專利名稱：含有與色氨酸的生物合成有關(guān)的突變基因的大腸桿菌突變體和用所述突變體生產(chǎn)色氨酸 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有一個(gè)或多個(gè)與色氨酸的生物合成有關(guān)的突變基因的產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌(E.coli)突變株CJ285(KCCM-10534)和用所述突變株生產(chǎn)色氨酸的方法。更具體地，用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(下文將其稱為NTG)進(jìn)行反復(fù)處理，而得知了源自產(chǎn)色氨酸的突變基因CJ285的多種基因的堿基序列和氨基酸序列，如用于編碼抗色氨酸異羥肟酸(下文將其稱為THX，色氨酸類似物)的DAHP合酶的同功酶的aroF和aroG，用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR，以及用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG和aroP操縱子的tyrR蛋白。然后在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中對(duì)含有一個(gè)或多個(gè)上述基因的突變株進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)L-色氨酸。
背景技術(shù)：
色氨酸是必需氨基酸之一，并已經(jīng)被廣泛用于各種領(lǐng)域，包括飼料添加劑，諸如安眠藥或鎮(zhèn)靜劑或林格氏溶液等醫(yī)藥物質(zhì)，以及健康食品物質(zhì)。色氨酸的典型生產(chǎn)方法是化學(xué)合成、酶反應(yīng)和用微生物進(jìn)行發(fā)酵。在化學(xué)合成的情況中，在高溫和高壓的空間中進(jìn)行生產(chǎn)，而且由于D-色氨酸和L-色氨酸一起產(chǎn)生，因此為獲得所需的色氨酸需要另外的精制過(guò)程。在酶反應(yīng)(如Matsui Doatsui的日本專利(韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)90-005773)的情況中，用作反應(yīng)底物的吲哚和絲氨酸非常貴，而且酶本身也不安全。
另一方面，采用微生物的發(fā)酵涉及各種微生物，如大腸桿菌和棒狀桿菌(Corynebacterium)的營(yíng)養(yǎng)缺陷株和調(diào)節(jié)突變株。在二十世紀(jì)80年代迅速發(fā)展的基因重組技術(shù)提供了很多有關(guān)新陳代謝及其控制機(jī)制的信息。許多研究人員通過(guò)基因操作，非常成功地開(kāi)發(fā)出了優(yōu)異的重組株并提高了生產(chǎn)力(Matsui等，1988)。同時(shí)，在韓國(guó)，很多與通過(guò)使用色氨酸抗性或營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株(韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)87-1813、90-8251和92-7405)或重組株(韓國(guó)專利公開(kāi)號(hào)90-5772和91-5627)的直接發(fā)酵有關(guān)的色氨酸生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)公開(kāi)。這些色氨酸類似物抗性株主要是為了在色氨酸生物合成過(guò)程中克服酶的反饋抑制，而且重組株也用來(lái)克隆色氨酸生物合成過(guò)程中的酶。事實(shí)上，該研究已經(jīng)獲得了巨大的成功。例如，使用大腸桿菌的人工突變體的傳統(tǒng)L-色氨酸生產(chǎn)的最大特征是使用廉價(jià)的培養(yǎng)底物來(lái)生產(chǎn)L-色氨酸。然而，生產(chǎn)力或色氨酸的產(chǎn)量極低。因此，為了通過(guò)基因重組使色氨酸的產(chǎn)量最大，有必要確保作為親本菌株的人工突變體優(yōu)良以及獲得其調(diào)節(jié)已經(jīng)解除的基因。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述問(wèn)題而創(chuàng)造了本發(fā)明，本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定突變基因的堿基序列和氨基酸序列，所述突變基因用于編碼aroF和aroG和用于調(diào)節(jié)與色氨酸合成有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄的trpR和tyrR，所述aroF和aroG是用于3-脫氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxyarabionohep-tulosonate7-phosphate，下文將其稱為DAHP)合成的酶，所述DAHP是源自大腸桿菌突變株CJ285的色氨酸的合成過(guò)程中的芳香族氨基酸的第一個(gè)前體，該DAHP是由磷酸烯醇丙酮酸和赤蘚糖4-磷酸(Erythorse 4-phosphate)制得的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述一個(gè)或多個(gè)突變基因的生產(chǎn)L-色氨酸的大腸桿菌突變株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)將所述突變株直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中來(lái)生產(chǎn)高濃度和高產(chǎn)量的L-色氨酸的方法。


根據(jù)以下詳述內(nèi)容并結(jié)合附圖，將可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其它的目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示了一個(gè)突變基因，其中aroF基因的內(nèi)部序列中的CCT被突變?yōu)閇TCT]，結(jié)果導(dǎo)致第280位氨基酸即脯氨酸變?yōu)榻z氨酸；
圖2顯示一個(gè)突變基因，其中aroG基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的T堿基被突變?yōu)閇C]堿基，該基因的內(nèi)部序列中的GTG被突變?yōu)閇GCG]，TGC被突變?yōu)閇CGC]，結(jié)果分別導(dǎo)致第57位氨基酸即纈氨酸變?yōu)楸彼?，和?1位氨基酸即半胱氨酸變?yōu)榫彼?；圖3顯示一個(gè)突變基因，其中trpR基因的內(nèi)部序列中第704位的G堿基被刪掉了，結(jié)果導(dǎo)致蛋白翻譯過(guò)程中的框架發(fā)生變化，并且相對(duì)于野生型基因[cgattgattttgtaggcctgataagacgtggcgcatcaggcatcgtgcaccgaatgccggatgcggcgtga]，其增加了23個(gè)氨基酸；和圖4顯示一個(gè)突變基因，其中tyrR基因的內(nèi)部序列中的GGC被突變?yōu)閇GAC]，而CTG被突變?yōu)閇CTA]，結(jié)果導(dǎo)致第25位氨基酸即甘氨酸變?yōu)樘於彼?，并且使?6位氨基酸即亮氨酸變?yōu)闊o(wú)義突變。
具體實(shí)施例方式
技術(shù)問(wèn)題根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述和其它的目的可以通過(guò)提供含有與色氨酸生物合成有關(guān)的突變基因的大腸桿菌突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中用NTG對(duì)大腸桿菌CJ181(KFCC 10902，產(chǎn)生色氨酸的親本菌株)進(jìn)行反復(fù)處理，以在其中引起突變，并且使突變體(CJ285)具有色氨酸類似物THX抗性，由此使突變株相對(duì)于親本菌株，其色氨酸產(chǎn)量得到顯著提高。同時(shí)，為了分析DNA堿基序列和氨基酸序列，克隆了編碼以下物質(zhì)的基因aroF和aroG，所述aroF和aroG為色氨酸生物合成過(guò)程中合成芳香族氨基酸的第一個(gè)前體DAHP的酶；用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR蛋白；以及用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG、aroP操縱子的tyrR蛋白；并將DNA堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較。通過(guò)這種方式，就可以對(duì)基因突變進(jìn)行定位。然后，將含有aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一個(gè)的CJ285菌株直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中。相對(duì)于親本菌株，CJ285生成的色氨酸要多得多。
也就是說(shuō)，通過(guò)基因重組技術(shù)，大腸桿菌CJ285菌株可以用來(lái)使色氨酸產(chǎn)率最大，并且該菌株是從未公開(kāi)的新菌株。
技術(shù)方案本發(fā)明提供L-色氨酸的生產(chǎn)方法，其中該方法包括以下步驟通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增基因的引物，所述基因?yàn)榫幋a涉及3-脫氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)的合成的酶的基因，編碼用于調(diào)節(jié)與色氨酸生物合成有關(guān)的trp、aroH、mtr、trpR和aroL操縱子的trpR蛋白的基因，和編碼用于調(diào)節(jié)aroF-tyrA、aroG和aroP操縱子的tyrR蛋白的基因，通過(guò)pCR2.1-TOPO載體克隆所述基因以尋找與預(yù)期大小的條帶反應(yīng)的質(zhì)?？寺?；利用含有上述4個(gè)基因的質(zhì)粒克隆作為模板，根據(jù)雙向堿基序列分析，測(cè)定aroF、aroG、trpR和tyrR基因的堿基序列，由所述堿基序列確定氨基酸序列，并將所述基因的堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較以對(duì)突變進(jìn)行定位；和將含有一個(gè)或多個(gè)突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR的大腸桿菌突變株CJ285在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，由此生產(chǎn)L-色氨酸。
本發(fā)明中所用的基因操作遵照分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning Laboratory Manual，T.Maniatis E.F.，F(xiàn)litch，J.Sambrook)。
在含有0.3g/l的THX(色氨酸類似物)的基本培養(yǎng)基的平板中將產(chǎn)生色氨酸的親本菌株大腸桿菌CJ181(KFCC 10902)恒溫培養(yǎng)5天。為了提高生長(zhǎng)速度并解除CJ181對(duì)THX的敏感性，向培養(yǎng)基中加入500μg/ml的致突變物NTG。首先，選擇在含有0.3g/l THX的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的任何菌株，并將這些經(jīng)選擇的菌株再次培養(yǎng)在含有0.5g/l THX的基本培養(yǎng)基中。最后，選擇到了對(duì)THX具有高度抗性的菌株，并將其命名為CJ285。基本培養(yǎng)基的成分如下表1所示，分別往培養(yǎng)基中添加100mg/l的輔源氨基酸。
表1 大腸桿菌基本培養(yǎng)基(M9培養(yǎng)基)的組成

在37℃將本發(fā)明的突變株CJ285在LB培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)12小時(shí)。LB培養(yǎng)基(pH＝7.4)含有1％的細(xì)菌用胰蛋白胨(Bacto-Trypton)、0.5％的細(xì)菌用酵母提取物和1％的NaCl。從培養(yǎng)基收集地衣共生菌(mycobiont)，并利用Quiagen染色體DNA分離試劑盒獲得染色體DNA。將如此獲得的染色體DNA浸在乙醇中并干燥純化。以所述經(jīng)純化染色體DNA為模板進(jìn)行PCR。使用Quiagen凝膠提取試劑盒，從1％瓊脂糖凝膠中分離到分別約為1.3kb、2kb、530bp和1.9kb的aroF、aroG、trpR和tyrR突變基因，并純化所述基因片段以用作克隆的遺傳資源。利用TOPO克隆試劑盒(由Invitrogen公司生產(chǎn))，將源自于CJ285菌株的這些突變基因片段克隆到pCR2.1-TOTO載體中，結(jié)果鑒定到含有所述基因的克隆。
為了測(cè)定編碼aroF、aroG、trpR和tyrR蛋白的基因的堿基序列和氨基酸序列，分離和純化包含突變基因的質(zhì)粒，并測(cè)定包括啟動(dòng)子后的序列、遺傳密碼區(qū)，蛋白合成終止密碼子在內(nèi)的整個(gè)基因序列。為了測(cè)定本發(fā)明的基因的DNA堿基序列，將先前分離純化的質(zhì)粒DNA與測(cè)序引物和聚合酶混合，并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將經(jīng)如此擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA浸在乙醇中進(jìn)行純化并與Hi-Di溶液混合。結(jié)果，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)換成含有單鏈的雙鏈DNA(dsDNA)，并用堿基序列測(cè)序儀ABI 3100(由Applied Biosystem制造)進(jìn)行DNA堿基序列分析。根據(jù)美國(guó)NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)網(wǎng)站中的BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索程序和ExPasy網(wǎng)站中的Tools PROGRAM(http//us.expasy.org/tools/dna.html)進(jìn)行DNA堿基序列分析。然后將經(jīng)如此測(cè)定的基因堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較，以檢查是否發(fā)生任何突變，并通過(guò)翻譯來(lái)鑒定突變氨基酸。
將包含突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR中的至少一個(gè)的CJ285突變株在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中直接發(fā)酵，以生產(chǎn)L-色氨酸。更具體地，在有氧條件(以200rpm～300rpm搖動(dòng)瓶子或以400rpm～1000rpm搖動(dòng)發(fā)酵罐，并且氣流量＝0.5vvm～1.5vvm)下培養(yǎng)所述突變株，發(fā)酵溫度＝30℃，pH＝6.0～8.0，所生成的L-色氨酸積累在培養(yǎng)基中。在使用瓶子的情況中，在30℃和220rpm將突變株培養(yǎng)48小時(shí)～60小時(shí)，所生成的L-色氨酸積累在培養(yǎng)基中。在使用發(fā)酵罐的情況中，采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)法。于是，另外多次補(bǔ)充葡萄糖來(lái)生產(chǎn)L-色氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基各成分列于下表2中。
表2 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成

為了了解培養(yǎng)基的地衣共生菌的生長(zhǎng)速度，測(cè)定了600nm的吸光度。而且，還根據(jù)Bertrand法進(jìn)行糖分析。同時(shí)，利用HPLC(高效液相色譜)分析了L-色氨酸的量。
雖然為說(shuō)明目的而公開(kāi)了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，各種修改、增加和替換都是可能的，其并未脫離如附加的權(quán)利要求書所公開(kāi)的本發(fā)明的范圍和精神。
有益效果根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)用NTG反復(fù)處理大腸桿菌CJ181，開(kāi)發(fā)了新的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM-10534)，并且該突變株具有色氨酸異羥肟酸(色氨酸類似物)抗性。通過(guò)分析與色氨酸生物合成有關(guān)的突變基因aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA堿基序列和氨基酸，可鑒定重要的突變，并且可獲得在重組菌株開(kāi)發(fā)中使用的適當(dāng)?shù)耐蛔兓颉４送?，相?duì)于親本菌株CJ181，它的包含至少一個(gè)突變基因的突變株CJ285能夠產(chǎn)生更多的色氨酸(約多10％)。因此，本發(fā)明的CJ285非常有利于用作重組菌株開(kāi)發(fā)和氨基酸發(fā)酵業(yè)和藥物制造的適當(dāng)親本菌株。
實(shí)施例實(shí)施例1 THX抗性突變株CJ285的選擇在37℃將產(chǎn)生色氨酸的親本菌株大腸桿菌CJ181(KFCC 10902)在LB培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)12小時(shí)，并用經(jīng)消毒的鹽水溶液沖洗兩次。此處的LB培養(yǎng)基(pH＝7.4)含有1％的細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％的細(xì)菌用酵母提取物和1％的NaCl。將CJ181稀釋在0.1M的檸檬酸鈉緩沖液(pH＝5.5)中直到最終OD＝1.0。將CJ181在含有0.3g/l的THX的基本培養(yǎng)基(請(qǐng)參照表1)中培養(yǎng)5天。為了提高生長(zhǎng)速度并獲得對(duì)THX具有抗性的CJ181，將500μg/ml的NTG(致突變物)加到培養(yǎng)基中。將該溶液放在37℃恒溫浴中反應(yīng)30分鐘，并在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH＝7.0)中漂洗3次。然后將CJ181在含有0.5g/l的THX的基本培養(yǎng)基(請(qǐng)參照表1)中培養(yǎng)5天，結(jié)果獲得約100個(gè)菌落。在瓶子中對(duì)如此獲得的突變株和原來(lái)的親本菌株進(jìn)行色氨酸發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果可選擇到相對(duì)于原來(lái)的大腸桿菌親本菌株CJ181具有更優(yōu)異的色氨酸生產(chǎn)性能特征的大腸桿菌CJ285。從該菌株中分離產(chǎn)生L-色氨酸的最好菌株，并將其放在三角瓶中。在三角瓶中對(duì)該菌株進(jìn)行色氨酸生產(chǎn)試驗(yàn)之后，如以下實(shí)施例6中所述，在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
表3 新開(kāi)發(fā)的人工突變株在瓶中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所見(jiàn)到的，由大腸桿菌突變株CJ285生產(chǎn)的L-色氨酸比原來(lái)的親本菌株大腸桿菌KFCC 10902的高。在2003年11月28日將CJ285保藏在KCCM(韓國(guó)微生物保藏中心，Korean Culture Center of Microorganisms)，編號(hào)為KCCM-10534。
實(shí)施例2 突變株CJ285的aroF基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增aroF基因，使用了下列的引物(21mer)。用5′-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3′作為正義引物，并用5′-CACTTCAGCAACCAGTTCCAG-3′作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開(kāi)始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行35秒，55℃進(jìn)行40秒和72℃進(jìn)行90秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒從1％的瓊脂糖凝膠中分離約1.3kb(其對(duì)應(yīng)于aroF突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。使用TOPO克隆試劑盒(由Invitrogen公司生產(chǎn))，將從CJ285菌株獲得的突變基因片段與pCR2.1-TOPO載體溶液按1∶4的比率進(jìn)行混合。然后，往該混合物中加入1μl的鹽水溶液，并在室溫持續(xù)反應(yīng)20分鐘。將反應(yīng)溶液和40μl的包含在所述試劑盒中的TOP10感受態(tài)細(xì)胞混合并在冰上放置20分鐘。然后在42℃熱激30秒，并立即將該溶液放回冰上，放置2分鐘。向其中加入250μl的SOC培養(yǎng)基，并將該突變基因于37℃培養(yǎng)1小時(shí)。將100μl培養(yǎng)物培養(yǎng)基涂在含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在其中于37℃將該突變基因培養(yǎng)約12小時(shí)。只選擇白色菌落并再次在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)約12小時(shí)。從中提取質(zhì)粒，并用EcoRI限制酶處理2小時(shí)，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行顯影。利用紫外照射儀，鑒定到了含有突變基因的克隆。
為了測(cè)定該基因的DNA堿基序列，從先前鑒定的克隆中分離質(zhì)粒并純化。將經(jīng)如此分離純化的質(zhì)粒和2pmol能夠通過(guò)互補(bǔ)氫鍵與aroF基因結(jié)合的序列分析引物、2μl含有聚合酶的Big dye和1μl質(zhì)粒DNA(約200ng)混合。然后，將PCR運(yùn)行25次，首先在96℃進(jìn)行30秒，50℃進(jìn)行15秒和60℃進(jìn)行4分鐘。將質(zhì)粒DNA浸在乙醇中純化，并與10μl的Hi-Di溶液混合。結(jié)果，質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)換成含有單鏈的雙鏈DNA，并用堿基序列測(cè)序儀ABI3100(由Applied Biosystem制造)進(jìn)行DNA堿基序列分析。根據(jù)美國(guó)NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站中的BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索程序和ExPasy網(wǎng)站中的ToolsPROGRAM(http//us.expasy.org/tools/dna.html)進(jìn)行DNA堿基序列分析。然后將經(jīng)如此測(cè)定的基因堿基序列與野生型基因的堿基序列進(jìn)行比較以檢查是否發(fā)生任何突變，并通過(guò)翻譯來(lái)鑒定突變氨基酸。
實(shí)施例3 突變株CJ285的aroG基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增aroG基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GTATTTACCCCGTTATTGTC-3’作為正義引物，并用5’-ACTCCGCCGGAAGTGACTAA-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開(kāi)始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行35秒，55℃進(jìn)行40秒和72℃進(jìn)行2分鐘20秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約2kb(其對(duì)應(yīng)于aroG突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測(cè)定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例4突變株CJ285的trpR基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增trpR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-CGCCACGGAATGGGGACGTCG-3’作為正義引物，并用5’-CCGCGTCTTATCATGCCTACC-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開(kāi)始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行1分鐘，60℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行1分鐘。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約530bp(其對(duì)應(yīng)于trpR突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測(cè)定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例5 突變株CJ285的tyrR基因的克隆和序列分析為了利用從CJ285中分離的染色體DNA作為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增tyrR基因，使用了下列的引物(21mer)。用5’-GGATTGACGATGACAAACCT-3’作為正義引物，并用5’-CTGGTGGATGAAATCACCAC-3’作為反義引物。為進(jìn)行PCR，將約30ng的CJ285的基因組DNA和各為25pmol的引物加到含有DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液的Accupower PCR HL-Premix中，直至最終濃度變?yōu)?0μl。PCR程序運(yùn)行25次。開(kāi)始在94℃進(jìn)行5分鐘，然后在94℃進(jìn)行1分鐘，53℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行2分鐘20秒。最后，在72℃進(jìn)行最后延伸7分鐘。然后通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
為了將基因片段克隆到pCR2.1-TOPO載體中，利用Quiagen凝膠提取試劑盒分離到約1.9kb(其對(duì)應(yīng)于tyrR突變基因的大小)的基因片段。然后純化如此獲得的基因片段，并將其用作克隆的遺傳資源。此后的實(shí)驗(yàn)程序和堿基序列測(cè)定后的堿基序列分析與實(shí)施例2中的相同。
實(shí)施例6 在5L發(fā)酵罐中對(duì)突變株CJ285所進(jìn)行的發(fā)酵將包含具有如實(shí)施例2～5所公開(kāi)的堿基序列的突變基因中的至少一個(gè)的大腸桿菌CJ285和親本菌株CJ181(KFCC 10902)補(bǔ)料分批培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐(發(fā)酵溫度＝30℃，培養(yǎng)物pH＝6.9～7.1(pH可以由氨水控制)，空氣流量＝0.5vvm～1.0vvm，且攪拌速度＝500rpm～700rpm)中。結(jié)果，CJ285的發(fā)酵濃度為28.2g/l，親本菌株CJ181的發(fā)酵濃度為25.1g/l。因此，大腸桿菌CJ285的發(fā)酵時(shí)間稍微減少，從而L-色氨酸生產(chǎn)率每小時(shí)提高約10％。
表4 5L發(fā)酵罐中CJ285突變株的發(fā)酵


有關(guān)保藏的微生物或其他生物材料的說(shuō)明(PCT Rule 13bis)



表PCT/RO134(1998年7月)
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生L-色氨酸的大腸桿菌突變株，該突變株含有由與色氨酸生物合成有關(guān)的aroF、aroG、trpR和tyrR組成的突變基因中的至少一個(gè)。
2.如權(quán)利要求1所述的突變株，其中所述大腸桿菌突變株為大腸桿菌CJ285KCCM-10534。
3.L-色氨酸的生產(chǎn)方法，該方法使用權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的大腸桿菌突變株。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生色氨酸的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM－10534)，該突變株含有與色氨酸的生物合成有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)突變基因，和涉及用所述突變株產(chǎn)生色氨酸的方法。更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了源自于產(chǎn)生色氨酸的大腸桿菌突變株CJ285(KCCM－10534)并與色氨酸生物合成有關(guān)的aroF、aroG、trpR和tyrR的DNA堿基序列和氨基酸序列，并將含有至少一個(gè)所述突變基因的大腸桿菌CJ285直接培養(yǎng)在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，由此可在培養(yǎng)基中積累L－色氨酸。
文檔編號(hào)C07K14/245GK1926232SQ200480037362
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者樸英薰, 林相曹, 金炳勳, 金星俊, 林鎬洙 申請(qǐng)人:Cj株式會(huì)社