專利名稱：效能提高的結(jié)核病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提供特別針對(duì)結(jié)核病的保護(hù)性免疫的新型重組疫苗。
由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病(TB)依然是一個(gè)重要的全球性難題。據(jù)估計(jì)，全世界人口中有三分之一的人被結(jié)核分枝桿菌感染(Kodhi，1991)。在許多國(guó)家，控制TB的唯一手段是接種牛型分枝桿菌卡介苗(BCG)。然而，BCG對(duì)于TB的總疫苗有效率大約50％，在不同的實(shí)地試驗(yàn)中有效率從0％-80％變化極大(Roche等，1995)。因此，應(yīng)當(dāng)對(duì)BCG進(jìn)行改進(jìn)，例如通過遺傳工程的方法，以提供能更好控制TB的疫苗(Murray等，1996；Hess和Kaufmann，1993)。多重抗藥性結(jié)核病株的廣泛出現(xiàn)更突出了對(duì)于新型TB疫苗的急迫需求(Grange，1996)。
結(jié)核分枝桿菌屬于細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌群，在靜息的巨噬細(xì)胞的吞噬泡中復(fù)制，因此針對(duì)TB的保護(hù)依賴于T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(Kaufmann，1993)。然而，一些小鼠和人體的研究顯示，分枝桿菌刺激抗原特異性的、主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II型或I型分別限制的CD4或CD8T細(xì)胞(Kaufmann，1993)。
MHC I型限制的CD8 T細(xì)胞的重要作用通過β2-微球蛋白(β2m)缺陷型小鼠控制實(shí)驗(yàn)性結(jié)核分枝桿菌感染的失敗而得到令人信服的證實(shí)(Flynn等，1993)。由于這些突變小鼠缺少M(fèi)HC I型，不能發(fā)育出有功能的CD8 T細(xì)胞。和結(jié)核分枝桿菌感染形成對(duì)照的是，β2m-缺陷型小鼠能夠控制一定劑量BCG疫苗株的感染(Flynn等，1993；Ladel等，1995)。另外，接種了BCG，然后再進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染的β2m-缺陷型小鼠存活期延長(zhǎng)，因?yàn)锽CG使C57BL/6產(chǎn)生了對(duì)TB的免疫性(Flynn等，1993)。結(jié)核分枝桿菌和BCG之間不同的CD8 T細(xì)胞依賴性可作如下解釋結(jié)核分枝桿菌抗原比來自BCG的抗原更容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致更明確的MHC I型呈遞(Hess和Kaufmann)。因此，結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生更為有效的CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。這種看法近來得到了證實(shí)卵清蛋白作為一種無關(guān)的抗原，在與結(jié)核分枝桿菌同時(shí)感染抗原呈遞細(xì)胞(APC)時(shí)，比與BCG同時(shí)感染APC更能使MHC I型呈遞提高(Mazzaccaro等，1996)。
結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白包含有價(jià)值的MHC I型呈遞抗原來源。近來，一種編碼分泌性抗源Ag85A的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)引發(fā)MHC I型限制的CD8 T細(xì)胞反應(yīng)，可能有助于預(yù)防TB(Huygen等，1996)。總之，證據(jù)在增加，在豚鼠和小鼠體內(nèi)用結(jié)核桿菌的分泌性蛋白抗原接種誘導(dǎo)了一些針對(duì)TB的保護(hù)作用(Horwitz等，1995；Andersen等，1994)。因此，開發(fā)基于BCG的改進(jìn)的TB疫苗的一個(gè)重要目標(biāo)，是使分泌的BCG-特異性抗原提高進(jìn)入被感染的APC的細(xì)胞質(zhì)的能力。隨之發(fā)生的衍生自這些分泌蛋白的肽進(jìn)入MHC I型呈遞途徑的遞送可能增強(qiáng)本已存在的BCG-特異性的抵抗TB的免疫反應(yīng)。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌從吞噬溶酶體的逃逸代表了一種利于MHC I型對(duì)李斯特氏菌抗原的抗原呈遞的獨(dú)特機(jī)制(Berche等，1987；Portnoy等，1988)。李斯特菌溶胞素(Hly)，一種巰基活化的成孔溶細(xì)胞素，對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的微生物體從吞噬溶酶體泡中進(jìn)入宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠是必不可少的(Gaillard等，1987；Portnoy等，1988)。這種逃逸功能近來被轉(zhuǎn)化到枯草桿菌和減毒的沙門氏菌株中(Bielecki等，1991；Gentschev等，1995；Hess和Kaufmann，1997)。不產(chǎn)孢子的枯草桿菌突變株或者沙門氏菌屬物種表達(dá)Hly導(dǎo)致從吞噬溶酶體進(jìn)入J774巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的細(xì)菌性逃逸(Bielecki等，1991；Gentschev等，1995；Hess和Kaufmann，1997)。
WO 99/101496以及Hess等(1988)公開了生物性地分泌活性李斯特菌溶胞素融合蛋白的重組牛型分枝桿菌菌株。這些牛型分枝桿菌菌株在一些動(dòng)物模型中已經(jīng)被證實(shí)是有效的抗TB疫苗。
根據(jù)本發(fā)明，Hly是在脲酶-缺陷型BCG菌株上進(jìn)行表達(dá)。這些脲酶-缺陷型BCG菌株在吞噬體內(nèi)表現(xiàn)出升高的Hly活性，內(nèi)體膜上孔形成的增強(qiáng)反過來導(dǎo)致突出的免疫保護(hù)性。另外，脲酶-缺陷型BCG-Hly菌株參與凋亡過程，這也可能有助于增強(qiáng)免疫保護(hù)。因此，這種脲酶-缺陷型BCG菌株具有進(jìn)一步提高的免疫能力。另外，意外地發(fā)現(xiàn)，脲酶-缺陷型BCG菌株與BCG親本株相比展現(xiàn)出提高的安全性，這使它特別適合于對(duì)免疫缺陷對(duì)象進(jìn)行接種。
本發(fā)明的第一個(gè)方面是一種細(xì)菌細(xì)胞，特別是一種脲酶缺陷型的，包含編碼一種融合多肽的重組核酸分子的分枝桿菌細(xì)胞，該融合多肽包含(a)來自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)，和(b)一個(gè)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的，該細(xì)胞能夠表達(dá)本發(fā)明的核酸分子。更優(yōu)選的，該細(xì)胞能夠分泌該融合多肽和/或能夠以適合MHC I型限制抗原識(shí)別的形式提供該融合多肽。
本發(fā)明的細(xì)菌細(xì)胞是一種脲酶-缺陷型細(xì)胞，例如革蘭氏陰性菌細(xì)胞或革蘭氏陽性菌細(xì)胞，優(yōu)選的是分枝桿菌細(xì)胞。脲酶缺陷可通過使一個(gè)或幾個(gè)編碼脲酶亞基的細(xì)胞核酸分子部分或全部失活而獲得，特別是編碼脲酶A亞基的ureA，編碼脲酶B亞基的ureB和/或編碼脲酶C亞基的ureC。分枝桿菌，特別是牛型分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中ureA，ureB和ureC的序列以及它們所編碼的蛋白已經(jīng)在Reyrat等(1995)和Clemens等(1995)的文獻(xiàn)中記載，通過引用將該文獻(xiàn)并入本申請(qǐng)。
優(yōu)選的脲酶缺陷型菌株是通過在編碼脲酶亞基的核酸序列和/或它們的表達(dá)控制序列中刪除和/或插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸而得到。刪除和/或插入可通過同源重組、轉(zhuǎn)座子插入或其它適當(dāng)?shù)姆椒óa(chǎn)生。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中ureC序列被失活，例如，按照Reyrat等(1995)的方法，通過構(gòu)建一個(gè)含有被選擇性標(biāo)記基因打斷的ureC基因的自殺載體，用該載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，篩選出具有脲酶陰性表現(xiàn)型的陽性選擇性標(biāo)記細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選的是牛型分枝桿菌細(xì)胞、結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞，特別是減毒的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞或其他分枝桿菌，例如田鼠分枝桿菌(M.microti)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、M.canettii、海分枝桿菌(M.marinum)、或偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)，或者如Reyrat等(1995)所描述的分枝桿菌。
本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞包含重組的核酸分子，例如，SEQ ID No.1的核酸分子。該核酸分子包含信號(hào)肽編碼序列(核苷酸1-120)、編碼免疫原性結(jié)構(gòu)域的序列(核苷酸121-153)、連接肽編碼序列(核苷酸154-210)、編碼吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域的序列(核苷酸211-1722)、另外的連接肽編碼序列(核苷酸1723-1800)和編碼隨機(jī)肽的序列(核苷酸1801-1870)。相應(yīng)的氨基酸序列在SEQ ID No.2中示出。
該核酸包含至少一個(gè)來自多肽的免疫原性結(jié)構(gòu)域。該免疫原性結(jié)構(gòu)域可衍生自分枝桿菌屬的生物，優(yōu)選地衍生自結(jié)核分枝桿菌或牛型分枝桿菌。該結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度至少有6個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少8個(gè)氨基酸。該免疫原性結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是天然分枝桿菌多肽的一部分。但是，本發(fā)明的范圍也包括經(jīng)修飾的免疫原性結(jié)構(gòu)域，它是由天然免疫原性結(jié)構(gòu)域經(jīng)過替換、刪除和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生而來。
然而該免疫原性結(jié)構(gòu)域不限于分枝桿菌抗原，可以選自身抗原、腫瘤抗原和病原體抗原，一般如病毒抗原、寄生蟲抗原、細(xì)菌抗原和其免疫原性片段。適合的腫瘤抗原的特定實(shí)例是人腫瘤抗原，例如p53腫瘤抑制基因產(chǎn)物(Houbiers等，1993)，以及黑色素細(xì)胞分化抗原，如Melan-A/MART-1和gp100(van Elsas等，1996)。適合的病毒抗原的特定實(shí)例是人腫瘤病毒抗原，例如人乳頭狀瘤病毒抗原，如抗原E6和E7(Bosch等，1991)；流感病毒抗原，如流感病毒核蛋白(Matsui等，1995；Fu等，1997)；或逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原，例如HIV抗原，如HIV-1抗原p17、p24、RT和Env(Harrer等，1996；Haas等，1996)。適合的寄生蟲抗原的特定實(shí)例是瘧原蟲抗原如來自惡性瘧原蟲的肝期抗原(LSA-1)、環(huán)子孢子蛋白(CS或等位變體cp26或cp29)、血小板反應(yīng)素相關(guān)匿名蛋白(TRAP)、子孢子蘇氨酸及天冬酰胺富集蛋白(STARP)(Aidoo等，1995)，以及弓形體抗原例如來自鼠弓形體的p30(Khan等，1991；Bulow和Boothroyd等，1991)。適合的細(xì)菌抗原的特定實(shí)例是軍團(tuán)菌抗原例如來自嗜肺性軍團(tuán)病桿菌的主要分泌蛋白(Blander和Horwitz，1991)。
免疫原性結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以是B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。但是，優(yōu)選的，免疫原性結(jié)構(gòu)域能夠引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，更優(yōu)選能引發(fā)MHC I型限制的CD8 T細(xì)胞反應(yīng)。
能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域更優(yōu)選選自來自牛型分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌的免疫原性肽或多肽或來自其免疫原性片段。合適抗原的特定實(shí)例是來自結(jié)核分枝桿菌的Ag85B(p30)(Harth等，1996)、來自牛型分枝桿菌BCG的Ag85B(α-抗原)(Matsuo等，1988)、來自結(jié)核分枝桿菌的Ag85A(Huygen等，1996)，以及來自結(jié)核分枝桿菌的ESAT-6(Sorensen等，1996；Harboe等，1996；和Andersen等，1995)。更優(yōu)選，該免疫原性結(jié)構(gòu)域衍生自抗原Ag85B。最優(yōu)選地，該免疫原性結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID No.2中41位氨基酸至51位氨基酸的序列。
根據(jù)本發(fā)明的重組核酸分子進(jìn)一步包含吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，即，可使融合多肽從吞噬溶酶體中逃逸進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠的多肽結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是李斯特氏菌吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域記載于US 5,733,151，通過引用合并在此。更優(yōu)選，該吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域衍生自單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌有機(jī)體。最優(yōu)選，該吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域由選自以下的核酸分子編碼(a)包含SEQ ID No.1所示的核苷酸211-1722的核苷酸序列，(b)編碼與(a)編碼的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列，和(c)在嚴(yán)緊條件下與來自(a)或(b)的序列雜交的核苷酸序列。
除了SEQ ID No.1中所描述的核苷酸序列之外，本發(fā)明還包括與之雜交的核酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語“雜交”按照Sambrook等的定義(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，1.101-1.104)使用。依照本發(fā)明，如果在用1×SSC和0.1％SDS洗滌1小時(shí)，溫度為55℃，優(yōu)選62℃，更優(yōu)選68℃；特別是用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌1小時(shí)，溫度55℃，優(yōu)選62℃，更優(yōu)選68℃，之后，仍可觀察到陽性雜交信號(hào)，則使用術(shù)語“雜交”。在以上洗滌條件下與按照SEQ ID No.1的核苷酸序列雜交的序列是本發(fā)明優(yōu)選的吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域編碼核苷酸序列。
如上所述的編碼吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列可以直接獲自李斯特氏菌有機(jī)體或任何重組來源，如包含如上所述相應(yīng)李斯特氏菌核酸分子或其變體的重組大腸桿菌細(xì)胞。
優(yōu)選地，編碼融合多肽的重組核酸分子包含信號(hào)肽編碼序列。更優(yōu)選地，該信號(hào)序列是在分枝桿菌中有活性、優(yōu)選的在牛型分枝桿菌中有活性的信號(hào)序列，例如天然的牛型分枝桿菌信號(hào)序列。合適的信號(hào)序列的優(yōu)選實(shí)例是編碼Ag85B信號(hào)肽的核苷酸序列，是SEQ ID No.1所描述的序列中核苷酸1-120。
另外，優(yōu)選在免疫原性結(jié)構(gòu)域和吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域之間具有一個(gè)連接肽。優(yōu)選，所述的連接肽具有5到50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。更優(yōu)選，一個(gè)編碼連接肽的如SEQ ID No.1所述從核苷酸154至210，或者依照遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與之相應(yīng)的序列。
該核酸可位于重組載體中。優(yōu)選該重組載體是原核載體，也就是含有在原核細(xì)胞內(nèi)用于復(fù)制和/或基因組整合的元件的載體。優(yōu)選該重組載體攜帶與表達(dá)控制序列有效連接的本發(fā)明的核酸分子。該表達(dá)控制序列優(yōu)選是在分枝桿菌、特別是牛型分枝桿菌中有活性的表達(dá)控制序列。該載體可以是染色體外的載體或者是適合于整合入染色體的載體。這種載體的實(shí)例對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的，例如，以上Sambrook等所給出的例子。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供一種脲酶缺陷型細(xì)菌細(xì)胞，如分枝桿菌細(xì)胞，優(yōu)選的提供一種牛型分枝桿菌細(xì)胞，其包含至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的核酸分子。即使該吞噬溶酶體逃逸肽或多肽沒有與抗原融合，也可發(fā)現(xiàn)其免疫原性出人意料地提高。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供的重組細(xì)菌細(xì)胞可以包含至少一種進(jìn)一步的重組分子，例如編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)的肽或多肽的異源核酸分子。所述進(jìn)一步的免疫原性肽或多肽可以選自分枝桿菌抗原，或更廣義地來講，選自自身抗原、腫瘤抗原、病原體抗原及其免疫原性片段。編碼該進(jìn)一步的肽或多肽的核酸分子可以與融合基因一樣位于同一載體內(nèi)。但是，例如，它也可以獨(dú)立于所述融合基因位于不同的質(zhì)粒內(nèi)，或整合到染色體中。
出人意料的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞在被感染的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)存留時(shí)間，等于或少于相應(yīng)不含重組核酸分子的天然分枝桿菌細(xì)胞的胞內(nèi)存留時(shí)間。
本發(fā)明還涉及一種包含上述細(xì)胞作為活性劑的藥物組合物，任選地組合有藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體和佐劑。優(yōu)選的是，該組合物是活疫苗，適于給藥于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。實(shí)際選擇的接種疫苗方法依賴所選擇的接種疫苗載體。給藥可以一次劑量完成，也可以間隔重復(fù)。合適的劑量取決于如疫苗載體本身或給藥的途徑等各種參數(shù)?？蛇x擇給藥至粘膜表面(例如，眼睛、鼻、口、胃、腸、直腸、陰道，或尿道)或通過腸胃外的途徑(例如，皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))。
另外，本發(fā)明關(guān)于制備上面所闡述的重組細(xì)菌細(xì)胞的方法。根據(jù)第一個(gè)方面，該方法包括如下步驟(i)提供脲酶-缺陷型細(xì)菌細(xì)胞，特別是分枝桿菌細(xì)胞，(ii)向所述細(xì)菌細(xì)胞中插入重組核酸分子，所述核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包括(a)來自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)，和(b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，以及(iii)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)通過步驟(ii)得到的細(xì)胞。優(yōu)選得到的細(xì)胞能夠表達(dá)所述的核酸分子。更優(yōu)選所述細(xì)胞是牛型分枝桿菌細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，這種方法包括如下步驟(i)提供脲酶-缺陷型細(xì)菌細(xì)胞，特別是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞，(ii)向所述細(xì)菌細(xì)胞中插入重組核酸分子，所述核酸分子編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽，以及(iii)，在適當(dāng)條件下培養(yǎng)通過(ii)所得到的細(xì)胞。
如果需要，本發(fā)明的方法包括向細(xì)菌細(xì)胞中插入最少一種進(jìn)一步的重組核酸分子，所述進(jìn)一步的重組核酸分子編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)的肽或多肽。
最后，本發(fā)明涉及一種制備活疫苗的方法，包括將藥學(xué)有效量的重組細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體和/或佐劑配置在一起。
由于脲酶-缺陷型細(xì)菌細(xì)胞的高安全性——這種安全性已在兩種不同的動(dòng)物模型中得到證明(實(shí)施例3)——本發(fā)明的活疫苗特別適于給藥于免疫缺陷對(duì)象，例如遭受HIV感染的病人或者用免疫抑制藥物治療的病人。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的活疫苗作為結(jié)核疫苗用于免疫缺陷病人。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該活疫苗被用作腫瘤疫苗，例如，作為針對(duì)表淺膀胱癌的疫苗。在本發(fā)明再進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該活疫苗被用于獸醫(yī)領(lǐng)域，例如作為針對(duì)李斯特菌病、副結(jié)核病或牛結(jié)核病的疫苗。
通過下列的圖和序列表進(jìn)一步說明本發(fā)明。


圖1顯示rBCG ureC Hly在鼠類結(jié)核氣溶膠模型中的保護(hù)能力。BALB/c小鼠經(jīng)靜脈接種1×106CFU的rBCG ureC Hly、BCG P ureC，或天然的BCG“巴斯德”所免疫。免疫120天后，動(dòng)物用H37Rv(200有機(jī)體/肺)以氣溶膠形式攻擊。攻擊后的30、60和90天對(duì)被感染的器官(脾和肺)上負(fù)載的細(xì)菌計(jì)數(shù)。每條線代表10只動(dòng)物。
圖2顯示微生物在肺(圖2a)或脾(圖2b)上的數(shù)量。Rag1-/-小鼠用BCG親代菌株(wt)或rBCG ureC Hly菌株(urea-Hly)感染。受感染器官所負(fù)載的細(xì)菌在感染后30，60，90天后被計(jì)數(shù)。
圖3顯示SCID小鼠在經(jīng)BCG“巴斯德”和rBCG delta ureC Hly感染后的存活率。
SEQ ID No.1顯示本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列。
SEQ ID No.2顯示SEQ ID No.1的核酸分子相應(yīng)的氨基酸序列。
實(shí)施例1脲酶-缺陷型BCG Hly菌株的產(chǎn)物及在小鼠模型中的試驗(yàn)1.BCG delta ureC的脲酶活性失活為了提高包含Hly蛋白(rBCG-Hly)的BCG菌株的保護(hù)能力，脲酶活性被去除。
為了獲得脲酶-缺陷型突變體，Reyrat等構(gòu)建了一個(gè)自殺載體，它含有一個(gè)被kanamycin標(biāo)記(aph基因)所斷開的ureC基因。2微克的這種構(gòu)建載體被Sac I線性化，并經(jīng)電穿孔進(jìn)入牛型分枝桿菌BCG。篩選卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體以得到脲酶陰性表現(xiàn)型(cf.Reyrat等，1995)。
2.分枝桿菌大腸桿菌穿梭表達(dá)載體pMV306Hly的構(gòu)建為了將吞噬溶酶體逃逸功能(通過單核細(xì)胞增生李斯特氏菌EGD Sv 1/2a的Hly介導(dǎo))轉(zhuǎn)移到BCG巴斯德(1173 P3)delta ureC，使用了大腸桿菌-分枝桿菌穿梭載體。這種整合型質(zhì)粒pMV306，是載體pMV361的前體，容許穩(wěn)定的Hly染色體表達(dá)。
一個(gè)pILH-1-衍生的編碼hly-hlyA(大腸桿菌pHly152-特異性溶血素A)ORF的1.7kb的PstI DNA片段被插入到質(zhì)粒pAT261的PstI位點(diǎn)。得到的融合基因編碼表達(dá)的分泌蛋白被BCG-特異性信號(hào)肽引導(dǎo)到上清液。該構(gòu)建體稱為pAT261Hly，接下來，它的在hsp60分枝桿菌啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的Xbal-SallDNA表達(dá)盒被用于插入親代pMV306載體，得到構(gòu)建體pMV306Hly。對(duì)兩種分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒中Hly-特異性插入位點(diǎn)的DNA序列都進(jìn)行分析。成熟的Hly融合蛋白推定為在N末端含有30個(gè)氨基酸，在部分地屬于大腸桿菌的HlyA的融合物C末端部分有52個(gè)氨基酸。
3.在小鼠模型中的保護(hù)能力將表達(dá)載體pMV306Hly轉(zhuǎn)化進(jìn)入一種脲酶缺陷型BCG菌株巴斯德(BCG PureC)。得到的轉(zhuǎn)化株命名為rBCG ureC Hly。圖1顯示該脲酶缺陷型分枝桿菌菌株與親代BCG巴斯德菌株，以及BCG巴斯德ureC菌株在鼠類結(jié)核模中的保護(hù)能力的對(duì)比。出人意料的是，發(fā)現(xiàn)rBCG ureC Hly在早時(shí)間點(diǎn)(攻擊后30天)已經(jīng)導(dǎo)致提高的保護(hù)能力，且在整個(gè)觀察期(至90天)持續(xù)。
還用rBCG ureC Hly進(jìn)行了更深入的一項(xiàng)長(zhǎng)期的保護(hù)實(shí)驗(yàn)。BALB/c小鼠靜脈接種rBCG ureC Hly，rBCG-Hly或者親代BCG進(jìn)行免疫，注射后120天用結(jié)核分枝桿菌H37Rv氣溶膠攻擊。RBCG-Hly和親代BCG在90天時(shí)可導(dǎo)致相當(dāng)?shù)尼槍?duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的保護(hù)作用。作為鮮明對(duì)照的是，rBCG ureC Hly在靜脈接種開始后30天這一早時(shí)間點(diǎn)已經(jīng)導(dǎo)致更高的保護(hù)作用。另外，這種增強(qiáng)的保護(hù)作用在整個(gè)觀察期間持續(xù)，并且顯示靜脈接種后90天結(jié)核桿菌H37Rv在肺上的負(fù)載量比未經(jīng)免疫的小鼠減少超過2log CFU，比接種親代BCG的小鼠減少超過1log CFU。
在用臨床分離的結(jié)核桿菌Beijing攻擊后得到近似的結(jié)果。BALB/c小鼠靜脈接種rBCG ureC Hly，BCG-Hly或親代BCG進(jìn)行免疫，在靜脈接種后120天用結(jié)核分枝桿菌Beijing氣溶膠攻擊。接種BCG ureC Hly疫苗在早時(shí)間點(diǎn)(30天)就已經(jīng)引發(fā)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Beijing的提高的保護(hù)作用，且在直至靜脈接種后90天的整個(gè)觀察期持續(xù)。與接種親代BCG相比，接種rBCG ureC Hly疫苗導(dǎo)致肺中結(jié)核分枝桿菌Beijing減少1log CFU。
實(shí)施例2在豚鼠中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的長(zhǎng)期保護(hù)作用由于小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染具有相對(duì)較強(qiáng)的抵抗力，豚鼠作為一種更易感的動(dòng)物模型被用于測(cè)試rBCG ureC Hly的免疫能力。將豚鼠分別進(jìn)行皮下免疫分枝桿菌疫苗株，rBCG ureC Hly或親代BCG，用結(jié)核分枝桿菌H37Rv進(jìn)行攻擊后，監(jiān)測(cè)體重增加和CFU。直到120天，用rBCG ureC Hly免疫過的豚鼠與用親代BCG株免疫過的豚鼠顯示近似的體重增加，而沒有免疫過的動(dòng)物卻明顯感染了結(jié)核病，因?yàn)樗鼈兊捏w重沒有增加。
在CFU分析之前對(duì)肺和脾的視覺檢查顯示，被BCG免疫的豚鼠與接種過BCGureC Hly的動(dòng)物相比，這兩種器官表面的結(jié)核要大得多，數(shù)量也多得多。
實(shí)施例3 BCG ureC Hly的安全性評(píng)估用106個(gè)BCG親代菌株(wt)或rBCG ureC Hly菌株的微生物體感染T細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷的Rag1-/-小鼠。監(jiān)測(cè)存在于肺和脾上的微生物體。在肺上觀察到的rBCG ureC Hly的CFU顯著減少(圖2a)。在脾上，用uBCG ureC Hly感染比用親代BCG感染后的CFU有輕微減少(Fig.2b)。
BCG ureC Hly的安全性在免疫缺陷的SCID小鼠中進(jìn)行更深入的測(cè)試。為此，將SCID小鼠靜脈接種107-108個(gè)rBCG ureC Hly或親代BCG菌株的微生物體。盡管SCID小鼠在接種親代菌株后于接種后的25天死亡，但接種了rBCGureC Hly的小鼠一直存活到接種后的150天(圖3)。
這些實(shí)驗(yàn)表明BCG ureC Hly與親代BCG菌株相比，具有更高的安全性。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)NAMEMax-Planck-Gesellschaft zur FoerderungderWissenschaften eV.
(B)街道Hofgartenstrasse 2(C)城市慕尼黑(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼80539(ii)發(fā)明名稱結(jié)核病疫苗(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A 長(zhǎng)度1881堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性質(zhì)兩者(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1878(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG ACA GAC GTG AGC CGA AAG ATT CGA GCT TGG GGA CGC CGA TTG ATG48Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTT GCC96Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala20 25 30GGC GGA GCG GCA ACC GCG GGC GCG TTC TCC CGG CCG GGG CTG CCG GTC 144Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val35 40 45GAG TAC CTG CAG TCT GCA AAG CAA TCC GCT GCA AAT AAA TTG CAC TCA 192Glu Tyr Leu Gln Ser Ala Lys Gln Ser Ala Ala Asn Lys Leu His Ser50 55 60GCA GGA CAA AGC ACG AAA GAT GCA TCT GCA TTC AAT AAA GAA AAT TCA 240Ala Gly Gln Ser Thr Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser65 70 75 80ATT TCA TCC ATG GCA CCA CCA GCA TCT CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG 288Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr85 90 95
CCA ATC GAA AAG AAA CAC GCG GAT GAA ATC GAT AAG TAT ATA CAA GGA 336Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly100 105 110TTG GAT TAC AAT AAA AAC AAT GTA TTA GTA TAC CAC GGA GAT GCA GTG 384Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val115 120 125ACA AAT GTG CCG CCA AGA AAA GGT TAC AAA GAT GGA AAT GAA TAT ATT 432Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile130 135 140GTT GTG GAG AAA AAG AAG AAA TCC ATC AAT CAA AAT AAT GCA GAC ATT 480Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile145 150 155 160CAA GTT GTG AAT GCA ATT TCG AGC CTA ACC TAT CCA GGT GCT CTC GTA 528Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val165 170 175AAA GCG AAT TCG GAA TTA GTA GAA AAT CAA CCA GAT GTT CTC CCT GTA 576Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val180 185 190AAA CGT GAT TCA TTA ACA CTC AGC ATT GAT TTG CCA GGT ATG ACT AAT 624Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn195 200 205CAA GAC AAT AAA ATC GTT GTA AAA AAT GCC ACT AAA TCA AAC GTT AAC 672Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn210 215 220AAC GCA GTA AAT ACA TTA GTG GAA AGA TGG AAT GAA AAA TAT GCT CAA 720Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln225 230 235 240GCT TAT CCA AAT GTA AGT GCA AAA ATT GAT TAT GAT GAC GAA ATG GCT 768Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala245 250 255TAC AGT GAA TCA CAA TTA ATT GCG AAA TTT GGT ACA GCA TTT AAA GCT 816Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala260 265 270GTA AAT AAT AGC TTG AAT GTA AAC TTC GGC GCA ATC AGT GAA GGG AAA 864Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys275 280 285ATG CAA GAA GAA GTC ATT AGT TTT AAA CAA ATT TAC TAT AAC GTG AAT 912Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn290 295 300GTT AAT GAA CCT ACA AGA CCT TCC AGA TTT TTC GGC AAA GCT GTT ACT 960Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr305 310 315 320AAA GAG CAG TTG CAA GCG CTT GGA GTG AAT GCA GAA AAT CCT CCT GCA 1008Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala325 330 335TAT ATC TCA AGT GTG GCG TAT GGC CGT CAA GTT TAT TTG AAA TTA TCA 1056Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser340 345 350ACT AAT TCC CAT AGT ACT AAA GTA AAA GCT GCT TTT GAT GCT GCC GTA 1104Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val355 360 365AGC GGA AAA TCT GTC TCA GGT GAT GTA GAA CTA ACA AAT ATC ATC AAA 1152Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys370 375 380
AAT TCT TCC TTC AAA GCC GTA ATT TAC GGA GGT TCC GCA AAA GAT GAA 1200Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile TyT Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu385 390 395 400GTT CAA ATC ATC GAC GGC AAC CTC GGA GAC TTA CGC GAT ATT TTG AAA 1248Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys405 410 415AAA GGC GCT ACT TTT AAT CGA GAA ACA CCA GGA GTT CCC ATT GCT TAT 1296Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr420 425 430ACA ACA AAC TTC CTA AAA GAC AAT GAA TTA GCT GTT ATT AAA AAC AAC 1344Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn435 440 445TCA GAA TAT ATT GAA ACA ACT TCA AAA GCT TAT ACA GAT GGA AAA ATT 1392Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile450 455 460AAC ATC GAT CAC TCT GGA GGA TAC GTT GCT CAA TTC AAC ATT TCT TGG 1440Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp465 470 475 480GAT GAA GTA AAT TAT GAT CCT GAA GGT AAC GAA ATT GTT CAA CAT AAA 1488Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys485 490 495AAC TGG AGC GAA AAC AAT AAA AGC AAG CTA GCT CAT TTC ACA TCG TCC 1536Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser500 505 510ATC TAT TTG CCA GGT AAC GCG AGA AAT ATT AAT GTT TAC GCT AAA GAA 1584Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu515 520 525TGC ACT GGT TTA GCT TGG GAA TGG TGG AGA ACG GTA ATT GAT GAC CGG 1632Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg530 535 540AAC TTA CCA CTT GTG AAA AAT AGA AAT ATC TCC ATC TGG GGC ACC ACG 1680Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr545 550 555 560CTT TAT CCG AAA TAT AGT AAT AAA GTA GAT AAT CCA ATC GAA TAT GCA 1728Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala565 570 575TTA GCC TAT GGA AGT CAG GGT GAT CTT AAT CCA TTA ATT AAT GAA ATC 1776Leu Ala Tyr Gly Ser Gln Gly Asp Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile580 585 590AGC AAA ATC ATT TCA GCT GCA GTT CTT TCC TCT TTA ACA TCG AAG CTA 1824Ser Lys Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu595 600 605CCT GCA GAG TTC GTT AGG CGC GGA TCC GGA ATT CGA AGC TTA TCG ATG 1872Pro Ala Glu Phe Val Arg Arg Gly Ser Gly Ile Arg Ser Leu Ser Met610 615 620TCG ACG TAG 1881Ser Thr625
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度626氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala20 25 30Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val35 40 45Glu Tyr Leu Gln Ser Ala Lys Gln Ser Ala Ala Asn Lys Leu His Ser50 55 60Ala Gly Gln Ser Thr Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser65 70 75 80Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr85 90 95Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly100 105 110Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val115 120 125Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile130 135 140Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile145 150 155 160Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val165 170 175Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val180 185 190Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn195 200 205Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn210 215 220Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln225 230 235 240Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala245 250 255Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala260 265 270Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys275 280 285Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn290 295 300Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr305 310 315 320Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala325 330 335
Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser340 345 350Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala A la Phe Asp Ala Ala Val355 360 365Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys370 375 380Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu385 390 395 400Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys405 410 415Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr420 425 430Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn435 440 445Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile450 455 460Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp465 470 475 480Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys485 490 495Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser500 505 510Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu515 520 525Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg530 535 540Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr545 550 555 560Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala565 570 575Leu Ala Tyr Gly Ser Gln Gly Asp Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile580 585 590Ser Lys Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu595 600 605Pro Ala Glu Phe Val Arg Arg Gly Ser Gly Ile Arg Ser Leu Ser Met610 615 620Ser Thr62權(quán)利要求
1.一種脲酶缺陷型細(xì)菌細(xì)胞，包含編碼融合多肽的重組核酸分子，該融合多肽包含(a)來自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)，和(b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中至少一個(gè)細(xì)胞脲酶亞基編碼核酸序列被失活。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中至少細(xì)胞脲酶C亞基編碼序列被失活。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是李斯特氏菌吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域由選自以下的核酸分子編碼(a)包含SEQ ID No.1所示的核苷酸211-1722的核苷酸序列，(b)編碼與(a)中序列相同氨基酸序列的核苷酸序列，和(c)在嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)中序列雜交的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域是能引發(fā)MHC I型限制的CD8 T細(xì)胞反應(yīng)的肽或多肽。
7.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域來自分枝桿菌多肽。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域選自分枝桿菌抗原Ag85B(結(jié)核分枝桿菌)，Ag85B(牛型分枝桿菌)，Ag85A(結(jié)核分枝桿菌)和ESAT-6(結(jié)核分枝桿菌)，或其免疫原性片段。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域是抗原Ag85B或其免疫原性片段。
10.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中融合多肽之前有信號(hào)肽序列。
11.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中連接肽位于引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域和吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域之間。
12.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述核酸分子與表達(dá)控制序列有效連接。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述表達(dá)控制序列在所述細(xì)胞中有活性。
14.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述核酸分子位于載體上。
15.權(quán)利要求1的細(xì)胞，它是分枝桿菌細(xì)胞。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞，它是牛型分枝桿菌細(xì)胞。
17.一種脲酶缺陷型細(xì)菌細(xì)胞，包含至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其包含至少另一種編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)的肽或多肽的重組核酸分子。
19.權(quán)利要求18的細(xì)胞，它是分枝桿菌細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，它是牛型分枝桿菌細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1或17的細(xì)胞，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域或肽或多肽選自自身抗原、腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原、細(xì)菌抗原和其免疫原性片段。
22.權(quán)利要求1或17的細(xì)胞，它能夠表達(dá)所述至少一種重組核酸分子。
23.權(quán)利要求22的細(xì)胞，它能夠分泌由所述的至少一種核酸分子編碼的多肽。
24.權(quán)利要求1或23的細(xì)胞，它在被感染的巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)存留時(shí)間，等于或少于天然的分枝桿菌細(xì)胞的胞內(nèi)存留時(shí)間。
25.一種包含權(quán)利要求1或17的細(xì)胞作為活性劑的藥物組分物，任選地組合有藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體和佐劑。
26.權(quán)利要求25的組合物，它是適于給藥于粘膜表面或通過腸胃外的途徑給藥的活疫苗。
27.制備活疫苗的方法，包括將藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1或17的細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體和佐劑配置在一起。
28.制備權(quán)利要求1的重組細(xì)菌細(xì)胞的方法，包含以下步驟(i)提供脲酶缺陷細(xì)菌細(xì)胞；(ii)向所述細(xì)菌細(xì)胞中插入重組核酸分子，所述核酸分子編碼融合多肽，該融合多肽包括(a)來自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)，和(b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，以及(iii)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)通過步驟(ii)得到的細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞是牛型分枝桿菌細(xì)胞。
30.一種制備權(quán)利要求17的重組細(xì)菌細(xì)胞的方法，包含如下步驟(i)提供脲酶-缺陷型細(xì)菌細(xì)胞；(ii)向所述細(xì)菌細(xì)胞中插入重組核酸分子，所述核酸分子編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽，和(iii)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)通過(ii)所得到的細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，包括向細(xì)菌細(xì)胞中插入至少一種另外的重組核酸分子，所述另外的重組核酸分子編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)的肽或多肽。
32.權(quán)利要求28或30的方法，其中能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)域或肽或多肽選自自身抗原、腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原、細(xì)菌抗原和免疫原性片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-24的任一項(xiàng)的細(xì)菌細(xì)胞制造活疫苗的用途。
34.權(quán)利要求33的用途，用于制造免疫缺陷對(duì)象所用的疫苗。
35.權(quán)利要求34的用途，用于制造遭受HIV感染的對(duì)象所用的疫苗。
36.權(quán)利要求33的用途，用于制造腫瘤疫苗。
37.權(quán)利要求36的用途，用于制造針對(duì)表淺膀胱癌的疫苗。
38.權(quán)利要求33的用途，用于制造獸醫(yī)領(lǐng)域的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型重組疫苗，它提供針對(duì)結(jié)核病的免疫保護(hù)。另外，本發(fā)明還涉及新的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、用所述核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和由所述核酸分子編碼的多肽。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1798762SQ200480010664
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月23日
發(fā)明者L·格羅德, S·H·E·考夫曼, B·勞帕赫, J·赫斯 申請(qǐng)人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)