專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫球蛋白制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的濃縮蛋白質(zhì)或抗體制劑，例如那他珠單抗(natalizumab)制劑，其中抗體保持活性并且也可以小容量用藥，需要時(shí)可以給予不同體重的受治療者。
背景技術(shù)：
抗體和蛋白質(zhì)制劑本領(lǐng)域通曉。然而制備化學(xué)和生物學(xué)都穩(wěn)定的蛋白質(zhì)制劑如抗體制劑卻充滿(mǎn)了挑戰(zhàn)。制備不僅穩(wěn)定而且甚至隨著蛋白質(zhì)濃度的增加仍能保持小容量的制劑(即便于小容量注射)，例如抗體，仍屬疑難。確實(shí)需要這種制劑。例如在固定的容量中含有濃縮而穩(wěn)定的蛋白質(zhì)就特別有益于不同體重的患者。如果給不同體重的患者用液體藥物，那么也許會(huì)產(chǎn)生例如相反的作用。開(kāi)發(fā)這類(lèi)制劑受蛋白質(zhì)或抗體它們自身的妨礙，而蛋白質(zhì)和抗體因高度趨向聚集和沉淀，又妨礙了這類(lèi)制劑的開(kāi)發(fā)。
發(fā)明概要因此，盡管從前已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，仍然還有必要改進(jìn)蛋白質(zhì)和/或抗體的配制方法。同時(shí)也需要高濃度抗體或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定制劑，其中抗體或蛋白質(zhì)仍保持活性。還需要維持固定容量的濃縮蛋白質(zhì)的穩(wěn)定制劑。申請(qǐng)人在此所公開(kāi)的穩(wěn)定組合物，可進(jìn)一步用來(lái)制備抗體制劑，特別是高濃度的抗體制劑，當(dāng)貯藏在建議的溫度時(shí)，既不沉淀又穩(wěn)定。高濃縮和穩(wěn)定的抗體制劑非常有助于醫(yī)師治療不同體重的患者。
本發(fā)明一方面提供穩(wěn)定的水性藥物制劑，其包含免疫球蛋白(或其他蛋白)、磷酸鹽緩沖液、聚山梨酯和氯化鈉。聚山梨酯優(yōu)選聚山梨酯80，優(yōu)選含量介于約0.001％至約2.0％(w/v)之間。最優(yōu)選聚山梨酯的含量約為0.02％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑中免疫球蛋白或其他蛋白的含量約0.1mg/ml至約200mg/ml。優(yōu)選制劑的緩沖pH值約3.0至約7.0，最優(yōu)選約6.0±0.5。優(yōu)選制劑是等滲的。該制劑還可以包含組氨酸。優(yōu)選組氨酸為L(zhǎng)-組氨酸。
本發(fā)明的另一方面，上述制劑的免疫球蛋白是抗α-4整聯(lián)蛋白抗體，例如那他珠單抗或另一種人源化抗體或單克隆抗體。這種抗體可以是標(biāo)準(zhǔn)量或是濃縮量，例如約15mg/ml或更多。優(yōu)選那他珠單抗的含量約20mg/ml至約150mg/ml。在這種制劑濃度約為15mg/ml或更多的情況下，該制劑保持固定的容量，例如約為125ml。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用治療量的免疫球蛋白治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括給予所述患者上述和在此所描述的制劑，其中所述疾病通過(guò)給予所述制劑進(jìn)行治療。本發(fā)明的又一方面，所述疾病是由α-4整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的病癥，并且在這種疾病中，免疫球蛋白是能識(shí)別α-4整聯(lián)蛋白并與之結(jié)合的蛋白，例如那他珠單抗。
本發(fā)明的再一方面提供一種包含磷酸鈉、聚山梨酯、蛋白質(zhì)和NaCl、pH6.0±0.5的組合物，當(dāng)該組合物長(zhǎng)期貯藏在5℃至8℃的溫度時(shí)是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的另一方面提供一種制備穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的方法，所述方法包括將磷酸鈉、氯化鈉、聚山梨酯和蛋白質(zhì)混合，并用磷酸調(diào)節(jié)混合物的pH值至約pH6.0±0.5。
蛋白質(zhì)可以在本發(fā)明制劑中被凍干。聚山梨酯優(yōu)選聚山梨酯80，含量約為0.02％(w/v)，而蛋白質(zhì)優(yōu)選那他珠單抗。該制劑還可包含組氨酸。
優(yōu)選蛋白質(zhì)在含5mM組氨酸、20mg/ml蔗糖和0.02％聚山梨酯80、pH 6的溶液中被凍干，而蛋白質(zhì)是那他珠單抗，濃度為20mg/ml。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品包括容納上述及在此所述的穩(wěn)定制劑的容器。
本發(fā)明的另一方面是提供一種治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括同時(shí)或序貫給予所述患者治療上聯(lián)合有效的上述和在此所述的制劑與治療疾病有效的化合物或療法。
本發(fā)明的再一方面是提供在此所述的任一穩(wěn)定制劑在制備用于治療疾病的藥物中的用途，其中所述藥物對(duì)于治療所述疾病是有效的。所述藥物還可以包括治療所述疾病的第二種化合物或療法。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述1.定義術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指包括但不限于免疫球蛋白、酶、受體及其片段。雖然制劑的論述主要涉及的是抗體或免疫球蛋白，但所公開(kāi)的制劑中其他蛋白質(zhì)可考慮相互替換。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”是指包括但不限于抗體和抗體片段(例如scFv、Fab、Fc、F(ab′)2)，以及抗體的其他基因工程部分。根據(jù)它們的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類(lèi)別。免疫球蛋白主要有五類(lèi)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的一些還可進(jìn)一步分為亞類(lèi)(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類(lèi)別的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)分別稱(chēng)為alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，不同類(lèi)別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。優(yōu)選，免疫球蛋白識(shí)別α-4整聯(lián)蛋白并與之相結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“抗體”是廣義上的概念，具體包括單克隆抗體(包括激動(dòng)劑抗體和拮抗劑抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物和抗體片段(例如Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)，只要它們具有所需的生物活性即可?！翱贵w”意指包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、靈長(zhǎng)類(lèi)抗體和基因工程生產(chǎn)的其他抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體群體中所獲得的抗體，即群體中的各個(gè)抗體是相同的，除非可能發(fā)生自然突變，其量甚微。單克隆抗體是高度特異性的，只針對(duì)單一抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，多克隆抗體通常包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體，而每個(gè)單克隆抗體只針對(duì)抗原上的一個(gè)決定簇。除特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)還在于能通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)合成，而不被其他免疫球蛋白污染。例如，所使用的本發(fā)明單克隆抗體可在山羊中表達(dá)，參見(jiàn)Behboodi等(2002)Transgenic cloned goats and the production of therapeuticproteins.載于Principles of Cloning.Elsevier Science(USA)；和Meade等(1999).Expression of recombinant proteins in the milk of transgenicanimals in Gene expression systemsusing nature for the art of expression.J.M.Fernandez和J.P.Hoeffler編著，Academic Press。修飾詞“單克隆”是指從基本上均一的抗體群體中所獲得的抗體的特征，而不得解釋為需要用任何特殊的方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如所使用的本發(fā)明單克隆抗體可以通過(guò)以下文獻(xiàn)中介紹的方法來(lái)生產(chǎn)Shepherd等，MonoclonalAntibodiesA Practical Approach(Oxford University Press，2000)。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”也包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗體中的重鏈和/或輕鏈部分與源于具體物種或者屬于具體抗體類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與源于另一物種或者屬于另一抗體類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體以及這些抗體片段的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們具有所需的生物活性即可。例如，與α-4整聯(lián)蛋白結(jié)合的能力?！皢慰寺】贵w”也可從噬菌體抗體文庫(kù)分離得到，例如采用以下文獻(xiàn)中介紹的技術(shù)Clackson等，1991Nature352624-628和Marks等，1991 J.Mol.Biol.，222581-597。非人(例如鼠、兔、牛、馬、豬等)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其含有最少量源自非人免疫球蛋白的序列。絕大部分人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中的受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔子具有的所需特異性、親和性和容量的CDR殘基所取代。在某些情況下，人免疫球蛋白Fv構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。此外，人源化抗體可以包含的殘基既不出現(xiàn)在受體抗體內(nèi)也不出現(xiàn)在輸入CDR或構(gòu)架序列中。這些修飾可進(jìn)一步精修和優(yōu)化抗體的性能。一般而言，人源化抗體基本上都會(huì)包含至少一個(gè)可變區(qū)、典型為2個(gè)可變區(qū)，其中全部或幾乎全部CDR區(qū)都與非人免疫球蛋白的那些區(qū)相對(duì)應(yīng)，并且全部或幾乎全部的FR區(qū)都與人免疫球蛋白共有序列的那些區(qū)相對(duì)應(yīng)。人源化抗體最宜至少也包含部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型是人免疫球蛋白恒定區(qū)。
通用術(shù)語(yǔ)“抗體”也包含“線(xiàn)性抗體”，是一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線(xiàn)性抗體可以是雙特異性或者是單特異性的。
“變異抗體”(通用術(shù)語(yǔ)“抗體”也涵蓋)是氨基酸序列不同于“親代”抗體的氨基酸序列的分子，這是由于添加、缺失和/或取代了親代抗體序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所致。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體包括在親代抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代。例如，變體可以在親代抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中至少有一個(gè)取代，例如，約1個(gè)至約10個(gè)，優(yōu)選約2個(gè)至約5個(gè)。通常，變體的氨基酸序列與親代抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)序列的氨基酸序列同一性為至少75％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，還更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％。該序列的同一性或同源性在本文定義為候選序列的氨基酸殘基與親代抗體殘基相同的百分率，是在將序列進(jìn)行比對(duì)，必要時(shí)引入空位以達(dá)到序列同一性的最大百分率后獲得的。無(wú)論是N-端、C-端還是內(nèi)部延伸、缺失、插入抗體序列都不會(huì)影響序列的同一性或同源性。
為了分析這些性質(zhì)，人們應(yīng)當(dāng)將變體的Fab形式與親代抗體的Fab形式或?qū)⒆凅w的全長(zhǎng)形式與親代抗體的全長(zhǎng)形式進(jìn)行比較，例如，因?yàn)槿藗円呀?jīng)發(fā)現(xiàn)在此所公開(kāi)的生物活性試驗(yàn)中，抗體的形態(tài)影響它們的活性。特別值得注意的變體抗體是，當(dāng)與親代抗體比較時(shí)，生物活性提高至少約10倍，優(yōu)選提高至少約20倍，最優(yōu)選提高至少約50倍?！坝H代”抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的抗體。優(yōu)選，親代抗體具有人構(gòu)架區(qū)，并且具有人抗體恒定區(qū)。例如，親代抗體可以是人源化抗體或是人抗體。
“分離的抗體”是指從其天然環(huán)境的組分中經(jīng)過(guò)鑒定和分離和/或回收的抗體。天然環(huán)境中的污染組分是干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體純化至(1)用Lowry方法測(cè)定，按重量計(jì)達(dá)95％以上抗體，最優(yōu)選達(dá)99％以上抗體；(2)通過(guò)轉(zhuǎn)杯測(cè)序列儀足以至少獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的15個(gè)殘基；或(3)在還原或非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮蘭或優(yōu)選銀染色達(dá)到均一性。由于抗體天然環(huán)境中至少一個(gè)組分不會(huì)出現(xiàn)，因此分離的抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體。然而，分離的抗體的制備通常至少經(jīng)過(guò)一個(gè)純化步驟。
“抗體片段”包含完整抗體的部分，通常為完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。例如，抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體；單鏈抗體分子；和抗體片段所形成的多特異性抗體?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH區(qū)和VL區(qū)，其中的這些區(qū)域以一種多肽鏈存在。一般而言，F(xiàn)v多肽還包括VH區(qū)和VH區(qū)間的多肽接頭，使sFv能形成所需的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。
術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指具有2個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包含同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變區(qū)(VL)相連的重鏈可變區(qū)(VH)。采用使同一鏈的兩個(gè)區(qū)域間因太短而無(wú)法配對(duì)的接頭，迫使這些區(qū)與另一鏈的互補(bǔ)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w給藥途徑需符合已知的方法并且是眾所周知的，例如可以包括注射或輸注，通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或損害內(nèi)途徑，或者通過(guò)持續(xù)釋放系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^(guò)輸注或快速濃注連續(xù)給予抗體。治療用抗體組合物一般放在有無(wú)菌入口處的容器內(nèi)，例如帶有一個(gè)能用皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈溶液袋或小瓶?！八幬锟山邮艿摹辟x形劑(例如載體、添加劑)是能合理地給主題哺乳動(dòng)物提供所用活性成分的有效劑量的那些物質(zhì)。“穩(wěn)定的”制劑是指貯藏時(shí)其中的蛋白質(zhì)基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性的制劑?！胺€(wěn)定的”也是指制劑沒(méi)有或基本沒(méi)有不穩(wěn)定的征兆，包括聚集和/或脫酰胺的制劑。例如當(dāng)本發(fā)明所提供的制劑貯藏在5-8℃的溫度時(shí)，能保持穩(wěn)定至少兩年。
本領(lǐng)域有測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的多種分析技術(shù)，有關(guān)綜述例如參見(jiàn)Peptide and Protein Drug Delivery，247-301(Vincent Lee編著，NewYork，N.Y.，1991)和Jones，1993 Adv.Drug Delivery Rev.1029-90。
用所提供的實(shí)例可以舉例說(shuō)明測(cè)定所述制劑在選定溫度下貯藏選定時(shí)間的穩(wěn)定性。穩(wěn)定制劑的貯藏時(shí)間，如果優(yōu)選至少6個(gè)月，則更優(yōu)選至少12個(gè)月，還更優(yōu)選12-18個(gè)月，最優(yōu)選2年或2年以上。
藥物制劑中的蛋白質(zhì)，如抗體或其片段，如果通過(guò)肉眼檢查其顏色和/或澄明度，或用紫外線(xiàn)散射或用大小排阻層析測(cè)定沒(méi)有顯示聚集、沉淀、脫酰胺和/或變性，則“保持了它的物理穩(wěn)定性”。
如果規(guī)定時(shí)間的化學(xué)穩(wěn)定性即是蛋白質(zhì)被認(rèn)為仍然保持著它的生物活性，那么蛋白質(zhì)在藥物制劑中就“保持著它的化學(xué)穩(wěn)定性”?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可以通過(guò)檢測(cè)并定量蛋白的化學(xué)改變形式進(jìn)行評(píng)價(jià)?；瘜W(xué)改變可以包括大小變化(例如剪切)，例如，其測(cè)定可以通過(guò)大小排阻層析、SDS-PAGE和/或襯質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI/TOF MS)。其他類(lèi)型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如脫酰胺時(shí)發(fā)生)，例如可通過(guò)離子交換層析測(cè)定。在藥物制劑制備時(shí)，如果在特定時(shí)間抗體的生物活性用例如抗原結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定，所顯示的生物活性約在10％以?xún)?nèi)(在試驗(yàn)誤差內(nèi))，那么可認(rèn)為抗體在藥物制劑中“保持著它的生物活性”。
“等滲的，，是指目標(biāo)制劑基本上與人的血液的滲透壓相同。等滲制劑的滲透壓通常約為250-350mOsm。例如，等滲性可用蒸氣壓或冰-凍型滲透壓力計(jì)測(cè)定。
本文所用的“緩沖液”是指通過(guò)酸·堿共軛組分的作用以防止pH改變的緩沖溶液。本發(fā)明緩沖液的pH范圍約3.0至約7.5；優(yōu)選pH約4.0至約7.0；更優(yōu)選pH約5.0至約6.5；最優(yōu)選pH約為6.0±0.5。上述范圍間的任一pH值都在考慮之中。
本發(fā)明中就藥理學(xué)意義而言，抗體的“治療有效量”是指治療上有效的抗體用于預(yù)防或治療失調(diào)時(shí)有效的抗體量?！笆д{(diào)”指用抗體或蛋白質(zhì)治療有益的任何疾病。這包括慢性和急性的失調(diào)或疾病，包括那些哺乳動(dòng)物易患的上述疾病。
“治療”是指治療性治療和預(yù)防措施兩者。需要治療者包括已經(jīng)患上失調(diào)的和需要預(yù)防失調(diào)的。
“防腐劑”是一種化合物，例如，該化合物可以含在制劑中用于顯著降低其中的細(xì)菌作用，因而有利于生產(chǎn)多用途的制劑。潛在的防腐劑的實(shí)例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基是長(zhǎng)鏈化合物)以及苯索氯銨。其他類(lèi)型的防腐劑包括芳族醇例如苯酚、丁醇和苯甲醇，對(duì)羥基苯甲酸烷基酯例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚。
“患者”或“受治療者”包括任何哺乳動(dòng)物。以治療為目的，“哺乳動(dòng)物”是指分類(lèi)學(xué)上是哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括但不限于人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、及動(dòng)物園動(dòng)物、體育場(chǎng)動(dòng)物或?qū)櫸锢绻贰ⅠR、貓、牛等等。哺乳動(dòng)物最好是人。
“Antegren”是指包括也稱(chēng)作AN100226(抗體代號(hào))或那他珠單抗(USAN名稱(chēng))的抗體。那他珠單抗是一種重組人源化抗α-4整聯(lián)蛋白抗體。優(yōu)選哺乳動(dòng)物待治療的疾病或病癥是當(dāng)給予治療有效劑量的那他珠單抗時(shí)得以調(diào)節(jié)的疾病或病癥。
“穩(wěn)定”是指制劑不顯示或基本不顯示不穩(wěn)定的征兆，包括聚集和/或脫酰胺。此外，“穩(wěn)定”也指制劑在指定條件下貯藏兩年或兩年以上沒(méi)有任何不穩(wěn)定的征兆。
2.概述在以下討論及隨后的實(shí)施例中，公開(kāi)了穩(wěn)定抗體制劑的配制，所公開(kāi)的某些穩(wěn)定制劑有高濃度的抗體，但保持固定的容量，這些制劑中的抗體是穩(wěn)定的，抗體不在溶液中沉淀或聚集。除抗體外，也可考慮蛋白質(zhì)為高濃度制劑。
給予受治療者(例如人)的典型抗體濃度約0.01mg/ml至約200mg/ml，更典型的是，抗體的濃度范圍約0.1mg/ml至約150mg/ml。然而，當(dāng)需要向患者提供更高濃度時(shí)，現(xiàn)有的例子例如約15mg/ml至約200mg/ml，優(yōu)選約15mg/ml至約150mg/ml，更優(yōu)選約20mg/ml至約50mg/ml，最優(yōu)選約20mg/ml以及中間的任何整數(shù)值。
需要用蛋白質(zhì)治療時(shí)，可按已知方法給予哺乳動(dòng)物所述抗體制劑。這些方法可以包括但不限于像快速濃注等靜脈注射或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注，通過(guò)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊柱內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口腔、局部或吸入途徑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈給藥給予哺乳動(dòng)物所述抗體制劑。
合適的蛋白質(zhì)劑量將取決于例如待治療的疾病、疾病的嚴(yán)重程度和病程、蛋白質(zhì)是用作預(yù)防目的還是治療目的、以前的治療、患者的臨床病史和對(duì)蛋白質(zhì)的反應(yīng)、所用蛋白質(zhì)的類(lèi)型以及主治醫(yī)生的自行處理能力。治療中可一次或連續(xù)向患者適當(dāng)施用蛋白質(zhì)，也可隨著診斷在任何時(shí)間向患者用藥。在治療疑難疾病時(shí)，蛋白質(zhì)也許是唯一的治療用藥或者和其他有用的藥物或療法聯(lián)合使用。當(dāng)兩種(或更多種)藥物同時(shí)用藥或單獨(dú)用藥，并且其用藥方式使得這些藥物將會(huì)同時(shí)起效時(shí)，則本文所用的兩種(或更多種)藥物被認(rèn)為是聯(lián)合用藥。
在實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，本發(fā)明的化合物可以單用或聯(lián)用，或與其他治療劑聯(lián)合使用。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可與其他化合物，即在一般醫(yī)療實(shí)踐中典型地用于治療這些疾病的那些化合物共同給藥。例如，本發(fā)明的制劑可與其他治療劑或物理療法聯(lián)合用藥以治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和節(jié)段性回腸炎(Crohn’s Disease)。
2.1抗體制劑的制備方法本方法可由技術(shù)人員進(jìn)行改變，但通常要遵守諸如下述的程序。從含有制備目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)中獲取安瓿。制備接種物。培養(yǎng)或發(fā)酵細(xì)胞必要時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料。通過(guò)離心和/或過(guò)濾從而收獲/澄清細(xì)胞。例如使用螺旋過(guò)濾濃縮細(xì)胞10倍可以做到這一點(diǎn)。先用0.2μm中間過(guò)濾隨后用A蛋白Sepharose Fast Flow(即親和層析)純化并且再反向洗脫。含有抗體的組合物然后在pH3.6-3.7接受處理。所得混合物再接受病毒過(guò)濾繼之通過(guò)濃縮/滲濾步驟。然后可以通過(guò)DEAE Sepharose Fast Flow(陰離子交換)純化組合物。這個(gè)步驟可進(jìn)行多次。從這時(shí)起，可進(jìn)一步濃縮組合物隨后用聚丙烯酰胺葡聚糖S300HR(即凝膠過(guò)濾層析)系統(tǒng)純化，其中所用的運(yùn)行緩沖液是磷酸鹽/NaCl。如有要求，含抗體的組合物可進(jìn)一步濃縮成高濃度制劑(例如20mg/ml或更高)。然后，含抗體的組合物進(jìn)一步緩沖并且通過(guò)添加0.02％(w/v)聚山梨酯80調(diào)節(jié)濃度。接著，用0.2μm濾器最后一次過(guò)濾該組合物，在這時(shí)候就可將其分裝到100ml至10L的聚丙烯瓶?jī)?nèi)。這樣的獲得的抗體或免疫球蛋白可以通過(guò)質(zhì)控(QC)檢驗(yàn)并且發(fā)放質(zhì)量保證書(shū)(QA)。
以那他珠單抗為例，如下示意上述步驟
2.2抗體制劑本發(fā)明的一方面，免疫球蛋白用10mM磷酸鈉、140mM NaCl(pH6.0±0.5)和0.02％聚山梨酯80配制，濃度約為1.7mg/ml、5.0mg/ml、10.0mg/ml、15.0mg/ml、20.0mg/ml、25.0mg/ml、30.0mg/ml、40.0mg/ml或50.0mg/ml。必要時(shí)用磷酸調(diào)pH至6.0±0.5。
不同制劑的一個(gè)實(shí)施例如下所示。
定量組合物磷酸鹽緩沖液制劑
最宜將上述任一制劑裝入無(wú)菌的小瓶中。例如，這些小瓶可以是I型EP中性玻璃小瓶(例如5.0ml或20ml小瓶)附有Helvoet PharmaV9145/FM 157/1灰色丁基橡膠塞和鋁密封。然而，也考慮用其他合適的無(wú)菌小瓶，例如，制劑可以如下裝瓶
更準(zhǔn)確地說(shuō)，例如按上述討論的程序所獲得的那他珠單抗，可如下裝瓶。200L和2000L那他珠單抗藥物產(chǎn)品可在配備了小瓶洗滌、滅菌和脫熱原管道的全自動(dòng)灌裝線(xiàn)上灌裝。塞子、密封和灌裝設(shè)備使用前需洗滌并滅菌。這個(gè)工藝可適應(yīng)2000L發(fā)酵所生產(chǎn)的容量的大規(guī)模操作。
必要時(shí)，可在10000級(jí)的車(chē)間調(diào)配制劑緩沖液，約10mM磷酸鹽、約140mM NaCl、pH6.0±0.5、約0.02％聚山梨酯80，并用于稀釋成批藥物產(chǎn)品至最終濃度。過(guò)濾前，濃度、pH和密度最好都符合工藝規(guī)范。
已配制的那他珠單抗或其他的免疫球蛋白通過(guò)0.2μm Millpak濾器過(guò)濾除菌后流入無(wú)菌中心內(nèi)部的不銹鋼涌浪調(diào)整槽內(nèi)。那他珠單抗從灌裝、加塞到加蓋為全自動(dòng)流程。收集成批滅菌的工藝中樣品；在灌裝操作全程，進(jìn)行灌裝重量和液面上空間的檢驗(yàn)。已灌裝的藥物產(chǎn)品在約2-8℃的溫度冷藏。
灌裝在充分驗(yàn)證的100級(jí)無(wú)菌中心內(nèi)部進(jìn)行。需認(rèn)證灌裝線(xiàn)所提供的灌裝量在所預(yù)期的5.0ml和20ml的灌裝量之內(nèi)。對(duì)灌裝操作全程進(jìn)行綜合環(huán)境監(jiān)測(cè)并檢查確認(rèn)始終符合這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。按季度進(jìn)行培養(yǎng)基無(wú)菌灌裝以支持無(wú)菌灌裝操作。
另一個(gè)辦法是，按照下述實(shí)施例將所生產(chǎn)的200L藥物裝瓶。使用前將小瓶、灌裝針頭、過(guò)濾系統(tǒng)和管道備好并滅菌。塞子可由供應(yīng)商準(zhǔn)備。灌裝前將塞子滅菌。
那他珠單抗藥物產(chǎn)品或其他蛋白質(zhì)隨該批組分制劑在半自動(dòng)灌裝線(xiàn)自動(dòng)灌裝，立即壓塞而后加蓋。這種操作適合小批量操作。
然后，將最后批量的溶液用0.2μm Millipak濾器在100級(jí)環(huán)境里過(guò)濾到一個(gè)無(wú)菌玻璃接受容器里。要進(jìn)行常規(guī)校正并且在工藝過(guò)程中核查以確保灌裝誤差保持在±2％以?xún)?nèi)。給小瓶立即加塞并加蓋。灌裝好的藥物產(chǎn)品最好貯藏于2-8℃的溫度下。
玻璃接受容器可為任何數(shù)量的小瓶，例如可以是5.0ml或20ml的中性玻璃小瓶，例如由Epsom Glass或AMILCO供應(yīng)的I型(EP)，或者是5.0ml或20ml USP I型硼硅酸鹽玻璃小瓶，例如由Kimble或Wheaton供應(yīng)的。任何適當(dāng)?shù)姆忾]方法均可用于這些小瓶。小瓶瓶塞包括但不限于13mm Helvoet Pharma V9145/FM 157/1灰色丁基橡膠塞或13mm和20mm Helvoet Pharma V9145/FM 157/1灰色丁基橡膠塞或者13mm或20mm West 4432/50灰色丁基橡膠塞。已加橡膠塞的裝瓶隨后最典型地用鋁密封，例如由West所制造的鋁密封進(jìn)行密封。
雖然本發(fā)明用下述實(shí)施例作了詳細(xì)描述，但是不用說(shuō)在不偏離本發(fā)明的精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改，并且這也是技術(shù)人員容易理解的。
實(shí)施例實(shí)施例1聚山梨酯80的選擇那他珠單抗的典型給藥方法是通過(guò)靜脈注射。靜脈用藥要求最終制劑是等滲的。開(kāi)始選擇5mg/mlAN100226制劑(那他珠單抗)、50mM L-組氨酸、150mM NaCl、pH6.0(制劑#1)。在II期研究中，將那他珠單抗稀釋并注入臨床給藥裝置時(shí)觀察到抗體中的蛋白質(zhì)沉淀。把聚山梨酯80摻入制劑(制劑#2)以消除觀察到的蛋白質(zhì)沉淀。優(yōu)選，本發(fā)明所用的聚山梨酯是低過(guò)氧化物，即Sigma公司的聚山梨酯，產(chǎn)品號(hào)P6479，批號(hào)071K7283。
已經(jīng)顯示加速AN100226抗體沉淀的兩個(gè)因素是微量的硅油和在氣-液介面上的變性。由于使用配備硅化橡皮塞的標(biāo)準(zhǔn)潤(rùn)滑的聚丙烯注射器，因而將硅油加入產(chǎn)品。在輕微振蕩和室溫儲(chǔ)藏時(shí)，所加入的硅油足以引起制劑#1中可識(shí)別的抗體沉淀。聚集、脫酰胺以及隨后在氣-液介面上的變性所引起的沉淀已經(jīng)成為向更多臨床點(diǎn)運(yùn)輸藥物的愈益明顯的疑難問(wèn)題。以0.02％(w/v)濃度添加聚山梨酯80已經(jīng)消除了造成蛋白質(zhì)沉淀的兩個(gè)因素。
在全部蛋白質(zhì)特性的檢測(cè)中，制劑#2顯示出與組氨酸/NaCl制劑(制劑#1)的相差不大的穩(wěn)定性。同時(shí)增加了在臨床調(diào)劑中藥品運(yùn)輸和裝卸時(shí)的穩(wěn)定性。
制劑中添加聚山梨酯80也克服了制備高蛋白含量制劑時(shí)抗體沉淀或聚集的難題。初期的工作集中在高蛋白質(zhì)濃度時(shí)振蕩誘發(fā)聚集，包括50mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。將物料經(jīng)受渦旋型混合器攪拌，然后用大小排阻層析-高效液相層析(SEC-HPLC)檢測(cè)聚集的種類(lèi)。這個(gè)模型證實(shí)了聚山梨酯80是有效的聚集抑制劑，而蔗糖和其他的緩沖組分幾乎沒(méi)有有益的效應(yīng)。
向各小瓶那他珠單抗(批號(hào)AN100226-0003)中添加10μl 10％的聚山梨酯80溶液以評(píng)定在蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml時(shí)添加0.02％(w/v)聚山梨酯80防止振蕩誘發(fā)沉淀的有效性。將這些小瓶與旁邊的幾個(gè)制劑#1的那他珠單抗小瓶一起以每分鐘150轉(zhuǎn)在同一水平面上振蕩。室溫處理3小時(shí)，制劑#1的小瓶充滿(mǎn)顆粒并出現(xiàn)混濁，而添加了0.02％(w/v)聚山梨酯80的小瓶依然清澈且無(wú)顆粒。
由于長(zhǎng)時(shí)間振蕩灌滿(mǎn)AN100226但未添加聚山梨酯80的小瓶，并不形成另外的顆粒，因此所看到的聚集作用被認(rèn)為是空氣表面的介面所引起的。
對(duì)于0.02％(w/v)聚山梨酯80抑制由于微量硅所引起的蛋白質(zhì)沉淀的能力進(jìn)行評(píng)估。將一小瓶那他珠單抗(批號(hào)AN100226-0003)調(diào)至含0.02％(w/v)聚山梨酯80并注入市售的、已潤(rùn)滑的60ml聚丙烯注射器內(nèi)。將此物質(zhì)置室溫?cái)?shù)小時(shí)。肉眼檢查證實(shí)沒(méi)有產(chǎn)生沉淀。然后，將物料通過(guò)0.2μm濾器濾入5ml小瓶，數(shù)日后檢查發(fā)現(xiàn)基本上沒(méi)有顆粒，而沒(méi)有添加聚山梨酯80(制劑#1)并以同樣方式處理的小瓶充滿(mǎn)顆粒。
實(shí)施例2磷酸鹽緩沖液的選擇當(dāng)檢定組氨酸安慰劑(含0.02％w/v聚山梨酯80)時(shí)，測(cè)到了新的微量雜質(zhì)。這些雜質(zhì)因聚山梨酯80的降解而產(chǎn)生，明顯是由于金屬離子和組氨酸的氧化反應(yīng)。就活性的那他珠單抗藥物產(chǎn)品而言，只有在高溫(例如25℃和40℃)貯藏后才檢測(cè)出這些微量雜質(zhì)。因此，決定改變安慰劑，用磷酸鹽代替緩沖液中的組氨酸。用于產(chǎn)品安慰劑的組氨酸的批次與用活性那他珠單抗藥物產(chǎn)品的批次AN100226-004和AN100226-005是不同的。組氨酸來(lái)源對(duì)聚山梨酯80降解作用的影響在下面作更詳細(xì)討論。
當(dāng)檢測(cè)安慰劑時(shí)，在組氨酸/NaCl/0.02％(w/v)聚山梨酯80安慰劑(制劑#2)中檢測(cè)出微量雜質(zhì)。通過(guò)低波長(zhǎng)紫外線(xiàn)區(qū)的吸光度測(cè)到這些雜質(zhì)。在5℃、25℃和40℃的溫度貯藏安慰劑一個(gè)月，可以測(cè)定200至400nm的吸收譜。這些數(shù)據(jù)表明雜質(zhì)因溫度的變化而增加。
對(duì)用于監(jiān)測(cè)抗體聚集作用的大小排阻層析-高效液相層析(SEC-HPLC)進(jìn)行改進(jìn)以提高檢測(cè)微量雜質(zhì)的靈敏度，提高柱子的裝量5倍達(dá)100μl，使用未稀釋的樣品而非10倍稀釋的樣品。此外，在260nm監(jiān)測(cè)到的吸光度反映了雜質(zhì)的最大吸收值，該方法為評(píng)定安慰劑和產(chǎn)品中的這些微量雜質(zhì)提供了一種工具，而抗體在洗脫譜中的出現(xiàn)要早得多。
用上述的SEC-HPLC方法分析制劑#1和#2所配制的安慰劑和最終的那他珠單抗藥物產(chǎn)品。正好在層析前對(duì)添加了聚山梨酯80至0.02％(w/v)的制劑中的安慰劑進(jìn)行分析。這顯示了沒(méi)有微量雜質(zhì)時(shí)聚山梨酯80、組氨酸和鹽的紫外吸光度。16分鐘時(shí)的寬峰與聚山梨酯80有關(guān)，而約在26-27分鐘的峰則歸于組氨酸和鹽。將組氨酸/NaCl/0.02％(w/v)聚山梨酯80安慰劑(制劑#2)于5℃的溫度貯藏2個(gè)月，顯示出后期的洗脫峰明顯增加，這意味著聚山梨酯80與這些雜質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。此外，16分鐘時(shí)的洗脫峰的消失，表明聚山梨酯80已經(jīng)降解。
正好在層析前加入聚山梨酯80％至0.02％(w/v)之后，對(duì)在5℃的溫度下作為成批藥物貯藏了約5個(gè)月的制劑#1中的AN100226進(jìn)行分析。應(yīng)用這些超載的條件在16-18分鐘時(shí)洗脫抗體。冼脫譜的其余部分與加有聚山梨酯80的安慰劑相類(lèi)似。也通過(guò)此法分析那他珠單抗批號(hào)#AN100226-0004的兩個(gè)月穩(wěn)定性的樣品。貯藏于5℃溫度下的那他珠單抗樣品的洗脫譜沒(méi)有任何額外的峰，在26-27分鐘的組氨酸/鹽峰是類(lèi)似的水平。25℃兩個(gè)月的樣品檢測(cè)出有微量雜質(zhì)，40℃兩個(gè)月的樣品雜質(zhì)增多。因此，在貯藏于5℃溫度下的臨床用品中沒(méi)有檢測(cè)出這些雜質(zhì)。這些雜質(zhì)在安慰劑中比在那他珠單抗中更易出現(xiàn)。
為了避免安慰劑中形成這些雜質(zhì)，在安慰劑制劑中用無(wú)機(jī)緩沖組分代替組氨酸。臨床試驗(yàn)中的安慰劑是含0.02％(w/v)聚山梨酯80、pH6的無(wú)菌等滲磷酸鹽緩沖液。已經(jīng)證實(shí)用磷酸鹽代替組氨酸顯著地降低了聚山梨酯80的降解速率。用大小排阻層析-高效液相層析(SEC-HPLC)在260nm對(duì)在60℃的溫度零時(shí)和3天后的100μl的磷酸鹽/NaCl/0.02％(w/v)聚山梨酯80安慰劑制劑進(jìn)行了分析。這樣保溫的結(jié)果是SEC-HPLC的層析譜幾乎沒(méi)有改變。而組氨酸/NaCl/0.02％(w/v)聚山梨酯80制劑在60℃的溫度只有兩天，其SEC-HPLC層析譜就明顯有與聚山梨酯80降解有關(guān)的微量雜質(zhì)。這些數(shù)據(jù)證明，用磷酸鹽代替安慰劑制劑中的組氨酸明顯阻止了聚山梨酯80的降解。
實(shí)施例3聚山梨酯80和組氨酸聯(lián)用的那他珠單抗制劑這些微量雜質(zhì)的生成機(jī)制被認(rèn)為是金屬催化聚山梨酯的氧化(參見(jiàn)Donbrow等，1978 J.Pharmaceutical Sciences，67(12)28)。Donbrow描述了不同類(lèi)型的聚山梨酯(例如聚山梨酯20)貯藏時(shí)的自動(dòng)氧化。光、溫度和金屬離子也會(huì)影響自動(dòng)氧化。Donbrow等(1978)。業(yè)已證實(shí)以明顯的速率進(jìn)行這種反應(yīng)需要組氨酸和聚山梨酯80兩者。Ajinomoto是用于制劑的唯一的組氨酸來(lái)源。然而已經(jīng)觀察到Ajinomoto公司所供應(yīng)的各批之間的反應(yīng)速率有明顯差異。
在加速反應(yīng)中起作用的另一個(gè)因子是金屬的存在。通過(guò)在含有50mM組氨酸(批號(hào)R016A008)和2％(w/v)聚山梨酯80的玻璃容器內(nèi)，以60℃的溫度反應(yīng)五天證實(shí)了這一點(diǎn)。在這些條件下，這一批組氨酸生成最少的微量雜質(zhì)。然后分別在三個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)(1)第一個(gè)容器作為對(duì)照；(2)第二個(gè)容器中加個(gè)灰色丁基容器塞；(3)第三個(gè)容器中加一個(gè)不銹鋼針頭。在60℃的溫度下進(jìn)行這些反應(yīng)4天并從200-400nm進(jìn)行紫外掃描分析。在此期間有不銹鋼針頭的反應(yīng)進(jìn)一步增進(jìn)。
實(shí)施例4雜質(zhì)的評(píng)估-小鼠單劑量極限試驗(yàn)用小鼠單劑量極限試驗(yàn)評(píng)估了這些雜質(zhì)的潛在毒性。使用在40℃溫度下貯藏了六周的制劑#2中的組氨酸安慰劑和那他珠單抗樣品，因?yàn)檫@些樣品提供大量的雜質(zhì)。這些雜質(zhì)不曾有毒性的征兆。非臨床部門(mén)提供了初步數(shù)據(jù)。
檢測(cè)了用于小鼠單劑量極限試驗(yàn)的100μL注射樣品的SEC-HPLC層析譜。在分析前將制劑#1中的那他珠單抗樣品摻混聚山梨酯80，20分鐘后幾乎沒(méi)有260nm的洗脫吸收物質(zhì)。在34分鐘時(shí)未添加聚山梨酯80的這批那他珠單抗中可以發(fā)現(xiàn)洗脫峰，因此表明聚山梨酯80沒(méi)有降解。相反，在40℃溫度下貯藏了六周的制劑#2的安慰劑全部降解，曲線(xiàn)下總面積是12.8×106μV·秒。在40℃溫度下貯藏了六周的制劑#2的那他珠單抗樣品很少完全降解。分析證實(shí)在40℃溫度下貯藏以及用于小鼠單劑量極限試驗(yàn)的樣品充滿(mǎn)了降解的聚山梨酯80。
實(shí)施例5確定雜質(zhì)的規(guī)格為了判斷部分降解的聚山梨酯80是否仍然能夠防止抗體的聚集，在有針頭時(shí)將制劑#2加熱至60℃的溫度三天使全部聚山梨酯80轉(zhuǎn)化為最大量的雜質(zhì)。經(jīng)SEC和反相HPLC證實(shí)此反應(yīng)已將全部的聚山梨酯80降解。該物質(zhì)用制劑#2的10mg/ml AN100226溶液進(jìn)行一比一的稀釋獲得含0.01％(w/v)聚山梨酯80和50％最大降解量的聚山梨酯80的溶液。用振蕩和硅化注射器處理這些抗體溶液數(shù)小時(shí)；防止了抗體的聚集。用同樣條件處理的不含聚山梨酯80的對(duì)照樣品顯示出明顯的沉淀。
從這些工作可以得出結(jié)論，只要聚山梨酯80的降解沒(méi)有超過(guò)50％，那么這種物質(zhì)就提供了防止抗體聚集的合適環(huán)境。
雖然在活性藥物產(chǎn)品中聚山梨酯很少降解，但是仍然進(jìn)行了等電聚焦(IEF)圖形的監(jiān)測(cè)，證實(shí)此制劑沒(méi)有危害抗體。對(duì)在5℃、25℃和40℃的溫度下貯藏6周的穩(wěn)定性時(shí)間測(cè)試點(diǎn)的IEF圖譜進(jìn)行了檢測(cè)。5℃和25℃的兩種樣品與參照標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)，蛋白質(zhì)的總電荷無(wú)任何改變的跡象。無(wú)論有或無(wú)聚山梨酯80的液體制劑中，40℃的樣品轉(zhuǎn)換為這種產(chǎn)品特有的更酸的種類(lèi)。
為了確定聚山梨酯80的降解程度和SEC-HPLC峰面積間的關(guān)系，對(duì)聚山梨酯80從0至50％的6種降解濃度的稀釋系列進(jìn)行評(píng)定。將有針頭的制劑#2加熱至60℃的溫度3天，經(jīng)SEC和反向HPLC證實(shí)100％降解。然后用制劑#1中成批純化的AN100226稀釋反應(yīng)混合物，新加0.02％(w/v)聚山梨酯80，并且用SEC-HPLC分析。監(jiān)測(cè)260nm的SEC層析譜。
用大約24分鐘后吸收譜總的積分峰面積作為聚山梨酯80降解速率的函數(shù)繪制這系列稀釋所得數(shù)據(jù)的圖形(μV·秒)。此圖表明少于5×106μV·秒的面積代表著約50％的聚山梨酯80的損耗變成的降解產(chǎn)物。所添加的已氧化的聚山梨酯80數(shù)量和層析后期洗脫峰的峰面積成正相關(guān)。
根據(jù)小鼠單劑量極限試驗(yàn)、聚山梨酯80降解50％時(shí)的抗體溶解度數(shù)據(jù)，和聚山梨酯80降解程度的估計(jì)已經(jīng)確定了那他珠單抗中微量雜質(zhì)的初步極限。正在進(jìn)行的穩(wěn)定性計(jì)劃包含這個(gè)方法，并且已經(jīng)確定了極限。如果用組氨酸緩沖液制備另一些批次，那么這些極限在驗(yàn)收時(shí)也適用。
極限大約24分鐘后各峰曲線(xiàn)下總面積不超過(guò)4×106μV·秒。
實(shí)施例61.7mg/ml那他珠單抗制劑1.7mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP
8.2mg氯化鈉，USP0.2mg聚山梨酯80，NF用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例75.0mg/ml那他珠單抗制劑5.0mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP8.2mg氯化鈉，USP0.2mg聚山梨酯80，NF用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例820mg/ml那他珠單抗制劑20.0mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP8.2mg氯化鈉，USP0.2mg聚山梨酯80，NF用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例950.0mg/ml那他珠單抗制劑50.0mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP8.2mg氯化鈉，USP0.2mg聚山梨酯80，NF
用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例105.0mg/ml那他珠單抗制劑50.0mg那他珠單抗140mM NaCl0.02％聚山梨酯80(w/v)10mM磷酸鈉用磷酸調(diào)pH至6.0±0.5。最優(yōu)選制劑的貯藏溫度介于約5℃-約8℃之間。
實(shí)施例1110mg/ml那他珠單抗制劑10.0mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP8.2mg氯化鈉，USP0.2mg聚山梨酯80，NF用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例1210mg/ml那他珠單抗制劑10.0mg那他珠單抗1.4mg磷酸鈉，USP8.2mg氯化鈉，USP0.1mg聚山梨酯80，NF用磷酸(NF)調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至1ml。優(yōu)選貯藏溫度介于5℃-8℃之間。
實(shí)施例1320mg/ml那他珠單抗制劑20.0mg那他珠單抗140mMNaCl0.02％聚山梨酯80(w/v)10mM磷酸鈉用磷酸調(diào)pH至6.0±0.5。加適量至125ml。最優(yōu)選制劑的貯藏溫度介于約5℃至約8℃之間。
實(shí)施例15凍干的那他珠單抗制劑另一些20-200mg/ml的高濃度抗體的液體制劑，可由磷酸鹽或其他合適的緩沖劑(例如組氨酸、檸檬酸鹽、醋酸鹽或琥珀酸鹽)組成，濃度范圍介于2-50mM，提供pH值介于3.0-7.0的緩沖范圍。最優(yōu)選的pH是6.0±0.5。多元醇(例如山梨醇和甘露醇)、雙糖(例如蔗糖或海藻糖)和氨基酸(例如甘氨酸)可以按不同數(shù)量隨氯化鈉添加以維持穩(wěn)定性并提供等滲溶液。應(yīng)用表面活性劑聚山梨酯，但不限于此，當(dāng)在0.001-2％之間的范圍使用時(shí)增加了穩(wěn)定性。為了制備液體制劑，在有約0.06％聚山梨酯80、pH6.0的10mM磷酸鈉、140mM氯化鈉中將那他珠單抗?jié)饪s至65mg/ml。所得溶液呈乳白色但無(wú)顆粒。經(jīng)過(guò)SEC樣品含99％以上的單體，無(wú)高分子量聚集物或低分子量的種類(lèi)。
提供穩(wěn)定的凍干藥物制劑。因?yàn)榱姿猁}緩沖液冷凍時(shí)pH會(huì)發(fā)生改變，所以有必要用不同的緩沖劑代替磷酸鹽。此種緩沖劑可以由組氨酸、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽組成，它們?cè)趐H3.0-7.0范圍內(nèi)具有有效的緩沖能力，最優(yōu)選的范圍是pH6.0±0.5。
為了防凍和防溶有必要使用多元醇(例如甘露醇)和糖(例如蔗糖)。這些多元醇可以單獨(dú)使用或合用以提供穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)張力。此外，用10-1000mM的氨基酸(例如甘氨酸)可以防止聚集作用。
為了凍干前和重建后的穩(wěn)定性同時(shí)為了更短的重建時(shí)間，可用0.001％至2％的表面活性劑，例如聚山梨酯或泊洛沙姆。
按照最后的純化步驟，可以用超濾進(jìn)行濃縮和滲濾進(jìn)行緩沖液交換來(lái)配制蛋白質(zhì)。也可用柱層析進(jìn)行緩沖液交換來(lái)配制蛋白質(zhì)。這些技術(shù)也可以結(jié)合使用。
此外，以低于所需的蛋白質(zhì)和賦形劑的濃度灌裝并以較小的容量重建，可以獲得最終所需的蛋白質(zhì)濃度。例如，40mg/ml溶液的注入容量是2.5ml，隨后用1ml重建以獲得100mg/ml溶液。
例如，將那他珠單抗以20mg/ml濃度在含5mM組氨酸、20mg/ml蔗糖和0.02％聚山梨酯80、pH6溶液中凍干。將5ml溶液注入10ml硼硅玻璃小瓶?jī)?nèi)并裝上灰色丁基橡膠凍干塞。用Virtis Gensis型凍干機(jī)凍干。產(chǎn)品在-60℃的盤(pán)架溫度凍10小時(shí)，然后將盤(pán)架溫度升至-40℃。在-10℃的盤(pán)架溫度和100mTorr的內(nèi)腔壓力下初步干燥20個(gè)小時(shí)。在25℃的盤(pán)架溫度和100mTorr的內(nèi)腔壓力時(shí)10個(gè)小時(shí)完成二次干燥。在真空中給小瓶加塞。
然后，將小瓶用1ml無(wú)菌WFI重建得到含有100mg/ml那他珠單抗的制劑。凍干后以及以?xún)龈尚问皆?0℃的溫度貯藏兩周立即分析樣品。兩種情況下立即重建。重建溶液清澈、無(wú)色、沒(méi)有顆粒物質(zhì)存在。通過(guò)SEC樣品含有99％以上的單體，沒(méi)有高分子量聚集物或低分子量的種類(lèi)。在40℃的溫度下貯藏兩周后，相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)(規(guī)格80-125％)樣品顯示出94％的效能。
本申請(qǐng)中所有引用的專(zhuān)利和出版物，都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的水性藥物制劑，所述藥物制劑包含免疫球蛋白、磷酸鹽緩沖液、聚山梨酯和氯化鈉。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中所述聚山梨酯80的含量約0.001％至約2.0％(w/v)。
4.權(quán)利要求3的制劑，其中所述聚山梨酯80的含量約為0.02％(w/v)。
5.權(quán)利要求1的制劑，其中所述免疫球蛋白的含量約0.1mg/ml至約200mg/ml。
6.權(quán)利要求5的制劑，其中所述免疫球蛋白的含量約為1.7mg/ml。
7.權(quán)利要求5的制劑，其中所述免疫球蛋白的含量約為5mg/ml。
8.權(quán)利要求5的制劑，其中所述免疫球蛋白的含量約為20mg/ml。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的制劑，其中所述制劑的pH約3.0至約7.0。
10.權(quán)利要求9的制劑，其中其pH為約5.5至約6.5。
11.權(quán)利要求10的制劑，其中其pH約為6.0±0.5。
12.權(quán)利要求1的制劑，其中所述制劑是固定容量，所述免疫球蛋白的含量約為50mg/ml。
13.權(quán)利要求12的制劑，其中所述免疫球蛋白結(jié)合α-4整聯(lián)蛋白。
14.權(quán)利要求13的制劑，其中所述免疫球蛋白是那他珠單抗。
15.權(quán)利要求1的制劑，其中所述磷酸鹽緩沖液的pH為6.0±0.5，所述聚山梨酯是聚山梨酯80，并且其含量約為0.02％(w/v)，所述免疫球蛋白是那他珠單抗，其中所述制劑在約2℃至約8℃的溫度時(shí)至少穩(wěn)定六個(gè)月。
16.權(quán)利要求15的制劑，其中那他珠單抗的含量約20mg/ml至約150mg/ml。
17.權(quán)利要求1的制劑，其中所述制劑是等滲的。
18.權(quán)利要求1-14或17中任一項(xiàng)的制劑，其中所述免疫球蛋白是單克隆抗體。
19.權(quán)利要求18的制劑，其中所述單克隆抗體是那他珠單抗。
20.權(quán)利要求18-19中任一項(xiàng)的制劑，其中所述抗體的含量約0.1mg/ml至約200mg/ml。
21.權(quán)利要求19的制劑，其中所述抗體的含量約1mg/ml至約150mg/ml。
22.權(quán)利要求21的制劑，其中所述抗體的含量約為1.7mg/ml或約為50mg/ml。
23.權(quán)利要求18的制劑，其中所述抗體的含量約為15mg/ml至約50mg/ml。
24.權(quán)利要求18的制劑，其中所述抗體的含量約為20mg/ml。
25.權(quán)利要求1的制劑，其中所述制劑還包含組氨酸。
26.權(quán)利要求25的制劑，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。
27.一種使用治療量的免疫球蛋白治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括給予所述患者權(quán)利要求1的制劑，其中所述疾病通過(guò)給予所述制劑進(jìn)行治療。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述免疫球蛋白是那他珠單抗。
29.一種包含磷酸鈉、聚山梨酯、蛋白質(zhì)和NaCl且pH為6.0±0.5的組合物，其中所述組合物當(dāng)在約5℃至約8℃貯藏時(shí)保持穩(wěn)定超過(guò)六個(gè)月。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80并且其含量約0.001％至約2.0％(w/v)。
31.權(quán)利要求29的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是免疫球蛋白并且其含量約0.01mg/ml至約200mg/ml。
32.權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80并且其含量約為0.02％(w/v)，NaCl的含量為150mM，磷酸鹽緩沖液的含量為10mM，所述免疫球蛋白是那他珠單抗并且其含量為1.7mg/ml、5mg/ml、20mg/ml或50mg/ml。
33.一種制備穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的方法，所述方法包括將磷酸鈉、氯化鈉、聚山梨酯和蛋白質(zhì)混合，并用磷酸將所得混合物的pH調(diào)至約pH 6.0±0.5。
34.權(quán)利要求33的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中磷酸鈉的含量約為10mM，氯化鈉的含量約為150mM，所述聚山梨酯是聚山梨酯80并且其含量約為0.02％(w/v)，所述蛋白質(zhì)是那他珠單抗。
35.權(quán)利要求33的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中那他珠單抗的含量約20mg/ml至約200mg/ml。
36.權(quán)利要求35的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中那他珠單抗的含量約為150mg/ml。
37.權(quán)利要求33的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)在權(quán)利要求1的制劑中被凍干。
38.權(quán)利要求37的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80并且其含量約為0.02％(w/v)，所述蛋白質(zhì)是那他珠單抗。
39.權(quán)利要求37的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中所述制劑還包含組氨酸。
40.權(quán)利要求33的穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)制劑的制備方法，其中所述蛋白質(zhì)在含5mM組氨酸、20mg/ml蔗糖和0.02％聚山梨酯80、pH6的溶液中被凍干，并且其中所述蛋白質(zhì)是濃度為20mg/ml的那他珠單抗。
41.一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括容納權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的穩(wěn)定制劑的容器。
42.一種治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括同時(shí)或序貫給予所述患者治療上聯(lián)合有效的權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的制劑與治療疾病有效的化合物或療法。
43.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的穩(wěn)定制劑在制備用于治療不同體重患者疾病的藥物中的用途，其中所述藥物對(duì)于治療所述疾病是有效的。
44.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的穩(wěn)定制劑在制備用于治療不同體重患者疾病的藥物中的用途，其中所述藥物是權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的制劑與化合物或療法的組合，并且其中所述藥物對(duì)于治療所述疾病是有效的。
全文摘要
描述了一種穩(wěn)定的水性藥物制劑及其制備方法，該藥物制劑包含治療有效量的抗體、聚山梨酯80、抑制聚山梨酯氧化的緩沖劑。還描述了高抗體濃度的制劑，該制劑保持固定容量并且可用于不同體重的患者。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1771053SQ200480009441
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月10日
發(fā)明者D·J·伯克, S·E·布克利, S·R·萊爾曼, B·H·奧康諾爾, J·卡拉維 申請(qǐng)人:伊蘭藥品公司