí)物)、等等。
“含核酸的物質(zhì)”是指核酸的來(lái)源，如細(xì)胞(如，白細(xì)胞、去核的紅細(xì)胞)、細(xì)胞核、或病毒、或包容含核酸的結(jié)構(gòu)的任何其它組成(如，質(zhì)粒、粘粒、或類(lèi)病毒、古細(xì)菌)。細(xì)胞可為原核的(如，革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌)或真核的(如，血細(xì)胞或組織細(xì)胞)。如果含核酸的物質(zhì)為病毒，其可包括RNA或DNA基因組；其可為致命的、減毒的、或非傳染性的；并且其可感染原核或真核細(xì)胞。含核酸的物質(zhì)可為天然存在的、經(jīng)人工修飾的、或經(jīng)人工產(chǎn)生的。
“分離的”是指已經(jīng)從樣品中的至少一部分抑制劑(即，至少一種至少一部分抑制劑)分離出的核酸(或含核酸的物質(zhì))。這包括從其它材料如細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鹽和其它抑制劑分離出所需的核酸。更優(yōu)選地，分離的核酸為基本上純化的。“基本上純化的”是指分離至少3皮克/微升(pg/μL)，優(yōu)選至少2納克/微升(ng/μL)，更優(yōu)選至少15ng/μL的核酸，同時(shí)使原始樣品中抑制劑的量降低至少20％，優(yōu)選降低至少80％，更優(yōu)選降低至少99％。雜質(zhì)通常是除了樣品中的溶劑之外的細(xì)胞組分和細(xì)胞核組分，如血紅素和相關(guān)產(chǎn)物(氯高鐵血紅素、正鐵血紅素)和金屬離子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鹽等。因此，術(shù)語(yǔ)“基本上純化的”一般是指從樣品分離出大部分抑制劑(如，血紅素及其降解產(chǎn)物)，使得至少部分地除去能夠妨礙分離的核酸的隨后應(yīng)用的化合物。
“附著于”或“附著”或“結(jié)合”是指抑制劑對(duì)任選的固相材料的可逆性滯留，其可通過(guò)多種機(jī)制，包括較弱的力，如范德華相互作用、靜電相互作用、親合性結(jié)合、或物理截留。這個(gè)術(shù)語(yǔ)的使用并未暗示作用機(jī)制，并且包括吸附機(jī)制和吸收機(jī)制。
“固相材料”是指無(wú)機(jī)或有機(jī)材料，優(yōu)選由重復(fù)單元制成的聚合物，重復(fù)單元可相同或不同，為有機(jī)和/或無(wú)機(jī)的、天然或合成來(lái)源的化合物。這包括均聚物和雜聚物(如，二元共聚物、三元共聚物、四元共聚物等，其可為例如無(wú)規(guī)或嵌段的)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括纖維狀或顆粒形式的聚合物，其可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法容易地制備。這種材料通常形成多孔基質(zhì)，雖然對(duì)于某些實(shí)施方案，固相還指固體表面，如聚合物材料的無(wú)孔片材。
任選的固相材料可以包括捕獲部位?！安东@部位”是指固相材料上用于附著材料的部位。通常，捕獲部位包括共價(jià)連接于或以其它方式連接于(如，疏水性連接于)固相材料上的官能團(tuán)或分子。
短語(yǔ)“涂布在固相材料上的涂層試劑”是指涂布在固相材料的至少一部分上的材料，如，涂布在原纖維基質(zhì)和/或吸附性粒子的至少一部分上的材料。
“表面活性劑”是指降低其溶解于其中的介質(zhì)的表面張力或界面張力的物質(zhì)。
“強(qiáng)堿”是指在水中完全解離的堿，如，NaOH。
“聚電解質(zhì)”是指作為帶電聚合物的電解質(zhì)，其通常具有比較高的分子量，如聚苯乙烯磺酸。
“可選擇性滲透的聚合物屏障”是指根據(jù)大小和電荷可選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)液體的聚合物屏障。
“濃縮區(qū)”是指可為小球形式，相對(duì)于次濃縮區(qū)具有較高濃度的含核酸的物質(zhì)、細(xì)胞核、和/或核酸的樣品區(qū)域。
如本文中使用的，“基本上分離”，特別是在將樣品濃縮區(qū)與樣品次濃縮區(qū)分離的情況中，是指除去樣品總量的低于25％的核酸(無(wú)論其為游離的、或在細(xì)胞核內(nèi)、或在其它含核酸的物質(zhì)內(nèi))總量的至少40％。優(yōu)選地，從樣品的其余部分分離出樣品總量的低于10％的核酸總量的至少75％。更優(yōu)選地，從樣品的其余部分分離出樣品總量的低于5％的核酸總量的至少95％。
“抑制劑”是指用于例如擴(kuò)增反應(yīng)的酶抑制劑。這種抑制劑的例子通常包括鐵離子或其鹽(如，F(xiàn)e2+或其鹽)和其它金屬鹽(如，堿金屬離子、過(guò)渡金屬離子)。其它抑制劑可以包括蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、碳水化合物、血紅素及其降解產(chǎn)物、尿素、膽汁酸、腐殖酸、多糖、細(xì)胞膜、和胞質(zhì)組分。在人血液中的PCR的主要抑制劑為血紅蛋白、乳鐵蛋白、和IgG，其分別存在于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、和血漿中。本發(fā)明的方法使至少一部分抑制劑(即，至少一種至少一部分抑制劑)與含核酸的物質(zhì)分離。如本文中討論的，含抑制劑的細(xì)胞可與含細(xì)胞核的細(xì)胞或其它含核酸的物質(zhì)相同。抑制劑可包含在細(xì)胞中或者可位于細(xì)胞外。細(xì)胞外抑制劑包括所有不包含在細(xì)胞內(nèi)的抑制劑，其包括例如存在于血清或病毒中的那些抑制劑。
“優(yōu)先使至少一部分抑制劑附著于固相材料”是指一種或多種類(lèi)型的抑制劑比含核酸的物質(zhì)(如，細(xì)胞核)和/或核酸以更大的程度附著于任選的固相材料上，并且通常不使顯著部分的含核酸的物質(zhì)和/或細(xì)胞核附著于固相材料上。
“微流體”是指具有一個(gè)或多個(gè)流體通道、室、或?qū)Ч艿难b置，其具有的至少一個(gè)內(nèi)部橫截面尺寸(如，深度、寬度、長(zhǎng)度、直徑等)小于500μm、通常為0.1μm到500μm。在本發(fā)明使用的裝置中，優(yōu)選微尺度通道或室的至少一個(gè)橫截面尺寸為0.1μm到200μm、更優(yōu)選0.1μm到100μm、通常為1μm到20μm。通常，微流體裝置包括多個(gè)室(處理室、分離室、混合室、廢料室、稀釋劑室、擴(kuò)增反應(yīng)室、加料室等)，每個(gè)室限定用于包含樣品的容量；并且有至少一個(gè)分配通道連接陣列的多個(gè)室；其中陣列中的至少一個(gè)室可以包括裂解試劑(從而其經(jīng)常被稱(chēng)作混合室)。
術(shù)語(yǔ)“包括”及其變體在這些術(shù)語(yǔ)出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中時(shí)不是具有限制性含義。
如本文中使用的，“一”、“一個(gè)”、“該”、“至少一個(gè)”、和“一個(gè)或多個(gè)”可互換地使用并且是指一個(gè)或多個(gè)。
還在本文中，由端點(diǎn)表示的數(shù)值范圍的敘述包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)目(如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容不用于描述各個(gè)公開(kāi)的實(shí)施方案或本發(fā)明所有的執(zhí)行。下述的描述更具體地舉例說(shuō)明示例性的實(shí)施方案。在本申請(qǐng)的幾個(gè)地方，通過(guò)實(shí)施例的列舉提供指導(dǎo)，所述實(shí)施例可以不同組合使用。在每種情況中，列舉例只是代表性的，不應(yīng)將其解釋為排它的列舉例。另外，描述了不同的實(shí)施方案，其中每個(gè)實(shí)施方案的多個(gè)元件可被用于其它實(shí)施方案，即使沒(méi)有具體地描述。


圖1表示用于本發(fā)明某些方法中的微流體裝置。
示例性實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供用于從樣品，通常是生物樣品，分離核酸，優(yōu)選基本上純形式的核酸的多種方法和試劑盒。本發(fā)明提供用于從包括核酸(如，DNA、RNA、PNA)的樣品分離核酸的方法和試劑盒，所述核酸可包括在或不包括在含核細(xì)胞(如，白細(xì)胞)中。
應(yīng)該理解，雖然該方法涉及從樣品分離核酸，但是該方法未必是從含核酸的物質(zhì)(如，細(xì)胞核)除去核酸。也就是說(shuō)，可能需要另外的步驟，以進(jìn)一步從例如細(xì)胞核分離核酸。
本發(fā)明的方法涉及最終使核酸與抑制劑如血紅素及其降解產(chǎn)物(如，鐵鹽)分離，抑制劑是不希望有的，因?yàn)樗鼈兛梢种茢U(kuò)增反應(yīng)(如，在PCR反應(yīng)中的情況)。更具體地，本發(fā)明的方法涉及使樣品中的至少一部分核酸與至少一種抑制劑的至少一部分分離。優(yōu)選的方法涉及除去包含核酸的樣品中的基本上所有的抑制劑，使得核酸是基本上純的。例如，含鐵的抑制劑的最終濃度不大于約0.8微摩爾(μM)，其為常規(guī)PCR系統(tǒng)中可容許的存在水平。
為了從全血得到潔凈的DNA，通常期望除去血紅蛋白以及血漿蛋白。當(dāng)紅細(xì)胞裂解時(shí)，釋放血紅素和相關(guān)化合物，它們抑制Taq聚合酶。全血中正常的血紅蛋白濃度為每100毫升(mL)15克(g)，基于此，經(jīng)過(guò)溶血的全血中的血紅素的濃度為約10毫摩(mM)。為了使PCR令人滿(mǎn)意地進(jìn)行，應(yīng)當(dāng)將血紅素的濃度降低到微摩爾(μM)水平。這可以通過(guò)稀釋實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)使用例如與抑制劑結(jié)合的物質(zhì)除去抑制劑而實(shí)現(xiàn)。
通常，將包含核酸的樣品在流通(flow-through)容器中進(jìn)行處理，雖然這種容器不是本發(fā)明的必需要求。優(yōu)選地，對(duì)于本發(fā)明的某些方法，處理設(shè)備為微流體結(jié)構(gòu)。
樣品本發(fā)明的方法可用于從各種樣品，特別是生物樣品，分離核酸，所述樣品如體液(如，全血、血清、尿、唾液、腦脊液、精液、或滑液淋巴液)、不同組織(如，皮膚、毛發(fā)、舌苔、糞便、瘤、或器官如肝或脾)、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液等。樣品可為食物樣品、飲料樣品、發(fā)酵肉湯、用于疾病或病癥的診斷或處置或監(jiān)控或治療的臨床樣品、法醫(yī)學(xué)樣品、農(nóng)業(yè)樣品(如，得自植物或動(dòng)物)、或環(huán)境樣品(如，土壤、污物、或垃圾)。
生物樣品為具有生物來(lái)源或生化來(lái)源的那些。適于本發(fā)明方法中的那些生物樣品可來(lái)自哺乳動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或酵母菌源。生物樣品可為單獨(dú)的細(xì)胞形式或?yàn)榻M織形式。細(xì)胞或組織可以來(lái)自離體培養(yǎng)。重要地是，本發(fā)明的某些實(shí)施方案使用未經(jīng)任何預(yù)處理(如，裂解、過(guò)濾等)的全血作為感興趣的樣品。
對(duì)于某些實(shí)施方案，樣品如全血可以通過(guò)離心進(jìn)行預(yù)處理，并且從血液分離白細(xì)胞(即，血沉棕黃層)并用作本發(fā)明方法中的樣品。
對(duì)于某些實(shí)施方案，樣品可在其經(jīng)歷本發(fā)明的處理之前(即，將樣品加入到微流體裝置之前)經(jīng)歷超速離心以濃縮樣品。這對(duì)于含病毒的樣品特別合乎需要。
樣品可為溶解或分散在水或有機(jī)介質(zhì)中的固體樣品(如，固體組織)，或已經(jīng)從中將核酸提取到水或有機(jī)介質(zhì)中的固體樣品。例如，樣品可為器官勻漿(如，肝、脾)。因此，樣品可以包括預(yù)先經(jīng)過(guò)提取的核酸(特別是如果其為固體樣品的話(huà))。
樣品的類(lèi)型不是本發(fā)明的限制。然而，通常，樣品包括含核酸的物質(zhì)和需要與核酸分離的抑制劑。在這種上下文中，含核酸的物質(zhì)是指各種細(xì)胞(如，白細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞)、細(xì)胞核、病毒、或包容含核酸的結(jié)構(gòu)的任何其它組成(如，質(zhì)粒、粘粒、或類(lèi)病毒、古細(xì)菌)。在這種方法的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，含核酸的物質(zhì)包括細(xì)胞核。在某些實(shí)施方案中，這種細(xì)胞核為完整無(wú)損的(即，基本上未裂解的)。
在某些實(shí)施方案中，樣品可為部分裂解的(如，預(yù)裂解以釋放抑制劑)，在這種情況下，在本發(fā)明的方法中可能需要裂解。在某些實(shí)施方案中，樣品可為完全裂解的，在這種情況中，本發(fā)明的方法不必然需要裂解試劑。因此，樣品可包括游離(如，不在細(xì)胞內(nèi))的核酸和游離(如，不在細(xì)胞內(nèi))的抑制劑。
分離的(即，與抑制劑分離的)核酸可用于(優(yōu)選不經(jīng)進(jìn)一步純化或洗滌)多種應(yīng)用(如，擴(kuò)增、測(cè)序、標(biāo)記、淬滅、限制性?xún)?nèi)切酶消化、連接、逆轉(zhuǎn)錄酶、雜交、DNA印跡、RNA印跡等)。具體地，其可用于測(cè)定主體的基因組。其可用于診斷樣品中微生物(如，細(xì)菌、病毒)的存在，并且隨后可用于監(jiān)控和/或治療由微生物引起的對(duì)樣品來(lái)源的損傷。本發(fā)明的方法、材料、系統(tǒng)、和試劑盒特別適于制備在高通量或自動(dòng)化處理(特別是微流體系統(tǒng))中使用的擴(kuò)增技術(shù)(如，PCR、LCR、MASBA、SDA、和bDNA)用核酸提取物。因此，對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，分離的核酸被轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增反應(yīng)室(如微流體裝置中的PCR樣品室)中。
可根據(jù)本發(fā)明從不純的、部分純的或純的樣品分離核酸(即，與抑制劑分離)。原始樣品的純度不是至關(guān)重要的，因?yàn)榭蓮纳踔练浅２患兊臉悠贩蛛x出核酸。例如，可從不純的生物流體樣品如血液、唾液、或組織得到核酸。如果期望較高純度的原始樣品，可使樣品在經(jīng)歷本發(fā)明的方法之前根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何常規(guī)方法進(jìn)行處理。例如，可以處理樣品，使得在樣品經(jīng)歷本發(fā)明的方法之前除去某些雜質(zhì)，如不溶性物質(zhì)。
如本文所述分離的核酸可具有任何分子量并且為單股形式、雙股形式、環(huán)形、質(zhì)粒等?？蓪⒍喾N核酸彼此分離(如，從DNA分離RNA，或從單鏈DNA分離雙鏈DNA)。例如，可使用本發(fā)明的方法分離具有約10到約50個(gè)堿基長(zhǎng)度的小的寡核苷酸或核酸分子、具有約1000個(gè)堿基到約10,000個(gè)堿基長(zhǎng)度的較長(zhǎng)分子、甚至具有約50kb到約500kb的大分子量核酸。在一些方面中，根據(jù)本發(fā)明分離的核酸可優(yōu)選具有約10個(gè)堿基到約10萬(wàn)個(gè)堿基。
含核酸的樣品可具有不同的容量。例如，對(duì)于微流體結(jié)構(gòu)，通常優(yōu)選非常小的容量，如，10μL(優(yōu)選不大于100μL)。應(yīng)該理解，如果經(jīng)過(guò)預(yù)處理如通過(guò)濃縮，可使用更大容量的樣品。
對(duì)于低拷貝數(shù)基因，通常需要更大的樣品容量以保證感興趣的序列存在于樣品中。然而，更大的樣品量具有更大量的抑制劑，并且通常使其自身不適于微流體結(jié)構(gòu)。因此，對(duì)于低拷貝數(shù)的情況，可能需要使用100μL或更大的容量，以得到可重現(xiàn)的結(jié)果；然而，由于較高的樣品容量，每個(gè)微流體裝置所處理的樣品數(shù)可能減小。
在本發(fā)明的方法中，用于濃縮含核酸的物質(zhì)的離心步驟對(duì)于低拷貝數(shù)樣品是有用的。然而，雖然核酸濃度在例如處理室的底部顯著增加，但是抑制劑濃度仍然較高。雖然在次濃縮區(qū)中除去大部分抑制劑，即血清和被破壞的RBC中的蛋白質(zhì)(如，血紅素和血紅素相關(guān)產(chǎn)物)，但是樣品的含核酸的濃縮區(qū)仍然有顯著量的抑制劑存在，然而，核酸與抑制劑的比非常高，產(chǎn)生核酸相對(duì)濃縮的樣品。然后，如果期望的話(huà)，可使該樣品濃縮區(qū)接觸任選的固相材料，如本文中所述的，以除去殘留的抑制劑。
對(duì)于高拷貝數(shù)基因，可使用小達(dá)2μL的樣品容量，但是使用更大容量(如，20μL)時(shí)重現(xiàn)性更好。在較小容量的情況中，可以得到較高的通過(guò)量(即，每個(gè)微流體裝置處理的樣品數(shù))。在較大容量(如，20μL)的情況中，可能沒(méi)必要經(jīng)歷用于濃縮含核酸的細(xì)胞的預(yù)旋轉(zhuǎn)步驟。
對(duì)于其中除了本文中所述的濃縮/分離過(guò)程之外還使用固相材料的那些實(shí)施方案，施用于固相材料上的含核酸的樣品可為任何量，該量由固相材料的量決定。優(yōu)選地，施用于固相材料上的樣品中核酸的量低于固相材料的干重，通常為約1/10,000到約1/100(重量，核酸/固相)。施用于任選的固相材料上的樣品中核酸的量可例如多達(dá)100克或低達(dá)1皮克。
優(yōu)選從本發(fā)明方法分離的所需核酸為最初施加的樣品中全部核酸的量的至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少90％。因此，本發(fā)明的某些優(yōu)選方法提供以高回收率從樣品回收所需核酸。另外，根據(jù)本發(fā)明可定量地回收極少量的核酸分子。回收率或收率主要取決于樣品的質(zhì)量而不是方法本身。因?yàn)楸景l(fā)明的某些實(shí)施方案提供不需要從大容量濃縮的核酸制備法，因此本發(fā)明避免了核酸損失的危險(xiǎn)。
在PCR樣品中具有太多的DNA可能對(duì)DNA的擴(kuò)增有害，因?yàn)橛刑嗟腻e(cuò)引部位(misprimed site)。這產(chǎn)生許多線(xiàn)性或按指數(shù)方式擴(kuò)增的非目標(biāo)序列。因?yàn)閿U(kuò)增的特異性隨著非目標(biāo)DNA量的增加而消失，不以任何顯著程度發(fā)生目標(biāo)序列的指數(shù)積聚。因此，希望控制進(jìn)入每個(gè)PCR樣品中的DNA的量。DNA的量通常不超過(guò)1微克/反應(yīng)，通常為至少1皮克/反應(yīng)。PCR混合物中典型的最終DNA濃度為0.15納克/微升到1.5納克/微升。在微流體裝置的情況中，可以在提純之后、PCR之前將樣品分流，使得每個(gè)樣品具有適量的DNA?；蛘?，可以將樣品在如以下更具體描述的包括裝有調(diào)節(jié)閥的處理室的樣品處理裝置(具體為微流體裝置)中進(jìn)行足夠地稀釋?zhuān)沟妹總€(gè)PCR混合物中存在適量的DNA。在診斷裝置中，因?yàn)榘准?xì)胞的量可顯著不同，很難事前預(yù)測(cè)要被分離的DNA的量。然而，有效范圍為每200μL血液含3微克(μg)到12μg的DNA。對(duì)于血沉棕黃層，有效范圍為每200μL血沉棕黃層含25μg到50μg的DNA。
裂解試劑和裂解條件對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，在處理過(guò)程中的一些時(shí)間點(diǎn)，將樣品內(nèi)的細(xì)胞裂解，特別是含核酸的細(xì)胞(如，白細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、病毒細(xì)胞)，以釋放細(xì)胞的內(nèi)容物并形成樣品(即，裂解產(chǎn)物)。本文的裂解為各細(xì)胞的膜的物理破裂，是指外層細(xì)胞膜的和當(dāng)存在核膜時(shí)核膜的物理破裂。這可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行，如通過(guò)蛋白酶水解隨后使蛋白酶熱滅活；用表面活性劑(如，非離子型表面活性劑或十二烷基硫酸鈉)、胍鹽、或強(qiáng)堿(如，NaOH)處理；物理破壞(如，用超聲波)；煮沸；或加熱/冷卻(如，加熱到最低55℃(通常到95℃)并冷卻到室溫或以下(到8℃))，其可以包括冷凍/解凍處理。通常，如果使用裂解試劑，其處于水介質(zhì)中，雖然如果期望時(shí)可以使用有機(jī)溶劑。
可以將全血中的紅細(xì)胞(RBC)裂解而不破壞白細(xì)胞(WBC)，通過(guò)使用水(即，含水稀釋物)作為裂解試劑用于釋放抑制劑。或者，還可使用氯化銨或季銨鹽破壞RBC。還可以使用低滲緩沖液通過(guò)低滲性休克裂解RBC?？梢酝ㄟ^(guò)例如離心回收完整的(即，未破壞的)WBC或它們的細(xì)胞核。
通常，可使用更強(qiáng)的裂解試劑如表面活性劑用于裂解RBC以及含核酸的細(xì)胞(如，白細(xì)胞(WBC)、細(xì)菌細(xì)胞、病毒細(xì)胞)，以釋放抑制劑、細(xì)胞核、和/或核酸。例如，可使用非離子型表面活性劑裂解RBC以及WBC，而不破壞細(xì)胞核?？墒褂梅请x子型表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、和兩性離子表面活性劑裂解細(xì)胞。特別有用的是非離子型表面活性劑。如果期望，可使用表面活性劑的組合?？梢詫⒎请x子型表面活性劑如TRITON X-100加入到含蔗糖和鎂鹽的TRIS緩沖液中，用于細(xì)胞核的分離。
用于裂解的表面活性劑的量足夠高，以有效裂解樣品；還要足夠低，以避免例如沉淀。用于裂解過(guò)程的表面活性劑的濃度基于樣品的總重量通常為至少0.1重量％。用于裂解過(guò)程的表面活性劑的濃度基于樣品的總重量通常不大于4.0重量％，優(yōu)選不大于1.0重量％。通常優(yōu)化該濃度以在盡可能最短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到完全裂解，得到的混合物為PCR相容的。實(shí)際上，加入到PCR雞尾酒中的制劑中的核酸應(yīng)該很少抑制或幾乎不抑制實(shí)時(shí)PCR。
如果期望，可以將緩沖液與表面活性劑混合使用。通常，這種緩沖液提供pH至少為7、通常最高為9的樣品。
通常，可以使用甚至更強(qiáng)的裂解試劑，如強(qiáng)堿，以裂解包含在含核酸的細(xì)胞(如白細(xì)胞)中的任何細(xì)胞核。例如，美國(guó)專(zhuān)利5,620,852(Lin等人)描述的方法可適于本發(fā)明的某些方法，其涉及在室溫下用堿處理(如，NaOH)在短達(dá)1分鐘的時(shí)間內(nèi)從全血提取DNA。通常，有多種強(qiáng)堿可用在堿裂解法中產(chǎn)生有效的pH(如，8-13，優(yōu)選13)。強(qiáng)堿通常為氫氧化物，如NaOH、LiOH、KOH；具有含四價(jià)氮陽(yáng)離子(如，季銨)的氫氧化物；以及堿如叔胺、仲胺或伯胺。通常，強(qiáng)堿的濃度為至少0.01當(dāng)量濃度(N)，并且通常最高為1N。通常，然后將混合物中和，特別是如果核酸經(jīng)歷PCR的話(huà)。在另一種方法中，可在用堿裂解之后加熱以進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變性，隨后將樣品中和。
還可以在加熱下使用蛋白酶K，隨后在更高的溫度下使蛋白酶K熱滅活，用于從細(xì)胞核或WBC分離核酸。
還可以應(yīng)用市售的裂解試劑和中和劑，如根據(jù)微流體尺寸按比例縮小的Sigma的Extract-N-Amp Blood PCR試劑盒?？墒褂酶鼜?qiáng)的裂解溶液如得自GenPoint(Oslo，Norway)的POWERLYSE，用于使難以裂解的細(xì)菌如葡萄球菌、鏈球菌等裂解，以有助于本發(fā)明的某些方法。
在另一種方法中，可使用煮沸法裂解細(xì)胞和細(xì)胞核，釋放DNA，并且同時(shí)沉淀血紅蛋白。上清液中的DNA無(wú)需濃縮步驟可直接用于PCR，使得這種方法可用于低拷貝數(shù)樣品。
在另一種方法中，可在用堿裂解之后加熱以進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變性，隨后將樣品中和。
對(duì)于傳染性疾病，可能有必要對(duì)得自全血的細(xì)菌或病毒進(jìn)行分析。例如，在細(xì)菌的情況中，白細(xì)胞可能以與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合的形式存在。在微流體裝置中，有可能裂解紅細(xì)胞以釋放抑制劑，然后在進(jìn)一步裂解之前通過(guò)例如離心分離出細(xì)菌細(xì)胞和白細(xì)胞。這種含核酸的細(xì)胞(細(xì)菌的和白細(xì)胞的細(xì)胞/細(xì)胞核)的濃縮部分可進(jìn)一步被轉(zhuǎn)移到室中，用于除去抑制劑。然后，可以將例如細(xì)菌細(xì)胞裂解。
可使用熱實(shí)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的裂解，根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞的類(lèi)型而定?；蛘撸梢允褂妹复叻?如，溶菌酶、變?nèi)芫?或化學(xué)法進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞的裂解。優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞通過(guò)堿裂解法進(jìn)行裂解。
使用細(xì)菌用來(lái)繁殖質(zhì)粒在基因組的研究、分析分子生物學(xué)、制備分子生物學(xué)等中是常見(jiàn)的。在包含質(zhì)粒的細(xì)菌的情況中，存在得自細(xì)菌和質(zhì)粒兩者的遺傳物質(zhì)?？梢允褂帽景l(fā)明的方法進(jìn)行提純操作，用于從基因組DNA分離細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片。如此得到的包含質(zhì)粒DNA的上清液稱(chēng)為“澄清的裂解液”?？梢允褂枚喾N方法將澄清裂解液進(jìn)一步純化，如陰離子交換色譜、凝膠過(guò)濾、或用醇沉淀。
在可被結(jié)合在微流體裝置中的細(xì)菌培養(yǎng)物的方案的具體例子中，將E.Coli細(xì)胞培養(yǎng)物離心并再懸浮在TE緩沖液(10mM TRIS、1mMEDTA，pH7.5)中并通過(guò)加入0.1M NaOH/1％SDS(十二烷基硫酸鈉)裂解。通過(guò)加入1體積的3M(三摩爾)乙酸鉀(pH4.8)終止細(xì)胞裂解，并且將上清液離心。將細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)一步純化，得到潔凈的質(zhì)粒DNA。
血漿和血清代表了提交用于分子檢驗(yàn)的包括病毒的大多數(shù)樣本。在全血進(jìn)行分級(jí)之后，血漿或血清樣品可用于提取病毒(即，病毒粒子)。例如，為了從病毒分離DNA，有可能首先通過(guò)將血液離心分出血清。使用在以下更具體描述的調(diào)節(jié)閥，可以將單獨(dú)的血清注入到另一個(gè)室中。然后可將血清離心以濃縮病毒，或者可在使用例如本文中所述的任選的固相材料除去抑制劑之后直接用于隨后的裂解步驟。固相材料可以吸收溶液，使得病毒粒子不通過(guò)材料。然后可以用小的洗脫體積洗脫病毒粒子。通過(guò)加熱或通過(guò)酶促或化學(xué)方法將病毒裂解(例如通過(guò)使用表面活性劑進(jìn)行裂解)并且用于下游的應(yīng)用如PCR或?qū)崟r(shí)PCR中。在其中需要病毒RNA的情況中，可能需要將核糖核酸酶抑制劑加入到溶液中，以阻止RNA降解。
任選的固相材料對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制劑附著于固相(優(yōu)選聚合物)材料，該材料包括任何形式(如，粒子、原纖維、膜形式)的固體基質(zhì)，優(yōu)選其具有與其連接的捕獲部位(如，螯合官能團(tuán))；涂布在固相材料上的涂層試劑(優(yōu)選表面活性劑)；或兩者。涂層試劑可為陽(yáng)離子、陰離子、非離子、或兩性離子型表面活性劑?；蛘撸繉釉噭┛蔀榫垭娊赓|(zhì)或強(qiáng)堿。如果期望，可使用涂層試劑的不同組合。
可用于本發(fā)明的方法的固相材料可包括例如保留抑制劑如血紅素和血紅素降解產(chǎn)物(特別是鐵離子)的多種有機(jī)和/或無(wú)機(jī)材料。這種材料用捕獲部位(優(yōu)選螯合基團(tuán))官能化、涂有一種或多種涂層試劑(如，表面活性劑、聚電解質(zhì)、或強(qiáng)堿)、或兩者。通常，固相材料包括有機(jī)聚合物基質(zhì)。
通常適當(dāng)?shù)牟牧鲜腔瘜W(xué)惰性的、物理和化學(xué)穩(wěn)定的、并且與多種生物樣品相容。固相材料的例子包括二氧化硅、氧化鋯、氧化鋁珠、金屬膠體如金、例如已經(jīng)通過(guò)巰基化學(xué)進(jìn)行官能化處理用于產(chǎn)生捕獲部位的覆金片材。適當(dāng)?shù)木酆衔锏睦影ɡ缇巯N和氟化聚合物。通常在應(yīng)用之前將固相材料洗滌以除去鹽和其它雜質(zhì)。其可以干燥儲(chǔ)存或者儲(chǔ)存在水懸浮液中備用。優(yōu)選固相材料用于流通容器中，諸如例如移液管、注射器、或大型柱、微量滴定板、或微流體裝置中，雖然還可以使用不涉及這些容器的懸浮法。
可用于本發(fā)明的方法的固相材料可包括多種形式的多種材料。例如，其可為松散的或被固定的粒子或小珠形式、纖維、泡沫、玻璃料、微孔膜、膜、或具有微復(fù)制(microreplicated)表面的底物形式。如果固相材料包括粒子，優(yōu)選它們?yōu)榫鶆虻?、球狀的、和剛性的，以保證良好的流體流動(dòng)特征。
對(duì)于本發(fā)明的流通應(yīng)用，這種材料通常為松散的多孔網(wǎng)絡(luò)形式，用于允許大分子均勻地和不受損害地進(jìn)出，并且用于提供較大的表面積。優(yōu)選地，對(duì)于這種應(yīng)用，固相材料具有比較高的表面積，諸如例如，超過(guò)1平方米/克(m2/g)。對(duì)于不涉及使用流體裝置的應(yīng)用，固相材料可以是或不是多孔性基質(zhì)。因此，膜也可用于本發(fā)明的某些方法中。
對(duì)于使用粒子或小珠的應(yīng)用，可以將它們引入到樣品中或?qū)悠芬氲搅Ｗ?小珠的床中并通過(guò)例如離心從中除去?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)多種方法(如，噴霧干燥)將粒子/小珠涂布(如，圖形涂布)到任選地涂有粘合劑的惰性底物(如，聚碳酸酯或聚乙烯)上。如果期望，可以將底物微復(fù)制，用于增加表面積和增強(qiáng)提純。還可以用氧等離子體、電子束或紫外輻射、加熱、或電暈處理方法進(jìn)行預(yù)處理。底物可在微流體裝置的儲(chǔ)庫(kù)上用作例如覆蓋膜，或?qū)訅河诟采w膜上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，固相材料包括原纖維基質(zhì)，其可具有或沒(méi)有陷入其中的粒子。原纖維基質(zhì)可以包括多種纖維中的任一種。通常，纖維在水相環(huán)境是不溶的。其例子包括玻璃纖維、聚烯烴纖維(特別是聚丙烯和聚乙烯微纖維、芳族聚酰胺纖維、氟化聚合物纖維(特別是聚四氟乙烯纖維)、和天然的纖維素纖維?？墒褂美w維的混合物，其對(duì)于核酸的結(jié)合可為活性的或非活性的。優(yōu)選地，原纖維基質(zhì)形成具有至少約15微米、并且最大為約1毫米，更優(yōu)選最大為約500微米厚度的料片。
如果使用粒子，則粒子在水性環(huán)境中通常是不溶的。它們可由一種材料或多種材料的組合制成，如在覆層粒子中。它們可為可膨脹的或不可膨脹的，雖然優(yōu)選它們?cè)谒陀袡C(jī)液體中為不可膨脹的。優(yōu)選地，如果粒子用于附著，其由不膨脹的疏水性材料制成。它們可以根據(jù)對(duì)核酸的親合性進(jìn)行選擇。一些水可膨脹的粒子的例子在美國(guó)專(zhuān)利4,565,663(Errede等人)、4,460,642(Errede等人)、和4,373,519(Errede等人)中描述。在水中不可膨脹的粒子在美國(guó)專(zhuān)利4,810,381(Hagen等人)、4,906,378(Hagen等人)、4,971,736(Hagen等人)、和5,279,742(Markell等人)中描述。優(yōu)選的粒子為聚烯烴粒子，如聚丙烯粒子(如，粉末)。可使用粒子的混合物，其對(duì)于核酸的結(jié)合可為活性或非活性的。
如果使用覆層粒子，涂層優(yōu)選是不溶于水和不溶于有機(jī)溶劑的不可膨脹的材料。涂層可附著或不附著核酸。因此，覆層的基礎(chǔ)粒子可為無(wú)機(jī)或有機(jī)的?；A(chǔ)粒子可包括對(duì)其共價(jià)結(jié)合有有機(jī)基團(tuán)的無(wú)機(jī)氧化物，如二氧化硅、氧化鋁、二氧化鈦、氧化鋯等。例如，可使用共價(jià)結(jié)合的有機(jī)基團(tuán)，如具有不同鏈長(zhǎng)(C2、C4、C8、或C18基團(tuán))的脂肪族基團(tuán)。
包括原纖維基質(zhì)的適當(dāng)?shù)墓滔嗖牧系睦釉诿绹?guó)專(zhuān)利5,279,742(Markell等人)、4,906,378(Hagen等人)、4,153,661(Ree等人)、5,071,610(Hagen等人)、5,147,539(Hagen等人)、5,207,915(Hagen等人)、和5,238,621(Hagen等人)中描述。這種材料可購(gòu)自3M Company(St.Paul，MN)，商業(yè)名稱(chēng)為SDB-RPS(Styrene-Divinyl Benzene Reverse PhaseSulfonate，3M Part No.2241)、陽(yáng)離子-SR膜(3M Part No.2251)、C-8膜(3M Part No.2214)、和陰離子-SR膜(3M Part No.2252)。
特別優(yōu)選包括聚四氟乙烯基質(zhì)(PTFE)的那些。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,810,381(Hagen等人)公開(kāi)了固相材料，其包括聚四氟乙烯原纖維基質(zhì)，和陷入在基質(zhì)中的不可膨脹的吸附性粒子，其中不可膨脹的吸附性粒子與聚四氟乙烯的重量比為約19∶1到4∶1，并且另外其中復(fù)合的固相材料具有20到300毫牛頓/米的凈表面能。美國(guó)專(zhuān)利RE36,811(Markell等人)公開(kāi)了固相提取介質(zhì)，其包括原纖維基質(zhì)，和陷入在基質(zhì)中的吸附性粒子，其中粒子包括超過(guò)30到最多100重量％的多孔性有機(jī)粒子，和少于70到0重量％的多孔性(涂覆有機(jī)層或無(wú)涂層的)無(wú)機(jī)粒子，吸附性粒子與PTFE的重量比為40∶1到1∶4。
特別優(yōu)選的固相材料得自3M Company，St.Paul，MN的商業(yè)名稱(chēng)EMPORE下。EMPORE技術(shù)的基本原理在于使用任何吸附劑粒子產(chǎn)生負(fù)載有粒子的膜、或碟形物的能力。粒子在聚四氟乙烯的惰性基質(zhì)(90％吸附劑10％PTFE，以重量計(jì))內(nèi)緊密地結(jié)合在一起。PTFE原纖維不以任何方式妨礙粒子的活性。EMPORE膜制造工藝產(chǎn)生的提取介質(zhì)，與在常規(guī)固相提取(SPE)柱或柱體中使用的由相同大小的粒子制備的介質(zhì)相比，可得到更致密、更均勻的介質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，固相(如，微孔性熱塑性聚合物載體)具有以由原纖維連接的間隔開(kāi)的、隨機(jī)分散的、具有不均勻形狀的、各向等大的多個(gè)熱塑性聚合物粒子為特征的微孔性結(jié)構(gòu)。粒子彼此間隔，在它們之間提供微孔的網(wǎng)絡(luò)。粒子通過(guò)從每個(gè)粒子輻射到相鄰粒子的原纖維彼此連接。粒子或原纖維中的一種或兩種可為疏水性的。優(yōu)選的這種材料的例子具有較高的表面積，如通過(guò)汞表面積技術(shù)測(cè)量經(jīng)常高達(dá)40米2/克，和最大約5微米的孔徑。
這種類(lèi)型的纖維材料可通過(guò)涉及利用誘導(dǎo)相分離的優(yōu)選技術(shù)產(chǎn)生。這涉及在足夠形成均勻混合物的溫度下用不混溶的液體熔體混合熱塑性聚合物，從溶液形式形成具有所需形狀的制品，將成形的制品冷卻以便誘導(dǎo)液體和聚合物的相分離，并且最終將聚合物固化和除去顯著部分的液體，留下微孔性聚合物基質(zhì)。這種方法和優(yōu)選的材料在美國(guó)專(zhuān)利4,726,989(Mrozinski)、4,957,943(McAllister等人)、和4,539,256(Shipman)中詳細(xì)描述。這種材料稱(chēng)為熱致相分離膜(TIPS膜)并且是特別優(yōu)選的。
其它適當(dāng)?shù)墓滔嗖牧习ㄔ诿绹?guó)專(zhuān)利5,328,758(Markell等人)中公開(kāi)的非織造材料。這種材料包括含壓縮或融合顆粒的非織造料片(優(yōu)選吹制的微纖維)，其包含高吸附效率的色譜級(jí)粒子。
其它適當(dāng)?shù)墓滔嗖牧习ū环Q(chēng)為HIPE Foams的那些，其在例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0011092(Tan等人)中描述。“HIPE”或“高內(nèi)相乳液”是指包括連續(xù)的活性相(通常為油相)、和不與油相混溶的不連續(xù)相或共連續(xù)相(通常為水相)的乳液，其中不混溶相占乳液的至少74體積％。由HIPE制成的許多聚合物泡沫通常為相對(duì)開(kāi)孔的。這意味著大多數(shù)或所有的孔都與相鄰的孔暢通無(wú)阻地相通。這種基本上開(kāi)孔的泡沫結(jié)構(gòu)的孔在孔間具有窗口，其通常足夠大，以允許液體在泡沫結(jié)構(gòu)內(nèi)從一個(gè)孔轉(zhuǎn)移到另一個(gè)孔。
固相材料可以包括用于捕獲抑制劑的捕獲部位。在本文中，“捕獲部位”是指共價(jià)連接于固相材料上的基團(tuán)(如，官能團(tuán))或非共價(jià)(如，疏水性)結(jié)合于固相材料上的分子。
優(yōu)選地，固相材料包括捕獲抑制劑的官能團(tuán)。例如，固相材料可以包括螯合基團(tuán)。在這里，“螯合基團(tuán)”為多分支的并且能夠與金屬原子或離子(雖然抑制劑可能通過(guò)或可能不通過(guò)螯合機(jī)制保持在固相材料上)形成螯合絡(luò)合物的那些。螯合基團(tuán)的引入可以通過(guò)多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，非織造材料可以容納用螯合基團(tuán)官能化的小珠?；蛘?，非織造材料的纖維可直接用螯合基團(tuán)進(jìn)行官能化。
螯合基團(tuán)的例子包括例如-(CH2-C(O)OH)2、三(2-氨基乙基)胺基團(tuán)、亞氨基二乙酸基團(tuán)、次氮基三乙酸基團(tuán)?？梢酝ㄟ^(guò)多種技術(shù)將螯合基團(tuán)引入到固相材料中。它們可通過(guò)材料的化學(xué)合成被引入。或者，可以將包含所需的螯合基團(tuán)的聚合物涂布(如，圖形涂布)到惰性底物(如，聚碳酸酯或聚乙烯)上。如果期望，可以將底物微復(fù)制，用于增加表面積和增強(qiáng)提純。還可以用氧等離子體、電子束或紫外輻射、加熱、或電暈處理方法預(yù)處理。底物可在微流體裝置的儲(chǔ)庫(kù)上用作例如覆蓋膜，或?qū)訅河诟采w膜。
螯合固相材料為市售的并且可在本發(fā)明中用作固相材料。例如，對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，優(yōu)選包括螯合基團(tuán)如亞氨基二乙酸(為鈉鹽的形式)的EMPORE膜。這種膜的粒子在美國(guó)專(zhuān)利5,147,539(Hagen等人)中公開(kāi)并且可作為EMPORE Extraction Disks(47mm，No.2271或90mm，No.2371)購(gòu)自3M Company。對(duì)于本發(fā)明的某些實(shí)施方案，優(yōu)選包括螯合基團(tuán)的銨衍生化的EMPORE膜。為使碟形物處于銨形式，可以將其用50mL的0.1M乙酸銨緩沖液(pH5.3)洗，隨后用幾種試劑水進(jìn)行洗滌。
其它螯合材料的例子包括但不限于交聯(lián)的聚苯乙烯小珠，其可得自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)的商業(yè)名稱(chēng)CHELEX下；具有三(2-氨基乙基)胺、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、聚胺和聚亞胺的交聯(lián)的瓊脂糖小珠；以及購(gòu)自Rohm and Haas(Philadelphia，PA)的商業(yè)名稱(chēng)DUOLITE C-467和DUOLITE GT73下的螯合離子交換樹(shù)脂；AMBERLITE IRC-748、DIAION CR11、DUOLITE C647。
通常，固相材料上的螯合基團(tuán)的所需濃度密度為約0.02納摩/平方毫米，雖然認(rèn)為寬范圍的濃度密度是可能的。
其它類(lèi)型的捕獲材料包括陰離子交換材料、陽(yáng)離子交換材料、活性碳、反相、正相、苯乙烯-二乙烯基苯、氧化鋁、二氧化硅、氧化鋯、和金屬膠體。適當(dāng)?shù)年庪x子交換材料的例子包括通常為氯化物形式的強(qiáng)陰離子交換劑如季銨、二甲基乙醇胺、四價(jià)的烷基胺、三甲基芐基銨、和二甲基乙醇芐基銨；和弱的陰離子交換劑，如多胺。適當(dāng)?shù)年?yáng)離子交換材料的例子包括強(qiáng)的陽(yáng)離子交換劑如磺酸，通常為鈉鹽形式；和弱的陽(yáng)離子交換劑如羧酸，通常為酸的形式。適當(dāng)?shù)奶枷挡牧系睦影‥MPORE碳材料、碳珠。適當(dāng)?shù)姆聪郈8和C18材料的例子包括用十八烷基或辛基進(jìn)行封端的二氧化硅小珠，和具有C8和C18二氧化硅小珠的EMPORE材料(得自3M Co.，St.Paul，MN的EMPORE材料)。正相材料的例子包括羥基和二羥基。
也可將市售的材料進(jìn)行改性或直接用于本發(fā)明的方法中。例如，可以將得自商業(yè)名稱(chēng)LYSE AND GO(Pierce，Rockford，IL)、RELEASE-IT(CPG，NJ)、GENE FIZZ(Eurobio，F(xiàn)rance)、GENERELEASER(Bioventures Inc.，Murffeesboro，TN)、和BUGS NBEADS(GenPoint，Oslo，Norway)的固相材料，以及Zymo小珠(ZymoResearch，Orange，CA)和Dynal小珠(Dynal，Oslo，Norway)作為固相捕獲材料結(jié)合到本發(fā)明的方法中，特別是結(jié)合到微流體裝置中。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，固相材料包括涂層試劑。優(yōu)選涂層試劑選自表面活性劑、強(qiáng)堿、聚電解質(zhì)、可選擇性滲透的聚合物屏障、及其組合。在這種方法的某些實(shí)施方案中，固相材料包括聚四氟乙烯原纖維基質(zhì)、陷入基質(zhì)中的吸附性粒子、和涂布在固相材料上的涂層試劑，其中涂層試劑選自表面活性劑、強(qiáng)堿、聚電解質(zhì)、可選擇性滲透的聚合物屏障、及其組合。在本文中，短語(yǔ)“涂布在固相材料上的涂層試劑”是指涂布在固相材料的至少一部分上的材料，如，涂布在原纖維基質(zhì)和/或吸附性粒子的至少一部分上的材料。
適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑睦恿信e如下。
適當(dāng)?shù)膹?qiáng)堿的例子包括NaOH、KOH、LiOH、NH4OH，以及伯胺、仲胺、或叔胺。
適當(dāng)?shù)木垭娊赓|(zhì)的例子包括聚苯乙烯磺酸(如，聚(4-苯乙烯磺酸鈉)或PSSA)、聚乙烯基膦酸、聚乙烯基硼酸、聚乙烯基磺酸、聚乙烯基硫酸、聚苯乙烯膦酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、木質(zhì)素磺酸鹽、角叉菜膠、肝素、硫酸軟骨素(chondritin sulfate)、及其鹽或其它衍生物。
適當(dāng)?shù)目蛇x擇性滲透的聚合物屏障的例子包括聚合物如丙烯酸酯、丙烯酰胺、吖內(nèi)酯、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、多糖。這種聚合物可為多種形式。它們可為水溶性的、水可膨脹的、水不溶性的、水凝膠形式等。例如，聚合物屏障可以制備為使得其起到作為較大粒子如白細(xì)胞、細(xì)胞核、病毒、細(xì)菌、以及核酸如人基因組DNA和蛋白質(zhì)的過(guò)濾器的作用。這些表面可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇官能團(tuán)、通過(guò)交聯(lián)等進(jìn)行改造而適于根據(jù)尺寸和/或電荷進(jìn)行分離。這種材料容易購(gòu)得或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備。優(yōu)選地，將固相材料用表面活性劑涂布而不過(guò)量洗滌掉任何表面活性劑，雖然如果期望的話(huà)可以洗掉其它涂層試劑。通常，涂布可以多種方法進(jìn)行，如浸漬、輥涂、噴涂等。然后通常在應(yīng)用之前將加載有涂層試劑的固相材料在例如空氣中干燥。
特別需要的是涂有表面活性劑、優(yōu)選涂有非離子型表面活性劑的固相材料。這可以根據(jù)實(shí)施例部分中提到的操作實(shí)現(xiàn)。雖然不打算受理論的限制，但是認(rèn)為表面活性劑的加入增加固相材料的濕潤(rùn)性，其允許抑制劑滲透進(jìn)入固相材料中并與其結(jié)合。
優(yōu)選用于固相材料的涂層試劑為水基溶液，雖然如果期望的話(huà)可以使用有機(jī)溶劑(醇等)。涂層試劑加載量應(yīng)該足夠高，使得樣品能濕透固相材料。然而，其不能太高，使得涂層試劑本身被顯著洗脫。優(yōu)選地，如果涂層試劑用核酸洗脫，在洗脫的樣品中含不超過(guò)約2重量％的涂層試劑。通常，涂層溶液的濃度在溶液中可低達(dá)0.1重量％的涂層試劑，和在溶液中高達(dá)10重量％的涂層試劑。
表面活性劑非離子型表面活性劑。有多種適當(dāng)?shù)姆请x子型表面活性劑為已知的，其可用作裂解試劑(上述討論的)、洗脫劑(如下討論的)、和/或作為任選的固相材料上的涂層。它們包括例如聚氧化乙烯表面活性劑、羧酸酯表面活性劑、羧酸酰胺表面活性劑等。市售的非離子型表面活性劑包括正十二烷?；崽?、正十二烷基-β-D-吡喃葡糖苷、正辛基-β-D-吡喃麥芽糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、正十二烷?；崽恰⒄锘?β-D-吡喃麥芽糖苷、正癸基-β-D-硫代麥芽糖苷、正庚基-β-D-吡喃葡糖苷、正庚基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、正己基-β-D-吡喃葡糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡糖苷、正辛?；崽恰⒄粱?β-D-吡喃葡糖苷、環(huán)己基-正己基-β-D-麥芽糖苷、環(huán)己基-N-甲基-β-D-麥芽糖苷、洋地黃皂苷，和得自商業(yè)名稱(chēng)PLURONIC、TRITON、TWEEN下的那些，以及許多其它市售的和在Kirk Othmer Technical Encyclopedia中列舉的那些。其例子在以下表1中列舉。優(yōu)選的表面活性劑為聚氧化乙烯表面活性劑。更優(yōu)選的表面活性劑包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。
表1

還適當(dāng)?shù)氖窃诿绹?guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0139550(Savu等人)和2003/0139549(Savu等人)中公開(kāi)的類(lèi)型的氟化非離子型表面活性劑。其它非離子型氟化表面活性劑包括購(gòu)自DuPont(Wilmington，DE)的商業(yè)名稱(chēng)ZONYL下的那些。
兩性離子表面活性劑。已知多種適當(dāng)?shù)膬尚噪x子表面活性劑，其可用作裂解試劑、洗脫劑、和/或作為任選的固相材料上的涂層。它們包括例如烷基酰胺甜菜堿及其胺氧化物、烷基甜菜堿及其胺氧化物、磺基甜菜堿、羥基磺基甜菜堿、兩性甘氨酸酯、兩性丙酸酯、平衡的兩性多羧基甘氨酸酯、和烷基多氨基甘氨酸酯。蛋白質(zhì)根據(jù)pH具有帶電或不帶電的能力，因此在合適的pH，優(yōu)選pI為約8-9的蛋白質(zhì)，如改性的牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶原，可以作為兩性離子表面活性劑。兩性離子表面活性劑的具體例子為得自Sigma的商業(yè)名稱(chēng)CHAPS下的膽酰胺基丙基二甲基丙磺酸銨。更優(yōu)選的表面活性劑包括N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙烷磺酸鹽。
陽(yáng)離子表面活性劑。已知多種適當(dāng)?shù)年?yáng)離子表面活性劑，其可用作裂解試劑、洗脫劑、和/或作為任選的固相材料上的涂層。它們包括例如季銨鹽、聚氧化乙烯烷基胺、和烷基胺氧化物。通常，適當(dāng)?shù)募句@鹽包括至少一個(gè)分子量較高的基團(tuán)和兩個(gè)或三個(gè)分子量較低的基團(tuán)，它們連接于共用氮原子以產(chǎn)生陽(yáng)離子，并且其中平衡電子的陰離子選自鹵化物(溴化物、氯化物等)、乙酸根、亞硝酸根、和低級(jí)烷基磺酸根(甲磺酸根等)。氮上的分子量較高的取代基經(jīng)常為包含約10到約20個(gè)碳原子的高級(jí)烷基，較低分子量的取代基可為具有1到約4個(gè)碳原子的烷基如甲基或乙基的低級(jí)烷基，其在有些情況下可被取代，如被羥基取代。一個(gè)或多個(gè)取代基可以包括芳基部分或可被芳基取代，如芐基或苯基?？赡艿木哂休^低分子量的取代基也可包括約1到約4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基，如甲基和乙基；帶有一個(gè)羥基端基的被取代的低級(jí)聚烷氧基部分，如聚氧化乙烯部分，并具有以下通式R(CH2CH2O)(n-1)CH2CH2OH其中R為結(jié)合于氮上的(C1-C4)二價(jià)烷基，n表示約1到約15的整數(shù)?；蛘咭粋€(gè)或兩個(gè)這種具有末端羥基的低級(jí)聚烷氧基可直接結(jié)合于四價(jià)氮，而不是通過(guò)前述低級(jí)烷基結(jié)合于氮。用于本發(fā)明的有用的鹵化季銨表面活性劑的例子包括但不限于得自Akzo Chemical Inc.的甲基-雙(2-羥乙基)椰油基氯化銨或油烯基氯化銨(分別為ETHOQUAD C/12和O/12)和甲基聚氧化乙烯(15)十八烷基氯化銨(ETHOQUAD 18/25)。
陰離子表面活性劑。已知多種適當(dāng)?shù)年庪x子表面活性劑，其可用作裂解試劑、洗脫劑、和/或作為任選的固相材料上的涂層?？墒褂玫年庪x子型表面活性劑包括磺酸鹽和硫酸鹽，如烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、烷基磺酸鹽、烷基醚磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基苯醚硫酸鹽、烷基磺基乙酸鹽、仲烷基磺酸鹽、仲烷基硫酸鹽等。這些中有許多可以包括聚烷氧基化基團(tuán)(如，環(huán)氧乙烷基團(tuán)和/或環(huán)氧丙烷基團(tuán)，其可為無(wú)規(guī)、有序或嵌段的布置)和/或陽(yáng)離子的平衡離子如Na、K、Li、銨、質(zhì)子化叔胺如三乙醇胺、或季銨基團(tuán)。其例子包括烷基醚磺酸鹽，如購(gòu)自Stepan Company，Northfield，IL的商業(yè)名稱(chēng)POLYSTEP B12和B22下的十二烷基醚硫酸鹽，和購(gòu)自Nikko Chemicals Co.，Tokyo，Japan的商業(yè)名稱(chēng)NIKKOL CMT30下的甲基?；撬徕c；購(gòu)自Clariant Corp.，Charlotte，NC的商業(yè)名稱(chēng)HOSTAPUR SAS下的仲烷基磺酸鹽，其為(C14-C17)仲烷基磺酸鈉(α-烯烴磺酸鹽)；甲基-2-磺基烷基酯，如甲基-2-磺基(C12-C16)酯鈉和購(gòu)自Stepan Company的商業(yè)名稱(chēng)ALPHASTEPC-48下的2-磺基(C12-C16)脂肪酸二鈉；作為都購(gòu)自Stepan Co.的十二烷基磺基乙酸鈉(商業(yè)名稱(chēng)LANTHANOL LAL)和十二烷基磺基琥珀酸二鈉(商業(yè)名稱(chēng)STEPANMILD SL3)下的烷基磺基乙酸鹽和烷基磺基琥珀酸鹽；和烷基硫酸鹽，如購(gòu)自Stepan Co.的商業(yè)名稱(chēng)STEPANOL AM下的十二烷基硫酸銨。
另一類(lèi)有用的陰離子表面活性劑包括磷酸鹽，如烷基磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽、芳烷基磷酸鹽、和芳烷基醚磷酸鹽。這些中有許多可以包括聚烷氧基基團(tuán)(如，環(huán)氧乙烷基團(tuán)和/或環(huán)氧丙烷基團(tuán)，其可為無(wú)規(guī)、有序或嵌段的布置)。其例子包括單-、二-和三-(烷基甘油醚)-o-磷酸酯，通常是指購(gòu)自Clariant Corp.的商業(yè)名稱(chēng)HOSTAPHAT 340KL下的trilaureth-4-磷酸鹽；和購(gòu)自Croda Inc.，Parsipanny，NJ的商業(yè)名稱(chēng)CRODAPHOS SG下的PPG-5ceteth 10磷酸鹽；以及烷基和烷基酰胺基烷基二烷基胺氧化物。胺氧化物表面活性劑的例子包括商業(yè)名稱(chēng)AMMONYX LO、LMDO、和CO下的那些(都購(gòu)自Stepan Co.)，其為十二烷基酰胺基丙基二甲基胺氧化物、和十六烷基胺氧化物。
洗脫技術(shù)對(duì)于使用用于保持抑制劑的固相材料的實(shí)施方案，可以使用多種洗脫劑洗脫包括含核酸的物質(zhì)(如，細(xì)胞核)和/或釋放的核酸的樣品的更濃縮的區(qū)域。這種洗脫劑可以包括水(優(yōu)選不含核糖核酸酶的水)、緩沖液、表面活性劑(其可為陽(yáng)離子型、陰離子型、非離子型、或兩性離子型表面活性劑)、或強(qiáng)堿。
優(yōu)選地，洗脫劑為堿性的(即，pH大于7)。對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH為至少8。對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH為最高10。對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH為最高13。如果洗脫的核酸直接用于擴(kuò)增過(guò)程如PCR，則洗脫劑應(yīng)該配制為使得各組分的濃度不會(huì)抑制酶(如，Taq聚合酶)或者阻止擴(kuò)增反應(yīng)。
適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑睦影ㄉ鲜龅哪切?，具體地，為被稱(chēng)為SDS、TRITON X-100、TWEEN、氟化表面活性劑、和PLURONICS的那些。表面活性劑通常在水基溶液中被提供，雖然如果期望的話(huà)可使用有機(jī)溶劑(醇等)。優(yōu)選洗脫劑中表面活性劑的濃度基于洗脫劑的總重量最低為0.1重量/體積％(w/v％)。優(yōu)選洗脫劑中表面活性劑的濃度基于洗脫劑的總重量為不大于1w/v％?？梢匀芜x地將穩(wěn)定劑如聚乙二醇與表面活性劑一起使用。
適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液的例子包括TRIS-HCl、N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、3-[N-嗎啉代]丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N′-雙[2-乙磺酸](PIPES)、2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)、TRIS-EDTA(TE)緩沖液、檸檬酸鈉、乙酸銨、碳酸鹽、和碳酸氫鹽等。
優(yōu)選地，洗脫劑中洗脫緩沖液的濃度最低為10毫摩(mM)。優(yōu)選地，洗脫劑中表面活性劑的濃度不大于2重量％。
通常，優(yōu)選使用堿性溶液實(shí)現(xiàn)含核酸的物質(zhì)和/或釋放的核酸的洗脫。雖然不打算束縛于理論，但是認(rèn)為，與用水洗脫相比較，堿性溶液可改善抑制劑的結(jié)合。堿性溶液還促進(jìn)含核酸的物質(zhì)的裂解。優(yōu)選地，堿性溶液的pH為8到13，更優(yōu)選為13。高pH的來(lái)源的例子包括NaOH、KOH、LiOH、四價(jià)氮基氫氧化物、叔胺、仲胺、或伯胺等的水溶液。如果堿性溶液用于洗脫，通常將其在隨后的步驟中用例如TRIS緩沖液中和，以形成準(zhǔn)備好用于PCR的樣品。
堿性溶液的使用可以選擇性地破壞RNA，以允許對(duì)DNA進(jìn)行分析。否則，可以向制劑中加入核糖核酸酶以使RNA滅活，隨后將核糖核酸酶熱滅活。類(lèi)似地，可以加入脫氧核糖核酸酶用于選擇性地破壞DNA并且允許對(duì)RNA進(jìn)行分析；然而，可以將不破壞RNA的其它裂解緩沖液(如，TE)用于這種方法中。還可以向用于經(jīng)歷實(shí)時(shí)PCR的RNA制備的制劑中加入核糖核酸酶抑制劑如RNAsin。
洗脫通常在室溫下進(jìn)行，雖然較高的溫度可以產(chǎn)生較高的收率。例如，如果期望的話(huà)，洗脫劑的溫度可最高為95℃。洗脫通常在10分鐘內(nèi)進(jìn)行，雖然優(yōu)選1-3分鐘的洗脫時(shí)間。
裝置和試劑盒在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2002/0047003(2003年4月25日公開(kāi)的，Bedingham等人)中描述了多種微流體裝置的示例性實(shí)施方案。它們通常使用在其中布置有一體化的微流體通道網(wǎng)絡(luò)的主體結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的方面，微流體裝置的主體結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)或多個(gè)分隔層的集合體，所述兩個(gè)或多個(gè)分隔層在適當(dāng)?shù)嘏浜匣蚪Y(jié)合在一起時(shí)形成本發(fā)明的微流體裝置，如包含本文中所述的通道和/或室。通常，有用的微流體裝置包括頂部分、底部分、內(nèi)部部分，其中內(nèi)部部分基本上限定了裝置的通道和室。通常，室包括閥(如，閥隔片)并且稱(chēng)為有閥的室。
用于本文某些實(shí)施方案的特別優(yōu)選的裝置稱(chēng)為調(diào)節(jié)閥裝置，其在2003年12月12日提交的標(biāo)題為“Variable Valve Apparatus and Method”的申請(qǐng)人的受讓人的待決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/734,717中公開(kāi)。在這種調(diào)節(jié)閥裝置中，閥結(jié)構(gòu)允許除去位于處理室(即，有調(diào)節(jié)閥的處理室)內(nèi)的樣品材料的選定部分。選定部分的除去通過(guò)在預(yù)定位置在閥隔片中形成開(kāi)口而實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選閥隔片足夠大，以允許根據(jù)處理室中樣品材料的特征調(diào)節(jié)開(kāi)口的位置。如果在形成開(kāi)口之后旋轉(zhuǎn)樣品處理裝置，則更靠近旋轉(zhuǎn)軸的選定部分的材料通過(guò)開(kāi)口離開(kāi)處理室。樣品材料的其余部分不能通過(guò)開(kāi)口離開(kāi)，因?yàn)槠浔乳_(kāi)口距離旋轉(zhuǎn)軸更遠(yuǎn)。
可以根據(jù)在處理室內(nèi)檢測(cè)的樣品材料的一種或多種特征在一定的位置處在閥隔片中形成開(kāi)口。優(yōu)選處理室包括將光傳入和/或傳出的處理室的檢測(cè)窗。檢測(cè)的樣品材料的特征可以包括例如樣品材料的自由表面(表征處理室中樣品材料的容量)。在自由表面徑向向外的選定距離處在閥隔片中形成開(kāi)口，可以提供從處理室除去選定容量的樣品材料的能力。
在一些實(shí)施方案中，有可能通過(guò)在一個(gè)或多個(gè)閥隔片中的選定位置處形成開(kāi)口而除去選定的樣品材料等分樣品。選定的等分樣品容量可以根據(jù)開(kāi)口之間的徑向距離(相對(duì)于旋轉(zhuǎn)軸測(cè)量)和開(kāi)口之間的處理室的橫截面積測(cè)定。
優(yōu)選閥隔片中的開(kāi)口在沒(méi)有物理接觸的情況下形成，如，通過(guò)激光切除、聚焦光加熱等。結(jié)果，優(yōu)選形成開(kāi)口而不穿透樣品處理裝置的最外層，從而限制了樣品材料從樣品處理裝置滲漏的可能性。
在一個(gè)方面，本發(fā)明在樣品處理裝置(如，微流體裝置)中使用有閥處理室，有閥處理室包括具有處理室容積的處理室，處理室容積位于樣品處理裝置的相對(duì)的第一和第二主側(cè)面之間，其中處理室占據(jù)樣品處理裝置中的處理室區(qū)域，并且其中處理室區(qū)域具有長(zhǎng)度和與長(zhǎng)度垂直的寬度，并且另外其中長(zhǎng)度大于寬度。裝有調(diào)節(jié)閥的處理室還包括位于處理室區(qū)域內(nèi)的閥室，閥室位于處理室容積和樣品處理裝置的第二主側(cè)面之間，其中通過(guò)將閥室和處理室分隔的閥隔片使閥室與處理室隔離，并且其中處理室容積的一部分位于閥隔片和樣品處理裝置的第一主側(cè)面之間。檢測(cè)窗位于處理室區(qū)域內(nèi)，其中檢測(cè)窗能透過(guò)選定的電磁能，該選定的電磁能被引入和/和引出處理室容積。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供允許從裝有調(diào)節(jié)閥的處理室選擇性除去一部分樣品的方法。該方法包括提供如上所述的樣品處理裝置(如，微流體裝置)，在處理室中提供樣品材料；通過(guò)檢測(cè)窗檢測(cè)處理室中樣品材料的特征；在沿著處理室長(zhǎng)度的選定位置處在閥隔片中形成開(kāi)口，其中選定的位置與檢測(cè)的樣品材料特征相關(guān)。該方法還包括通過(guò)在閥隔片中形成的開(kāi)口只將一部分樣品材料從處理室轉(zhuǎn)移到閥室中。
本發(fā)明還提供試劑盒，其可以包括微流體裝置、裂解試劑(特別是表面活性劑，如非離子型表面活性劑，純的或在溶液中的形式)和用于使抑制劑與核酸分離的指導(dǎo)說(shuō)明。
本發(fā)明的試劑盒內(nèi)可以包括的其它組分包括常規(guī)試劑，如洗液、偶聯(lián)緩沖液、淬滅緩沖液、封閉緩沖液、洗脫緩沖液、等等。本發(fā)明的試劑盒內(nèi)可以包括的其它組件包括常規(guī)設(shè)備，如離心柱、筒芯、96孔濾板、針頭式過(guò)濾器、收集單元、注射器、等等。
試劑盒通常包括包裝材料，其是指用于容納試劑盒內(nèi)容物的一種或多種物理結(jié)構(gòu)。包裝材料可以通過(guò)公知方法構(gòu)造，優(yōu)選用于提供無(wú)菌的不含污染物的環(huán)境。包裝材料可具有用于顯示試劑盒內(nèi)容物的標(biāo)簽。另外，試劑盒包含用于指示如何使用試劑盒內(nèi)物質(zhì)的指導(dǎo)說(shuō)明。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“包裝”是指固體基質(zhì)或材料，如玻璃、塑料、紙、箔等。
“指導(dǎo)說(shuō)明”通常包括實(shí)際的表示，描述本發(fā)明的多種方法，包括裂解條件(如，裂解試劑的類(lèi)型和濃度)、要混合的試劑和樣品的相對(duì)量、試劑/樣品混合物的維持時(shí)間、溫度、緩沖條件、等等。
示例性方法1在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供包括含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞(所述含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同)的樣品；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成裂解樣品(其包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑)的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；任選地用水或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，任選地進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，任選地分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同，雖然它們通常是不同的。也就是說(shuō)，含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞有可能是相同的。例如，如果樣品為血沉棕黃層，則含核酸的物質(zhì)可為白細(xì)胞，其同時(shí)包括細(xì)胞核和抑制劑。如果使用的裂解試劑(如，非離子型表面活性劑)裂解白細(xì)胞的細(xì)胞膜而不是其內(nèi)所含的細(xì)胞核，則抑制劑和完整的細(xì)胞核一起被釋放，其也被認(rèn)為是本文定義的含核酸的物質(zhì)。
可以將非離子型表面活性劑如TRITON X-100均勻地預(yù)沉淀在混合室中，使得在樣品(如，血液)與表面活性劑混合幾分鐘時(shí)發(fā)生裂解。在其它情況下，可以在將樣品(如，血液)引入到混合室中之前將表面活性劑的稀溶液與樣品預(yù)混合。在混合之后，將溶液離心以分離例如細(xì)胞核。當(dāng)使用微流體裝置時(shí)，例如維持2分鐘的400rcf的離心速度通常為合乎需要的，盡管可使用更高的轉(zhuǎn)速和/和更長(zhǎng)的旋轉(zhuǎn)時(shí)間。
在其它情況下，當(dāng)不使用非離子型表面活性劑時(shí)，可使用水或氯化銨用于紅細(xì)胞的裂解。在混合室中進(jìn)行裂解之后，在相對(duì)低的速度下將白細(xì)胞離心沉降。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)包括啟動(dòng)閥以除去樣品頂部的95體積％。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，可以用水或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，用于將抑制劑如血紅素的濃度降低到低于2微摩爾。這可以通過(guò)用水或緩沖液通過(guò)順序的10倍稀釋和濃縮而實(shí)現(xiàn)。這種稀釋和濃縮(如，通過(guò)離心)過(guò)程可以重復(fù)幾次，直到獲得含核酸的物質(zhì)的所需純度水平。這種稀釋抑制劑濃度并同時(shí)保持含核酸的物質(zhì)的過(guò)程可以通過(guò)使用調(diào)節(jié)閥或分別啟動(dòng)的多個(gè)稀釋孔實(shí)現(xiàn)。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，在稀釋/濃縮過(guò)程之后，使用強(qiáng)堿如氫氧化鈉將潔凈的細(xì)胞核或WBC裂解，隨后加熱使蛋白質(zhì)變性，隨后用TRIS-HCl將堿中和。如果期望的話(huà)，可以在微流體裝置中，堿和中和物都可以預(yù)沉淀(和通常為干燥-沉降)。
在其它情況下，進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸包括使含核酸的物質(zhì)經(jīng)過(guò)加熱/冷卻過(guò)程，該過(guò)程可涉及凍融。可以根據(jù)需要使用一個(gè)或多個(gè)該裂解過(guò)程的循環(huán)。典型的加熱溫度和時(shí)間包括通常在最低55℃(更通常，95℃)，維持1分鐘到5分鐘，和典型的冷卻溫度包括室溫或其以下的溫度。裂解還可以使用蛋白酶K并且隨后加熱將蛋白酶K熱滅活。在這些情況中，可以將蛋白酶K預(yù)沉淀。
在一些實(shí)施方案中，在裂解之后，可以將樣品分配在幾個(gè)孔中用于進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，例如，檢查某種疾病的不同SNP。
如上所述，在某些情況中，為了節(jié)約微流體裝置上的空間，可以加入PCR增強(qiáng)劑、緩沖液、和/或替代性的酶如rTth聚合酶，使得即使在經(jīng)歷PCR的樣品中存在抑制劑時(shí)也可進(jìn)行擴(kuò)增。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，水為不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。
圖1中所示的裝置可用于進(jìn)行方法1的某些實(shí)施方案。參考圖1，適用于這些實(shí)施方案的微流體裝置的優(yōu)選實(shí)施方案包括加料室90；任選的混合室91；有閥處理室93、94、和95；稀釋試劑室92；廢料室97；和任選的擴(kuò)增反應(yīng)室96。通常，混合室可以具有預(yù)沉淀的表面活性劑，稀釋試劑室92包括用于稀釋的水或緩沖液，擴(kuò)增反應(yīng)室可用于裂解和擴(kuò)增。
示例性方法2在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供樣品，其包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和任選的細(xì)胞外抑制劑(所述含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同)；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑的裂解樣品的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥以將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；用水或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程，以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；進(jìn)一步使用強(qiáng)堿和加熱裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
如以上針對(duì)示例性方法1所述的，示例性方法2的實(shí)施方案的含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可相同或不同，雖然它們通常是不同的。也就是說(shuō)，含核酸的物質(zhì)和含抑制劑的細(xì)胞可能是相同的。
在這種方法的某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)包括啟動(dòng)閥以除去樣品頂部的95體積％。
圖1中所示的裝置可用于進(jìn)行方法2的某些實(shí)施方案。通常，擴(kuò)增反應(yīng)室96可以包括例如預(yù)沉淀(并且通常為干燥沉降)形式的裂解試劑(如，強(qiáng)堿)。
此外，如上所述，在某些情況中，為了節(jié)約微流體裝置上的空間，可以加入PCR增強(qiáng)劑、緩沖液、和/或替代性的酶如rTth聚合酶，使得即使在經(jīng)歷PCR的樣品中存在抑制劑時(shí)也可進(jìn)行擴(kuò)增。
另外的實(shí)施方案除了如本文中所述的使用濃縮/分離/任選的稀釋步驟降低抑制劑的量之外，可以任選地使用在＿＿＿提交的標(biāo)題為“METHODS FORNUCLEIC ACID ISOLATION AND KITS USING SOLID PHASEMATERIAL”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)＿＿＿(Attorney Docket No.59073US003)中公開(kāi)的固相材料除去抑制劑。
在某些實(shí)施方案中，將樣品置于微流體裝置的加料室中在使樣品接觸第一裂解試劑之前進(jìn)行?；蛘?，將樣品置于加料室中在使樣品接觸第一裂解試劑之后進(jìn)行。第一裂解試劑可為例如水或非離子型表面活性劑。
如果需要進(jìn)一步裂解以從含核酸的物質(zhì)(如，細(xì)胞核)釋放核酸，則可使用其它裂解條件。例如，這包括使含核酸的物質(zhì)在任選加熱下暴露于強(qiáng)堿下。強(qiáng)堿通常為NaOH，但是可以為其它，如KOH、LiOH、NH4OH，以及伯胺、仲胺、或叔胺。通常，溫度為室溫。如果使用堿，則包含釋放的核酸的樣品可能需要調(diào)節(jié)其pH，特別是如果核酸要進(jìn)行隨后的擴(kuò)增過(guò)程時(shí)。因此，本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)樣品的pH通常到至少7.5，并且通常不大于9。
在某些實(shí)施方案中，第一裂解試劑為非離子型表面活性劑。在這種方法的某些實(shí)施方案中，加料室包括第一裂解試劑(如，預(yù)沉淀(和通常是干燥沉降)的非離子型表面活性劑)和使樣品與第一裂解試劑接觸在將樣品置于加料室中時(shí)發(fā)生。
或者，可以將樣品轉(zhuǎn)移到隨后的其中具有第一裂解試劑(優(yōu)選為非離子型表面活性劑)的處理室中。例如，樣品與第一裂解試劑(優(yōu)選為非離子型表面活性劑)的接觸在混合室中在足夠混合下進(jìn)行，從而破壞細(xì)胞膜和釋放細(xì)胞核和抑制劑，形成裂解樣品。應(yīng)該理解，如果使用了“第一”裂解試劑，則該方法不必使用“第二”裂解試劑；相反地，術(shù)語(yǔ)“第一裂解試劑”在本文中使用是用于區(qū)別于如果使用的任何另外的裂解試劑。
如上所述，在緩沖液(特別是TRIS緩沖液)中加入蔗糖可有助于細(xì)胞核的分離。緩沖液也可包括鎂鹽和表面活性劑如TRITON X-100。這也可為白細(xì)胞的裂解提供良好介質(zhì)。另外，在某些情況下，當(dāng)需要收集細(xì)胞核時(shí)，特別是在微流體裝置內(nèi)，使用細(xì)胞核存儲(chǔ)緩沖液可能有用。細(xì)胞核存儲(chǔ)緩沖液可以在例如緩沖液(如，TRIS緩沖液)中包括蔗糖、鎂鹽、EDTA、二硫蘇糖醇、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、和/或甘油并且允許細(xì)胞核的穩(wěn)態(tài)存儲(chǔ)。
在某些實(shí)施方案中，在有閥處理室中形成樣品濃縮區(qū)包括對(duì)處理室中的樣品進(jìn)行離心。通常，從次濃縮的樣品分離濃縮區(qū)包括通過(guò)閥將樣品次濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到廢料箱中。
除上述的固相材料之外，可以將其它類(lèi)型的固相材料，特別是小珠，引入到本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案的微流體裝置中。例如，可以用適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)將小珠官能化，用于分離特定的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、核酸等。可以通過(guò)離心和隨后的分離從樣品分離小珠。小珠可以設(shè)計(jì)成具有用于分離的適當(dāng)?shù)拿芏群统叽?納米到微米)。例如，在病毒捕獲的情況中，可在從血清樣品中除去少量殘留的抑制劑之前或之后使用識(shí)別病毒的蛋白質(zhì)外殼的小珠捕獲和使病毒濃縮。
可以在病毒捕獲之后通過(guò)一系列的稀釋和離心步驟(和任選地使用＿＿＿提交的標(biāo)題為“METHODS FOR NUCLEIC ACID ISOLATIONAND KITS USING SOLID PHASE MATERIAL”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)＿＿＿(Attorney Docket No.59073US003)中公開(kāi)的固相材料)除去抑制劑。這種固相材料可用于本文中所述的多種方法和樣品。
可以通過(guò)裂解從分離的病毒粒子提取出核酸。因此，小珠可以提供在微流體裝置內(nèi)的特定區(qū)域中濃縮相關(guān)材料的方法，還允許從捕獲粒子洗滌不相關(guān)材料和洗脫相關(guān)材料。
這種小珠的例子包括但不限于交聯(lián)的聚苯乙烯小珠，其可得自Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)的商業(yè)名稱(chēng)CHELEX下，具有三(2-氨基乙基)胺、亞氨基二乙酸、次氮基三乙酸、聚胺和聚亞胺的交聯(lián)的瓊脂糖小珠；以及購(gòu)自Rohm and Haas(Philadelphia，PA)的商業(yè)名稱(chēng)DUOLITE C-467和DUOLITE GT73下的螯合離子交換樹(shù)脂；AMBERLITE IRC-748、DIAION CR11、DUOLITE C647。這些小珠還適合用作如上所述的固相材料。
小珠的其它例子包括購(gòu)自商業(yè)名稱(chēng)GENE FIZZ(Eurobio，F(xiàn)rance)、GENE RELEASER(Bioventures Inc.，Murfreesboro，TN)、和BUGS NBEADS(GenPoint，Oslo，Norway)下的那些，以及Zymo小珠(ZymoResearch，Orange，CA)和DYNAL小珠(Dynal，Oslo，Norway)。
其它材料也可用于病原體捕獲。例如，聚合物涂層也可在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中用于分離特定的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、核酸等。這些聚合物涂層可以被直接射流噴霧在例如微流體裝置的覆蓋膜上。
可以通過(guò)使抗體共價(jià)連接在小珠表面上而將病毒粒子捕獲在小珠上。抗體可以用于對(duì)抗病毒的外殼蛋白質(zhì)。例如，DYNAL小珠可用于共價(jià)連接抗體?；蛘撸铣删酆衔锶珀庪x子交換聚合物可用于濃縮病毒粒子。市售的樹(shù)脂如viraffinity(Biotech Support Group，East Brunswick，NJ)可用于涂布小珠或在微流體裝置內(nèi)的選定位置上用作聚合物涂層，以濃縮病毒粒子。BUGS N BEADS(GenPoint，Oslo，Norway)可用于例如細(xì)菌的提取。在這里，這些小珠可用于捕獲細(xì)菌如葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、大腸桿菌(E coli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、和Clamydia原生小體。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)樣品包括病毒粒子或其它病原體(如，細(xì)菌)時(shí)，微流體裝置可以包括病毒捕獲小珠或其它病原體捕獲材料形式的固相材料。在這種方法中，在濃縮步驟之前使樣品接觸病毒捕獲小珠。更具體地，在一種情況中，病毒捕獲小珠可只用于病毒或細(xì)菌的濃縮，例如隨后將小珠分離到另一個(gè)室中，并以病毒或細(xì)菌的裂解結(jié)束。在另一種情況中，小珠可用于病毒或細(xì)菌的濃縮，隨后在相同的小珠上裂解和捕獲核酸，將小珠稀釋?zhuān)瑢⑿≈闈饪s，分離小珠，并且在洗脫捕獲的核酸之前重復(fù)該過(guò)程多次。
或者，如果小珠(或其它病毒捕獲材料)不是選擇用于病毒捕獲(或其它病原體捕獲)的方法，則可以選擇使用超離心機(jī)從血清或血漿離心出(即，濃縮)病毒粒子。如果需要分離病毒RNA并且隨后用于擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)，這些濃縮的病毒粒子可以被轉(zhuǎn)移到微流體裝置中用于裂解(如，通過(guò)在加入核糖核酸酶抑制劑的情況下用例如表面活性劑裂解)。
如果期望，小珠可直接用于PCR反應(yīng)室中?；蛘?，如果使用小珠，可使用洗脫劑。這種洗脫劑可以包括無(wú)菌水(優(yōu)選不含核糖核酸酶的無(wú)菌水)、緩沖液、表面活性劑(其可為陽(yáng)離子型、陰離子型、非離子型、或兩性離子型表面活性劑)、或強(qiáng)堿。
優(yōu)選地，洗脫劑為堿性的(即，pH大于7)。)對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH為至少8。對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH最高為10。對(duì)于某些實(shí)施方案，洗脫劑的pH最高為13。如果洗脫的核酸直接用于擴(kuò)增過(guò)程如PCR，洗脫劑應(yīng)該配制為使得組分的濃度不會(huì)抑制酶(如，Taq聚合酶)或者阻止擴(kuò)增反應(yīng)。
適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┑睦影ㄉ鲜龅哪切?，具體地，是被稱(chēng)為SDS、TRITON X-100、TWEEN、氟化表面活性劑、和PLURONICS的那些。表面活性劑通常在含水溶液中被提供，雖然如果期望的話(huà)可使用有機(jī)溶劑(醇等)。優(yōu)選洗脫劑中表面活性劑的濃度基于洗脫劑的總重量為至少0.1重量/體積％(w/v％)。優(yōu)選洗脫劑中表面活性劑的濃度基于洗脫劑的總重量最低為不大于1w/v％?？梢匀芜x地將穩(wěn)定劑如聚乙二醇與表面活性劑一起使用。
適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液的例子包括TRIS-HCl、N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、3-[N-嗎啉代]丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N′-雙[2-乙磺酸](PIPES)、2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)、TRIS-EDTA(TE)緩沖液、檸檬酸鈉、乙酸銨、碳酸鹽、和碳酸氫鹽等。
優(yōu)選地，洗脫劑中洗脫緩沖液的濃度為至少10毫摩(mM)。優(yōu)選地，洗脫劑中表面活性劑的濃度不大于2重量％。
通常，優(yōu)選使用堿性溶液實(shí)現(xiàn)含核酸的物質(zhì)和/或釋放的核酸的洗脫。雖然不打算束縛于理論，但是認(rèn)為，與用水洗脫相比較，堿性溶液可改善抑制劑的結(jié)合。堿性溶液還促進(jìn)含核酸的物質(zhì)的裂解。優(yōu)選地，堿性溶液的pH為8到13，更優(yōu)選為13。高pH的來(lái)源的例子包括NaOH、KOH、LiOH、四價(jià)氮基氫氧化物、叔胺、仲胺、或伯胺等的水溶液。如果堿性溶液用于洗脫，通常將其在隨后的步驟中用例如TRIS緩沖液中和，以形成準(zhǔn)備好用于PCR的樣品。
堿性溶液的使用可以選擇性地破壞RNA，以允許分析DNA。否則，可以向制劑中加入核糖核酸酶以使RNA滅活，隨后將核糖核酸酶熱滅活。類(lèi)似地，可以加入脫氧核糖核酸酶用于選擇性地破壞DNA并且允許分析RNA；然而，可以將不破壞RNA的其它裂解緩沖液(如，TE)用于這種方法中。還可以向用于經(jīng)歷實(shí)時(shí)PCR的RNA制備的制劑中加入核糖核酸酶抑制劑如RNAsin。
洗脫通常在室溫下進(jìn)行，雖然較高的溫度可以產(chǎn)生較高的收率。例如，如果期望的話(huà)，洗脫劑的溫度可最高為95℃。洗脫通常在10分鐘內(nèi)進(jìn)行，雖然優(yōu)選1-3分鐘的洗脫時(shí)間。
如果核酸的下游應(yīng)用是使其經(jīng)歷擴(kuò)增過(guò)程如PCR，則優(yōu)選用于該方法的所有試劑都與這種過(guò)程相容(如，PCR相容的)。另外，PCR促進(jìn)劑(facilitators)的加入可能有用，特別是用于診斷目的。此外，在擴(kuò)增之前將要擴(kuò)增的材料加熱可能是有利的。
在其中沒(méi)有完全除去抑制劑的實(shí)施方案中，可以加入緩沖液、酶、和PCR促進(jìn)劑，它們幫助在抑制劑存在下的擴(kuò)增過(guò)程。例如，可以使用對(duì)抑制劑更具耐受性的不同于Taq聚合酶的酶，如rTth，從而為PCR擴(kuò)增提供巨大的益處?？杉尤肱Ｑ灏椎鞍住⑻鸩藟A、蛋白酶抑制因子、牛運(yùn)鐵蛋白等，已知它們可以進(jìn)一步有助于擴(kuò)增過(guò)程?；蛘?，可以使用市售的產(chǎn)品如Novagen′s Blood Direct PCR Buffer試劑盒(EMDBiosciences，Darmstadt，Germany)，用于從全血直接擴(kuò)增而無(wú)需大規(guī)模的純化。
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)，但是不應(yīng)將在這些實(shí)施例中敘述的具體材料及其量、以及其它條件和細(xì)節(jié)理解為過(guò)度地限定本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1不使用螯合固相材料從全血分離基因組DNA的方法將一(1)μL的純的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。溶液在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘，間歇地將溶液渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約10分鐘。分離并棄去上清液，留下離心管底部的約二(2)μL濃縮物質(zhì)。將這種濃縮物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中。加入十(10)μL的0.1M NaOH，混合并在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘。取出2μL的等分樣品并將其加入到10μL的40mM TRIS-HCl(pH7.4)中。
實(shí)施例2A抑制劑/DNA對(duì)PCR的影響在固定的DNA濃度下改變抑制劑濃度在摻加純的人基因組DNA之前制得抑制劑的系列稀釋物，以便研究抑制劑對(duì)PCR的影響。向10μL的15納克/微升(ng/μL)人基因組DNA中加入1μL的不同的Mix I(純的或其稀釋物)(樣品2-沒(méi)有加入抑制劑，2D-純的，2E-1∶10、2F-1∶30、2G-1∶100、2H-1∶300)并渦旋。取得每個(gè)樣品的二(2)μL等分樣品用于20μL的PCR。結(jié)果如表2中所示。
Mix I向一百(100)μL的全血中加入1μL的純的TRITON X-100。將溶液在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘，將溶液間歇地渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約10分鐘。從微量離心管的頂部取得約80μL并指定為Mix I。
實(shí)施例2B抑制劑/DNA對(duì)PCR的影響在固定的抑制劑濃度下改變DNA濃度向10μL的人基因組DNA中加入1μL的1∶3稀釋的Mix I(如上所述的)。研究的DNA濃度如下樣品2J-15ng/μL、2K-7.5ng/μL、2L-3.75ng/μL、2M-1.5ng/μL。從每個(gè)樣品取得二(2)μL的等分樣品用于20μL的PCR。結(jié)果如表2中所示。
實(shí)施例2C抑制劑/DNA對(duì)PCR的影響未加入抑制劑的DNA向每個(gè)DNA樣品中加入1μL的水代替抑制劑制備以下樣品樣品2N-15ng/μL、2P-7.5ng/μL、2Q-3.75ng/μL、2R-1.5ng/μL。從每個(gè)樣品取得二(2)μL的等分樣品用于20μL的PCR。結(jié)果如表2中所示。
表2

實(shí)施例3從全血分離基因組DNA的方法使用加熱將一(1)μL的純的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。溶液在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘，間歇地將溶液渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約10分鐘。分離并棄去上清液，留下離心管底部的約二(2)μL濃縮物質(zhì)。將這種濃縮物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中。加入十(10)μL的0.1M NaOH，混合并在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘。將溶液在95℃加熱3分鐘。取出2μL的等分樣品并加入到10μL的40mM TRIS-HCl(pH7.4)中。
實(shí)施例4使用不含核糖核酸酶的水稀釋物從全血分離基因組DNA的方法將二(2)μL的純的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。溶液在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘，間歇地將溶液渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。分離并棄去上清液，留下離心管底部的約五(5)μL濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。分離頂部的95μL溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL濃縮物質(zhì)。向最后的5μl濃縮物質(zhì)中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入一(1)μL的0.5M NaOH。在培養(yǎng)1分鐘之后，將樣品在95℃加熱3分鐘。將1M TRIS-HCl(pH7.4)的1.5μL等分樣品加入到6μL的樣品中。
實(shí)施例5使用不含核糖核酸酶的水稀釋物從全血分離基因組DNA的方法在微流體裝置的分離室中進(jìn)行樣品分離將二(2)μL的純的TRITON X-100加入到一百(100)μL的全血中。溶液在室溫(約21℃)下培養(yǎng)約5分鐘，間歇地將溶液渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液置于如申請(qǐng)人的受讓人在2003年12月12日提交的待決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/734,682中所述的微流體裝置(圖1)的分離室中并在4000rpm下離心4分鐘。從頂部取出溶液的95μL等分樣品并將其棄去。將包含濃縮物質(zhì)的最后五(5)μL轉(zhuǎn)移到另一個(gè)潔凈的分離室中。向該5μL中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將溶液在移液管末端上下混合2-3次。將樣品在4000離心4分鐘。從頂部取出溶液的95μL等分樣品并將其棄去。將包含濃縮物質(zhì)的最后五(5)μL轉(zhuǎn)移到另一個(gè)潔凈的分離室中。向該5μL中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將溶液在移液管末端上下混合2-3次。將樣品在4000離心4分鐘。從頂部取出溶液的95μL等分樣品并將其棄去。將包含濃縮物質(zhì)的最后五(5)μL轉(zhuǎn)移到潔凈的微量離心管中。向5μL的濃縮物質(zhì)中加入1μL的0.5M NaOH。在培養(yǎng)1分鐘之后，將樣品在95℃加熱3分鐘。將1M TRIS-HCl(pH7.4)的1.5μL等分樣品加入到6μL樣品中。
實(shí)施例6使用不含核糖核酸酶的水稀釋物從全血分離基因組DNA的方法在微流體裝置的分離室中與TRITON X-100混合將十(10)μL的10％TRITON X-100溶液在申請(qǐng)人的受讓人在2003年12月12日提交的待決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)10/734,682中所述的微流體裝置(圖1)的混合室的覆蓋膜上干燥過(guò)夜。向混合室中加入一百(100)μL的全血。將溶液混合約5分鐘。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液轉(zhuǎn)移到潔凈的微量離心管中并在Eppendorf Model5415D離心機(jī)中在400rcf下離心約2分鐘。從頂部分離九十五(95)μL的溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL的濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。從頂部分離九十五(95)μL的溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL的濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入95μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。從頂部分離九十五(95)μL的溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL的濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入一(1)μL的0.5MNaOH。在培養(yǎng)1分鐘之后，將樣品在95℃加熱3分鐘。將1MTRIS-HCl(pH7.4)的1.5μL等分樣品加入到6μL樣品中。
實(shí)施例7從全血分離基因組DNA的方法將五(5)μL的全血加入到十(10)μL的10mM NaOH中。在培養(yǎng)1分鐘之后，將樣品在95℃加熱3分鐘。將16mM TRIS-HCl(pH7.4)的5μL等分樣品加入到10μL的樣品中。
實(shí)施例8使用不含核糖核酸酶的水稀釋物從全血分離基因組DNA的方法將一百(100)μL的1％IGEPAL CA-630(Sigma，St.Louis)加入到一百(100)μL的全血中。間歇地將溶液渦流(每20秒進(jìn)行約5秒)。觀察溶液以確信在進(jìn)行下一步之前其是透明的。將溶液在Eppendorf Model5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。從頂部分離195μL的溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL的濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入45μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在Eppendorf Model 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。從頂部分離45μL的溶液并將其棄去，留下離心管底部的約五(5)μL的濃縮物質(zhì)。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入45μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。將樣品混合直到顏色變得均勻。將溶液在EppendorfModel 5415D離心機(jī)中在400rcf離心約2分鐘。向最后的5μL濃縮物質(zhì)中加入一(1)μL的0.5M NaOH。在培養(yǎng)1分鐘之后，將樣品在95℃加熱3分鐘。將1M TRIS-HCl(pH7.4)的1.5μL等分樣品加入到6μL樣品中。向樣品加入水的42.5μL等分樣品。
結(jié)果表3報(bào)告了根據(jù)QuantiTech SYBR Green PCR Handbook第10-12頁(yè)中關(guān)于制備10μL PCR樣品(在10μL SYBR Green Master Mix中的2μL樣品、4μL的β-肌動(dòng)蛋白、4μL的水)的指導(dǎo)，在ABI 7700 QPCRMachine(Applera，F(xiàn)oster City，CA)上得到的實(shí)施例1-3的結(jié)果；實(shí)施例4-7的結(jié)果根據(jù)關(guān)于制備10μL PCR樣品(在5.5μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水中的2.5μL樣品、1μL的10x Factor V Leiden Reaction Mix、和1μL的10x Factor V Leiden Mutation Detection Mix)的LightCycler FactorV Leiden Mutation試劑盒的包裝說(shuō)明書(shū)第2-3頁(yè)在LightCycler2.0(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)上得到；實(shí)施例8的結(jié)果根據(jù)關(guān)于制備10μL PCR樣品(在5.8μL的不含核糖核酸酶的無(wú)菌水中的1μL樣品、和1μL的得自L(fǎng)ightCycler Control DNA Kit的β-Globin PrimerMix、和在1.2μL的MgCl2和1μL的得自L(fǎng)ightCycler DNA Master SYBRGreen I Kit的10x LightCycler DNA Master SYBR Green I中)的LightCycler Control DNA試劑盒包裝說(shuō)明書(shū)第8-10頁(yè)的指導(dǎo)在LightCycler 2.0(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)上得到。在Horizonl1-14 Electrophoresis Machine(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)上運(yùn)行1％的瓊脂糖凝膠(譜帶亮度—+模糊、+++亮)。在405nm下在SpectraMax Plus384分光光度計(jì)上(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA.)進(jìn)行光譜測(cè)量。每個(gè)樣品的二個(gè)、三個(gè)、或四個(gè)數(shù)值表示一式兩份、一式三份的、或一式四份。
表3

*實(shí)施例7和8的陽(yáng)性對(duì)照是根據(jù)QIAamp DNA Blood Mini KitHandbook p.27中所述的“Blood and Body Fluid Spin Protocol”從二百(200)μL全血中提取的DNA，在200μL水中洗脫，并且具有20-21的Ct值。在這些實(shí)驗(yàn)中對(duì)陰性對(duì)照(NTC或無(wú)模板對(duì)照)沒(méi)有進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明的多種改變和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，而不脫離本發(fā)明的范圍。應(yīng)該理解，本發(fā)明不受本文提出的示例性實(shí)施方案和實(shí)施例的過(guò)度限制，并且這種實(shí)施例和實(shí)施方案只是作為例子存在，本發(fā)明的范圍僅由如下本文中提出的權(quán)利要求限制。
權(quán)利要求
1.從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供包括核酸和抑制劑的樣品；將樣品置于加料室中；將樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成樣品濃縮區(qū)，其中樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使樣品濃縮區(qū)與樣品次濃縮區(qū)分離，從而從樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；任選地用水或緩沖液稀釋分離的樣品濃縮區(qū)，任選地進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，任選地分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增過(guò)程的濃度；任選地在任選加熱的條件下裂解如果存在的含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
2.權(quán)利要求1的方法，其中微流體裝置包括固相材料。
3.權(quán)利要求2的方法，其中固相材料包括病原體捕獲材料并且樣品包括一種或多種病原體。
4.權(quán)利要求3方法，其中形成樣品濃縮區(qū)包括使樣品接觸病原體捕獲材料。
5.權(quán)利要求1方法，其中樣品包括血清或血漿和一種或多種病原體；該方法另外包括在將樣品置于加料室中之前濃縮一種或多種病原體；和將樣品置于加料室中包括將經(jīng)過(guò)濃縮的一種或多種病原體置于加料室中。
6.從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供樣品，該樣品包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和任選的細(xì)胞外抑制劑；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑的裂解樣品的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；用水或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和任選地重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和任選地調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
7.權(quán)利要求6的方法，其中進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸包括使含核酸的物質(zhì)經(jīng)歷加熱/冷卻過(guò)程。
8.權(quán)利要求6的方法，其中進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸包括使含核酸的物質(zhì)經(jīng)歷強(qiáng)堿和任選的加熱。
9.權(quán)利要求8的方法，其另外包括調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH到7.5到9的范圍。
10.權(quán)利要求7的方法，其包括用水稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)以降低血紅素的濃度到低于2微摩爾。
11.權(quán)利要求7的方法，其中水為不含核糖核酸酶的無(wú)菌水。
12.權(quán)利要求7的方法，其中啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)包括啟動(dòng)閥以除去樣品頂部的95體積％。
13.權(quán)利要求7的方法，其中含核酸的物質(zhì)包括細(xì)胞核。
14.權(quán)利要求7的方法，其另外包括將包括釋放的核酸的樣品轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增反應(yīng)室。
15.權(quán)利要求14的方法，其另外包括對(duì)釋放的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
16.權(quán)利要求7的方法，其中將樣品置于加料室中發(fā)生在樣品接觸第一裂解試劑之前。
17.權(quán)利要求7的方法，其中加料室包括第一裂解試劑并且樣品接觸第一裂解試劑發(fā)生在將生物樣品置于加料室中時(shí)。
18.權(quán)利要求7的方法，其中將樣品置于加料室中發(fā)生在樣品接觸第一裂解試劑之后。
19.權(quán)利要求7的方法，其中在有閥處理室中形成樣品濃縮區(qū)包括對(duì)處理室中的樣品進(jìn)行離心。
20.權(quán)利要求7的方法，其中第一裂解試劑為非離子型表面活性劑。
21.權(quán)利要求6的方法，其中樣品包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和細(xì)胞外抑制劑。
22.從樣品分離核酸的方法，該方法包括提供包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；提供樣品，該樣品包括含核酸的物質(zhì)、含抑制劑的細(xì)胞、和任選的細(xì)胞外抑制劑；將樣品置于加料室中；使樣品在有效破壞細(xì)胞膜并釋放抑制劑以及形成包括含核酸的物質(zhì)和抑制劑的裂解樣品的條件下接觸第一裂解試劑；將裂解樣品轉(zhuǎn)移到有閥處理室；在有閥處理室中形成裂解樣品濃縮區(qū)，其中裂解樣品濃縮區(qū)包括大部分含核酸的物質(zhì)，次濃縮區(qū)包括至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)并且基本上使裂解樣品濃縮區(qū)與裂解樣品次濃縮區(qū)分離，從而從裂解樣品除去至少一部分抑制劑；啟動(dòng)有閥處理室中的第二閥將分離的裂解樣品濃縮區(qū)轉(zhuǎn)移到混合室；用水或緩沖液稀釋分離的裂解樣品濃縮區(qū)，進(jìn)一步濃縮經(jīng)過(guò)稀釋的區(qū)域以增加核酸物質(zhì)的濃度，分離經(jīng)過(guò)進(jìn)一步濃縮的區(qū)域，和重復(fù)該稀釋和隨后濃縮及分離的過(guò)程以將抑制劑的濃度減少到不會(huì)妨礙擴(kuò)增方法的濃度；使用強(qiáng)堿和加熱進(jìn)一步裂解含核酸的物質(zhì)以釋放核酸；和調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH。
23.權(quán)利要求22的方法，其另外包括調(diào)節(jié)包括釋放的核酸的樣品的pH到7.5到9的范圍。
24.權(quán)利要求22的方法，其中啟動(dòng)有閥處理室中的第一閥以除去至少一部分樣品次濃縮區(qū)包括啟動(dòng)閥以除去樣品頂部的95體積％。
25.權(quán)利要求22的方法，其中含核酸的物質(zhì)包括細(xì)胞核。
26.權(quán)利要求22的方法，其另外包括將包括釋放的核酸的樣品轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增反應(yīng)室。
27.權(quán)利要求26的方法，其另外包括對(duì)釋放的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
28.權(quán)利要求22的方法，其中將樣品置于加料室中發(fā)生在樣品接觸第一裂解試劑之前。
29.權(quán)利要求22的方法，其中加料室包括第一裂解試劑并且樣品接觸第一裂解試劑發(fā)生在將生物樣品置于加料室中時(shí)。
30.權(quán)利要求22的方法，其中將樣品置于加料室中發(fā)生在樣品接觸第一裂解試劑之后。
31.權(quán)利要求22的方法，其中在有閥處理室中形成樣品濃縮區(qū)包括對(duì)處理室中的樣品進(jìn)行離心。
32.權(quán)利要求22的方法，其中第一裂解試劑為非離子型表面活性劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中將樣品置于加料室中發(fā)生在樣品接觸第一裂解試劑之前。
34.權(quán)利要求33的方法，其中含核酸的物質(zhì)包括細(xì)胞核。
35.權(quán)利要求22的方法，其另外包括用水或緩沖液形成分離的裂解樣品濃縮區(qū)的10倍稀釋物。
36.用于從樣品分離核酸的試劑盒，該試劑盒包括第一裂解試劑；包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；指導(dǎo)說(shuō)明，用于根據(jù)權(quán)利要求6的方法將樣品裂解和使至少一部分含核酸的物質(zhì)和/或核酸與至少一部分抑制劑分離。
37.用于從樣品分離核酸的試劑盒，該試劑盒包括第一裂解試劑；包括加料室、有閥處理室和混合室的微流體裝置；指導(dǎo)說(shuō)明，用于根據(jù)權(quán)利要求22的方法將樣品裂解和使至少一部分含核酸的物質(zhì)和/或核酸與至少一部分抑制劑分離。
全文摘要
本發(fā)明提供使用微流體裝置和濃縮步驟從樣品，優(yōu)選從生物樣品，分離核酸的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1922317SQ200480041696
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者拉尼亞寧·V·帕塔薩拉蒂, 卡蒂亞·K·艾利科松, 威廉姆·拜丁漢姆 申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司