專(zhuān)利名稱(chēng)：Cripto阻斷抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及遺傳學(xué)、細(xì)胞及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及能結(jié)合和調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體，含有該抗體的試劑盒以及該抗體的使用方法。
背景技術(shù)：
Cripto是在對(duì)人胚癌文庫(kù)進(jìn)行cDNA篩選時(shí)偶然分離到的一種188氨基酸殘基的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)(Ciccodicola等，1989，EMBO J.，vol.8，no.7，pp.1987-1991)。Cripto蛋白具有至少兩個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)最初被認(rèn)為與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域近似的結(jié)構(gòu)域。Cripto最初被歸類(lèi)為EGF家族的一個(gè)成員(Ciccodicola等，上述)；但是，隨后的分析表明Cripto不能與任一已知的EGF受體結(jié)合，其EGF-樣結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上是從EGF家族分化而來(lái)(Bianco等，1999，J.Biol.Chem.，2748624-8629)。
盡管進(jìn)行了持續(xù)的研究，Cripto信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍然讓人琢磨不透，出現(xiàn)了支持下列幾種不同激活途徑的文獻(xiàn)，包括MAP激酶途徑(DeSantis等，1997，Cell Growth Differ.，81257-1266；Kannan等，1997，J.Biol.Chem.，2723330-3335)、TGF-β途徑(Gritsman等，1999，Development，127921-932；Schier等，2000，Nature，403385-389)、與Wnt途徑間可能的相互作用(Salomon等，Endocr Relat Cancer.2000 Dec；7(4)199-226；以及與EGF途徑的信息交換(Bianco等，1999，J.Biol.Chem.，2748624-8629)。
美國(guó)專(zhuān)利5,256,643及與其相關(guān)的兩個(gè)分案申請(qǐng)(美國(guó)專(zhuān)利5,654,140和5,792,616)公開(kāi)了人Cripto基因、Cripto蛋白及抗Cripto抗體。
美國(guó)專(zhuān)利5,264,557及與其相關(guān)的三個(gè)分案申請(qǐng)(美國(guó)專(zhuān)利5,620,866，5,650,285,和5,854,399)公開(kāi)了人Cripto-相關(guān)基因及蛋白。另外還公開(kāi)了能結(jié)合Cripto-相關(guān)蛋白但不能通過(guò)與Cripto蛋白本身結(jié)合而發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。
用抗cripto短肽的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫染色表明Cripto蛋白的過(guò)表達(dá)與多種腫瘤類(lèi)型(包括但不限于乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃)相關(guān)。Panico等1996，Int.J.Cancer，6551-56；Byme等，1998，J Pathology，185108-111；DeAngelis等，1999，Int J Oncology，14437-440。因此，本領(lǐng)域需要有辦法來(lái)控制、限制和/或阻止這類(lèi)過(guò)表達(dá)，調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)，以及調(diào)控Cripto的表達(dá)結(jié)果(即，促進(jìn)和/或保持細(xì)胞轉(zhuǎn)化)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合Cripto的新的抗體，以及制備和使用該抗體的方法。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)或蛋白相互作用的抗體，例如，結(jié)合Cripto從而使與Cripto相互作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)被下調(diào)的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto并能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)以及調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明還提供了能結(jié)合Cripto、阻斷Cripto和ALK4間相互作用以及調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。
本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明所述抗體能特異性地結(jié)合選自與下列抗體結(jié)合的表位的表位A6C12.11，A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)，A7H1.19，A8F1.30，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A8H3.2，A19A10.30，A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A2D3.23，A7A10.29，A9G9.9，A15C12.10，A15E4.14，A17A2.16，A17C12.28，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)，A17H6.1，A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312)，A19E2.7，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)，B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)，B11H8.4。
本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明所述的抗體特異性地結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位。Cripto可選自CR-1(SEQ ID NO1)或CR-3(SEQID NO2)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，與配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位特異性結(jié)合的抗體包括例如A6C12.11，A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A19A10.30，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)，A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312)和B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體結(jié)合的表位在EGF-樣結(jié)構(gòu)域中。特異性結(jié)合EGF-樣結(jié)構(gòu)域中表位的抗體包括但不限于A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)和A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312).
另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體特異性結(jié)合的表位在富含cys的結(jié)構(gòu)域中。特異性結(jié)合富含cys的結(jié)構(gòu)域中表位的抗體包括包括但不限于A19A10.30，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)和A6C12.11。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體結(jié)合的表位位于跨越Cripto第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。特異性結(jié)合跨越Cripto第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域內(nèi)表位的抗體包括但不限于A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)和A17A2.16。
本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體，包括但不限于，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，和A6C12.11。一個(gè)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的本發(fā)明所述抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體，包括但不限于，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)和A6C12.11。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。特異性結(jié)合且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體，包括但不限于，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)和A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體，包括但不限于A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的能特異性結(jié)合Cripto、能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體能夠結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
另一方面，本發(fā)明涉及能特異性結(jié)合Cripto、能阻斷Cripto和ALK4間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。能特異性結(jié)合Cripto、能阻斷Cripto和ALK4間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體，包括但不限于A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由選自下列的雜交瘤制備的抗體A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)，A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312)，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)，和B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)。
本發(fā)明所述抗體包括但不限于單克隆、多克隆、人源化、嵌合及人抗體。
本發(fā)明還提供了一種用于向生長(zhǎng)有表達(dá)Cripto的腫瘤的受試者施用的組合物，該組合物包含至少一種上述抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述受試者是人。所述組合物可包含一種可藥用賦形劑。上述抗體可偶聯(lián)于一化療藥物或者與一非偶聯(lián)的化療藥物聯(lián)合提供。
本發(fā)明另一方面還涉及體外調(diào)控樣本中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括向樣本中加入上述組合物的步驟。
另外還涉及體內(nèi)調(diào)控受試者腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述組合物的步驟。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述受試者是人。
本發(fā)明的另一方面是治療過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向受試者施用有效量的上述組合物。用于施用的組合物可包括可藥用賦形劑、與化療藥物偶聯(lián)的抗體以及與非偶聯(lián)化療藥物聯(lián)合施用的抗體。
具體而言，本發(fā)明所述的方法可用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或治療生長(zhǎng)有腫瘤的受試者(即，人)，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測(cè)定組織是否表達(dá)有Cripto的方法，該方法包括用上述任一抗體通過(guò)免疫測(cè)定對(duì)取自受試者的組織進(jìn)行分析的步驟。另外還涉及測(cè)定細(xì)胞系是否過(guò)表達(dá)Cripto的方法，該方法包括用上述任一抗體通過(guò)免疫測(cè)定對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行分析。
本發(fā)明的這些方面及其它方面，在本發(fā)明的詳述部分有更詳細(xì)地描述。
發(fā)明詳述能特異性結(jié)合Cripto的抗體及其用于調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)或蛋白相互作用，以及/或者阻斷Cripto和ALK4間相互作用，以及/或者調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的用途已經(jīng)被公開(kāi)。已經(jīng)被公開(kāi)的可特異性結(jié)合Cripto的各類(lèi)抗體，包括，例如，特異性結(jié)合天然Cripto蛋白或非天然Cripto的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體；結(jié)合EGF-樣結(jié)構(gòu)域、富含cys的結(jié)構(gòu)域、或來(lái)自含第46-150位氨基酸殘基的區(qū)域的肽(例如，約第3-20位氨基酸)；結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體；結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體；結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)、且能調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。用常規(guī)體外測(cè)定篩選這些抗體，選取可結(jié)合配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、可調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)、且能調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。
本發(fā)明所述方法可用于治療哺乳動(dòng)物的惡性或良性腫瘤，其中腫瘤的生長(zhǎng)速率(相對(duì)于正常組織來(lái)說(shuō)為異常速率)至少部分取決于Cripto。異常生長(zhǎng)速率是指超過(guò)了正常體內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需速率和超過(guò)了相同來(lái)源的正常組織的生長(zhǎng)速率的生長(zhǎng)速率。
定義本申請(qǐng)全文中進(jìn)行了各種定義。其中多數(shù)詞匯均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員賦予這些詞匯的含義。下文或本申請(qǐng)其它部分專(zhuān)門(mén)定義的詞匯其含義在本發(fā)明上下文中前后一致且一般與本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解相同。
本發(fā)明中，“區(qū)域”一詞是指生物分子一級(jí)結(jié)構(gòu)中的空間上鄰接的部分。就蛋白質(zhì)而言，區(qū)域由該蛋白氨基酸序列中的鄰接部分限定而成。
本發(fā)明中，“結(jié)構(gòu)域”一詞是指生物分子中對(duì)該分子的已知或待求證功能作出貢獻(xiàn)的結(jié)構(gòu)部分。結(jié)構(gòu)域可以與區(qū)域或其部分互為延伸；也可以并入生物分子中作為特定區(qū)域的全部或部分之外的不同部分。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括，但不限于胞外結(jié)構(gòu)域(跨越Cripto中約第31-約第188位殘基，所述的Cripto包括Cripto、CR-1(SEQ ID NO1)和CR-3(SEQ ID NO2))和跨膜結(jié)構(gòu)域(跨越Cripto中約第169-約第188位殘基，所述的Cripto包括Cripto、CR-1(SEQ ID NO1)和CR-3(SEQ ID NO2))。Cripto蛋白的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第75-約第150位殘基，所述的Cripto包括Cripto，CR-1(SEQ ID NO1)和CR-3(SEQ ID NO2)，其中包含Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第75-約第112位殘基，所述的Cripto包括Cripto，CR-1(SEQ ID NO1)和CR-3(SEQ IDNO2)，和Cripto的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域跨越例如Cripto中約第114-約第150位殘基，所述的Cripto包括Cripto，CR-1(SEQ ID NO1)和CR-3(SEQ ID NO2)。例如，經(jīng)鑒定本發(fā)明所述的多數(shù)單克隆抗體可結(jié)合所述的EGF-樣或富含cys的結(jié)構(gòu)域。其它單克隆抗體A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)和A17A2.16經(jīng)鑒定可結(jié)合位于EGF-樣結(jié)構(gòu)域上游、跨越第46-62位殘基的那個(gè)區(qū)域內(nèi)所形成的表位。參見(jiàn)下文實(shí)施例3。配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位，無(wú)論是天然構(gòu)象Cripto蛋白還是非天然Cripto蛋白中形成的表位，抗體都可與其結(jié)合。
本發(fā)明中，“抗體”一詞是指完整無(wú)缺的抗體和Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab)2，及其其它片段。完整無(wú)缺的抗體包括，但不限于，單克隆抗體如鼠單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人抗體以及人源化抗體。各種形式的抗體都可以用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)(Winter And Milstein，Nature 349293-99，1991)來(lái)制備。例如，″嵌合″抗體可通過(guò)將動(dòng)物抗體的抗原結(jié)合區(qū)與人抗體恒定區(qū)連接而構(gòu)建成(起初源自非人哺乳動(dòng)物的抗體，通過(guò)重組DNA技術(shù)將重鏈鉸鏈區(qū)及恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的全部或部分用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)區(qū)域取代)(參見(jiàn)，例如，Cabilly等，美國(guó)專(zhuān)利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-55，1984)。當(dāng)用于人的臨床治療時(shí)嵌合抗體可減弱動(dòng)物抗體引發(fā)的免疫反應(yīng)。
此外，重組“人源化”抗體也可以合成。人源化抗體是最初起源于非人哺乳動(dòng)物的抗體，用重組DNA技術(shù)將該抗體中并非抗原結(jié)合所需的部分或全部氨基酸用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈相應(yīng)區(qū)域中的氨基酸取代。也就是說(shuō)，它們是主要包含人免疫球蛋白序列但其中已經(jīng)插入了負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的區(qū)域的嵌合體(參見(jiàn)，例如，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/04679)。用目的抗原免疫動(dòng)物，分離獲得相應(yīng)的抗體，取出可變區(qū)序列中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的部分。然后，將動(dòng)物來(lái)源的抗原結(jié)合區(qū)域克隆入已經(jīng)刪除了抗原結(jié)合區(qū)域的人抗體基因的合適位置。人源化抗體將用于治療人的抗體內(nèi)使用的異源(種間)序列減至最小，因而幾乎不會(huì)引發(fā)不良(unwanted)免疫反應(yīng)。靈長(zhǎng)類(lèi)源化的抗體也可用類(lèi)似方法制備。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括人抗體的用途，該抗體可用非人動(dòng)物來(lái)制備，例如含有一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述動(dòng)物可用作用于制備雜交瘤的脾細(xì)胞的來(lái)源，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,569,825。
抗體片段和單價(jià)抗體也可用于本發(fā)明所述的方法和組合物中。單價(jià)抗體包含與第二抗體重鏈Fc(或莖干)區(qū)結(jié)合的重鏈/輕鏈二聚體。″Fab區(qū)域″是指鏈中大體上等同于或類(lèi)似于包含重鏈Y分枝部分和整個(gè)輕鏈的序列的那部分，已證實(shí)所述序列聯(lián)合(集合)在一起顯示抗體活性。Fab蛋白包括一重鏈和一輕鏈的集合體(通常稱(chēng)為Fab′)，以及相應(yīng)于抗體Y的兩個(gè)分枝節(jié)段的四聚體(通常稱(chēng)為F(ab)2)，上述任一個(gè)體可以共價(jià)方式也可以非-共價(jià)方式集合在一起，只要所述集合能與特定抗原或抗原家族特異性反應(yīng)即可。
本發(fā)明所述任一抗體都可任選與化療藥物偶聯(lián)在一起，描述見(jiàn)下文。
本發(fā)明中，“結(jié)合”一詞意指在兩種蛋白或化合物或關(guān)聯(lián)蛋白或化合物或其組合之間的物理或化學(xué)相互作用，包括抗體與蛋白間的相互作用。結(jié)合包括離子鍵、非-離子鍵、氫鍵、范德華力、疏水相互作用等。物理相互作用，結(jié)合，可以是直接的也可以是間接的，間接結(jié)合是指借助或歸因于另一種蛋白或化合物的效力，直接結(jié)合是指，不借助或歸因于另一種蛋白或化合物的效應(yīng)、反而無(wú)需借助其它實(shí)體化學(xué)介質(zhì)而發(fā)生的相互作用。結(jié)合可通過(guò)多種不同方式檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)合的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
本發(fā)明中，“能內(nèi)化Cripto的抗體”意指在將Cripto從細(xì)胞表面除去的同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的抗體。可以通過(guò)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體篩選能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體。為了測(cè)定哪種抗體內(nèi)化入Cripto陽(yáng)性細(xì)胞，可以通過(guò)在熒光和/或共焦顯微鏡下觀察細(xì)胞來(lái)測(cè)定抗體熒光信號(hào)的細(xì)胞攝入量。那些實(shí)現(xiàn)了內(nèi)化的抗體會(huì)在細(xì)胞漿和/或細(xì)胞囊泡中觀察到熒光信號(hào)。能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體的非限制性實(shí)例包括A27F6.1和B3F6.17。
本發(fā)明中，“化合物”一詞意指任一可鑒定的化合物或分子，包括但不限于離子、原子、小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苷酸或核酸，以及其它天然或合成的化合物。
本發(fā)明中，“調(diào)控”或“修飾”是指一種具體活性或蛋白質(zhì)在數(shù)量、質(zhì)量或效力上的增或減。
本發(fā)明中，“調(diào)控Cripto信號(hào)”是指Cripto活性在數(shù)量、質(zhì)量或效力上的增或減約5％，優(yōu)選10％，較優(yōu)選20％，更優(yōu)選30％，更優(yōu)選40％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，以及最優(yōu)選100％?；钚钥捎帽绢I(lǐng)域已知方法來(lái)測(cè)量，例如實(shí)施例3所述的無(wú)效細(xì)胞試驗(yàn)(null cellAssay)。
另一實(shí)施方案中，類(lèi)似地可通過(guò)結(jié)合本發(fā)明所述抗體調(diào)控Cripto和另一蛋白之間的蛋白相互作用。
本發(fā)明中，“阻斷Cripto和ALK 4間相互作用”是指將Cripto和ALK4之間的相互作用即結(jié)合增或減約5％，優(yōu)選10％，較優(yōu)選20％，更優(yōu)選30％，更優(yōu)選40％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，以及最優(yōu)選100％?；钚钥捎帽绢I(lǐng)域已知方法來(lái)測(cè)量，例如實(shí)施例8所述的結(jié)合試驗(yàn)。
本發(fā)明中，“ 體外調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)”是指體外使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增或減約5％，優(yōu)選10％，較優(yōu)選20％，更優(yōu)選30％，更優(yōu)選40％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，以及最優(yōu)選100％。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體外調(diào)控可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)測(cè)定，例如實(shí)施例4所示的GEO細(xì)胞軟瓊脂試驗(yàn)。
本發(fā)明中，“體內(nèi)調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)”是指體內(nèi)使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增或減約5％，優(yōu)選10％，較優(yōu)選20％，更優(yōu)選30％，更優(yōu)選40％，更優(yōu)選50％，更優(yōu)選60％，更優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，以及最優(yōu)選100％。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)調(diào)控可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法來(lái)測(cè)定，例如實(shí)施例5所示的試驗(yàn)。
“預(yù)防”一詞是指降低生物體發(fā)生或發(fā)展異常狀況的可能性。
“治療”一詞是指產(chǎn)生治療效果并至少部分減輕或消除生物體的異常狀況。治療包括維持已受抑制的腫瘤細(xì)胞以及誘導(dǎo)消退。
“治療效果”是指抑制一種異常狀況。治療效果可一定程度減輕異常狀況的一種或多種癥狀。就異常狀況的治療而言，治療效果可指一種或多種下述情形(a)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和/或分化的增或減；(b)抑制(即，減慢或停止)或促進(jìn)細(xì)胞死亡；(c)抑制退化；(d)一定程度地減輕所述異常狀況的一種或多種癥狀；以及(e)增強(qiáng)細(xì)胞群的功能。顯示針對(duì)異常狀況效力的化合物可按本申請(qǐng)所述方法鑒定。
“施用”涉及將化合物引入生物體細(xì)胞或組織的方法。當(dāng)生物體的細(xì)胞或組織存在于生物體內(nèi)或生物體外時(shí)所述異常狀況可被防止或治療。存在于生物體外的細(xì)胞可維持或生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，或另一生物體內(nèi)。就包含在生物體內(nèi)的細(xì)胞而言，多種本領(lǐng)域中現(xiàn)有的技術(shù)都可以施用化合物，包括(但不限于)口服、腸胃外、皮膚、注射以及氣霧劑方式應(yīng)用。就生物體外的細(xì)胞而言，多種本領(lǐng)域中現(xiàn)有的技術(shù)都可以施用化合物，包括(但不限于)細(xì)胞顯微注射技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)以及載體技術(shù)。施用可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方式完成，例如，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)等。當(dāng)用于體內(nèi)治療時(shí)，本發(fā)明所述抗體按有效量施用給受試者。本發(fā)明中使用的″有效量″是指足以實(shí)現(xiàn)有益或期望臨床結(jié)果的量(即，消除或減輕受試者腫瘤負(fù)擔(dān)的量)。有效量可以一次或多次施用。就本發(fā)明目的而言，本發(fā)明所述抗體的有效量是指足以改善、穩(wěn)定或延緩Cripto-相關(guān)疾病病情發(fā)展的量，具體為Cripto-相關(guān)腫瘤。這些效果指征的檢測(cè)及測(cè)量在下文討論。常規(guī)治療方案的實(shí)例包括將本發(fā)明所述抗體靜脈輸注給受試者，按每周一次的治療方案，劑量為2-5mg/kg。抗體可以在門(mén)診的化學(xué)輸注室(chemoinfusion unit)施用，除非受試者要求入院。其它本領(lǐng)域已知的施用方案也在本發(fā)明涉及范圍之內(nèi)。
異常狀況也可通過(guò)向一組在向生物傳遞信號(hào)的途徑中有異常的細(xì)胞施用本發(fā)明所述抗體來(lái)預(yù)防或治療。然后，監(jiān)測(cè)施用化合物對(duì)生物的功能的影響。所述生物優(yōu)選是人。
“Cripto過(guò)表達(dá)”是指組織中Cripto的表達(dá)量以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著量大大超過(guò)鄰近正常組織的Cripto表達(dá)。
“化療藥物”是指本領(lǐng)域已鑒定的在抑制腫瘤生長(zhǎng)、維持已受抑的腫瘤生長(zhǎng)、和/或誘導(dǎo)消退方面具有治療作用的任一藥物，例如天然化合物、合成化合物、蛋白質(zhì)、經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)、以及放射性化合物。本發(fā)明涉及的化療藥物包括可與本發(fā)明所述抗體偶聯(lián)的藥物或者與本發(fā)明所述抗體聯(lián)用而不與該抗體偶聯(lián)的藥物?？膳c本發(fā)明抗體偶聯(lián)的范例性的化療藥物包括，但不限于放射偶聯(lián)物(90Y，131I，99mTc，111In，186Rh，等)、腫瘤活化藥物前體(maytansinoids，CC-1065類(lèi)似物，clicheamicin衍生物，蒽環(huán)類(lèi)抗生素，長(zhǎng)春花生物堿等)、蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素。
化療藥物可以與本發(fā)明所述抗體聯(lián)用，而不必與其偶聯(lián)(即，非偶聯(lián)化療藥物)，包括，但不限于鉑(即，順鉑)，蒽環(huán)類(lèi)抗生素，核苷類(lèi)似物(嘌呤和嘧啶)，taxanes，喜樹(shù)堿，外足葉草毒素(epipodophyllotoxins)，DNA烷基化試劑，葉酸拮抗劑、長(zhǎng)春花生物堿、核糖核苷酸還原酶抑制劑、雌激素抑制劑、孕酮抑制劑、雄性激素抑制劑、芳香酶抑制劑、干擾素、白細(xì)胞介素、單克隆抗體、紫杉酚、伊立替康(camptosar)、阿霉素(dox)，5-FU和吉西他濱(gemcitabine)。所述化療藥物可在實(shí)施本發(fā)明時(shí)通過(guò)將抗體和非偶聯(lián)化療藥物共施用而與本發(fā)明所述抗體聯(lián)用。
“可藥用的載體或賦形劑”是指本領(lǐng)域已知的、用于施用本發(fā)明所述抗體的生物學(xué)惰性化合物?？山邮艿妮d體為本領(lǐng)域熟知，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，1990中所記載的載體。可接受的載體可以包括生物可接受的、惰性地或生物可吸收的鹽類(lèi)、緩沖試劑、寡-或多糖、聚合物、粘彈性化合物如透明質(zhì)酸、增粘劑、防腐劑，等。
″受試者″是指脊椎動(dòng)物、具體為哺乳動(dòng)物成員，包括但不限于家畜、競(jìng)技動(dòng)物(sportsAnimals)及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，包括人。
本發(fā)明的抗體本發(fā)明所述抗體可特異性結(jié)合Cripto本發(fā)明中，Cripto包括CR-1Cripto蛋白、CR-3 Cripto蛋白、及其片段。所述片段可以是完整的結(jié)構(gòu)域，例如胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，EGF-樣結(jié)構(gòu)域，富含cys的結(jié)構(gòu)域，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，等。所述片段還可包括Cripto蛋白任一結(jié)構(gòu)域中的鄰接及非鄰接的表位。
CR-1的188個(gè)氨基酸的序列如下[SEQ ID NO1]MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYYCR-3的188個(gè)氨基酸的序列如下[SEQ ID NO2]MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體可結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。所述EGF-樣結(jié)構(gòu)域跨越成熟Cripto蛋白質(zhì)中約第75-112位氨基酸殘基。EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位可包括氨基酸殘基的線性或非線性跨幅。所述線性表位的實(shí)例包括但不限于約第75-85，80-90，85-95，90-100，95-105，100-110，或105-112位殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGF結(jié)構(gòu)域中的表位是在天然構(gòu)象Cripto蛋白中形成的相對(duì)于非天然Cripto蛋白的表位。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體可結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。所述富含cys的結(jié)構(gòu)域跨越成熟Cripto蛋白中的約第114位-約150位氨基酸殘基。富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位可以包含線性或非線性跨幅的氨基酸殘基。涉及的線性表位的實(shí)例包括但不限于約第114-125，120-130，125-135，130-140，135-145，或140-150位殘基。一個(gè)實(shí)施方案中，富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位為天然構(gòu)象Cripto蛋白相對(duì)于非天然Cripto蛋白其中形成的表位。
一旦生成抗體，該抗體與Cripto的結(jié)合就可以使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，例如ELISA來(lái)測(cè)定，而細(xì)胞表面上Cripto的存在可用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)測(cè)定，如實(shí)施例2所示。也可以使用測(cè)量所述結(jié)合的任一其它技術(shù)。
本發(fā)明提供了Cripto特異性抗體(例如，單克隆及多克隆抗體，單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能/雙特異性抗體、人源化抗體、人抗體及互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)-移植抗體，包括包含特異性識(shí)別本發(fā)明多肽的CDR序列的化合物)或其片段。本發(fā)明還提供了抗體片段，包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，和Fv?！疤禺愋浴焙汀斑x擇性”當(dāng)用來(lái)描述本發(fā)明所述抗體的結(jié)合時(shí)，意味著本發(fā)明所述抗體的可變區(qū)能識(shí)別和結(jié)合Cripto。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明所述的特異性抗體還可與其它蛋白(例如，金黃色葡萄球菌(S.Aureus)蛋白A或ELISA技術(shù)中的其它抗體)相互作用，該作用借助于該抗體可變區(qū)外側(cè)的序列，尤其該分子的恒定區(qū)中的序列的相互作用。用于測(cè)定本發(fā)明所述抗體(即，特異性結(jié)合表位配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨越第46-62位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域的抗體)的結(jié)合特異性的試驗(yàn)已為本領(lǐng)域熟知并且是常規(guī)實(shí)踐。所述試驗(yàn)的詳細(xì)描述，參見(jiàn)Harlow等(Eds.)，AntibodiesA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，第6章。能夠識(shí)別和結(jié)合Cripto蛋白片段的抗體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該抗體對(duì)于Cripto多肽是特異性的。本發(fā)明所述的多肽可用本領(lǐng)域熟知的方法制備并常規(guī)使用。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體?？贵w的特異性在下文有更詳細(xì)地描述。但是，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，用現(xiàn)有技術(shù)描述的其它多肽制備的并且恰好能與Cripto交叉反應(yīng)(例如，由于這兩種多肽中恰好存在類(lèi)似的表位)的抗體稱(chēng)為“交叉-反應(yīng)”抗體。這類(lèi)交叉-反應(yīng)抗體不是特異性針對(duì)Cripto的抗體。測(cè)定抗體是否特異性結(jié)合Cripto表位可以用本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任一種，例如Western印跡試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行。在鑒別表達(dá)Cripto的細(xì)胞以及調(diào)控Cripto配體/受體結(jié)合活性方面，特異性結(jié)合Cripto蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(即，Cripto蛋白可見(jiàn)于細(xì)胞外側(cè)的部分)的抗體都是特別有用的。
一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含多克隆抗體的無(wú)細(xì)胞組合物，其中所述抗體中的至少一種是本發(fā)明特異于Cripto的抗體。從動(dòng)物分離的抗血清是組合物一個(gè)實(shí)例，另一實(shí)例是一種含有已重懸于水或其它稀釋劑、賦形劑或載體中的抗血清之抗體組分的組合物。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單克隆抗體。單克隆抗體具有高度的特異性，針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。另外，與多克隆抗體通常包括針對(duì)不同表位的不同抗體不同，每一種單克隆抗體都只針對(duì)抗原上的單一決定簇。單克隆抗體可用于增強(qiáng)利用抗原-抗體結(jié)合的診斷及測(cè)定試驗(yàn)的選擇性和特異性。單克隆抗體的另一種優(yōu)勢(shì)是他們可用雜交瘤培養(yǎng)物合成，不受其它免疫球蛋白的污染。制備這類(lèi)抗體的雜交瘤也是本發(fā)明的一個(gè)方面。
在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種特異性針對(duì)Cripto特異性抗體的抗-獨(dú)特型抗體?？?獨(dú)特型抗體的更詳細(xì)描述，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,063,379和5,780,029。
已經(jīng)熟知的是，抗體含有可用化學(xué)方法或重組技術(shù)分離的、相對(duì)較小的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這類(lèi)結(jié)構(gòu)域本身就是有用的Cripto結(jié)合分子，也可被重導(dǎo)入人抗體，或融合于化療藥物或多肽。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有Cripto-特異性抗體片段的多肽，其中所述片段及相關(guān)分子，無(wú)論是那個(gè)，都可結(jié)合Cripto。本發(fā)明提供了本身是單鏈抗體和CDR-移植抗體的多肽作為非限制性實(shí)例。關(guān)于CDR-移植抗體的更詳細(xì)討論，參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,859,205。
另一實(shí)施方案中，可以用本領(lǐng)域已知的任一方法將非-人抗體人源化。人源化后的抗體可用于體內(nèi)治療用途。另外，重組″人源化″抗體可以合成。人源化抗體最初源自非人哺乳動(dòng)物，但已用重組DNA技術(shù)將并非抗原結(jié)合所必需的全部或部分氨基酸用人免疫球蛋白輕鏈或重鏈相應(yīng)區(qū)域的氨基酸取代。它們是主要包含人免疫球蛋白序列但其中已經(jīng)插入了負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的區(qū)域的嵌合體(參見(jiàn)，例如，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/04679)。用目的抗原免疫動(dòng)物，分離獲得相應(yīng)的抗體，取出可變區(qū)序列中負(fù)責(zé)特異性抗原結(jié)合的部分。然后，將動(dòng)物來(lái)源的抗原結(jié)合區(qū)域克隆入已經(jīng)刪除了抗原結(jié)合區(qū)域的人抗體基因的合適位置。人源化抗體將用于治療人的抗體內(nèi)使用的異源(種間)序列減至最小，因而幾乎不會(huì)引發(fā)不良免疫反應(yīng)。類(lèi)似地，可用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，恒河猴、狒狒和黑猩猩)抗體基因，制備靈長(zhǎng)類(lèi)源化的抗體。然后，可將其它變化導(dǎo)入抗體框架調(diào)節(jié)親和力和免疫原性。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,585,089,5,693,761,5,693,762,和6,180,370。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括人抗體的用途,該抗體可用非人動(dòng)物來(lái)制備，例如含有一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述動(dòng)物可用作用于制備雜交瘤的脾細(xì)胞的來(lái)源，描述見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,569,825,WO00076310，WO00058499和WO00037504，在此引入作為參考。
信號(hào)調(diào)控另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可結(jié)合Cripto，并調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)或Cripto-蛋白相互作用。Cripto活性的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致去分化狀態(tài)，該狀態(tài)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的特征化、加速增殖，及細(xì)胞遷移(Salomon等，BioEssays 2161-70，1999；Ciardiello等，Oncogene 9291-298，1994；Baldassarre等，Int.J.Cancer 66538-543，1996)，瘤形成中可見(jiàn)的與細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的表型。
測(cè)試抗-Cripto抗體活性及其調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)能力的一種方法是使用F9-Cripto敲除(KO)細(xì)胞系(MinchiottiAtAl.，Mech.Dev.90133-142，2000)。Cripto能刺激smad2磷酸化及非洲爪蟾胚胎中的轉(zhuǎn)錄因子FAST，轉(zhuǎn)錄因子FAST的活性可通過(guò)測(cè)量來(lái)自FAST調(diào)控單元-螢光素酶報(bào)道基因的螢光素酶活性來(lái)監(jiān)測(cè)(Saijoh等，Mol.Cell 535-47，2000)。F9-Cripto KO細(xì)胞缺失了Cripto基因，因此Cripto和Cripto-依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)是無(wú)效的(MinchiottiAtAl.，Mech.Dev.90133-142，2000)。可以通過(guò)轉(zhuǎn)染Cripto，F(xiàn)AST，和FAST調(diào)控單元-螢光素酶基因構(gòu)建體而在F9 Cripto KO細(xì)胞中測(cè)定Cripto信號(hào)傳導(dǎo)。在這些細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)Cripto依賴(lài)性FAST螢光素酶活性，除非其中轉(zhuǎn)染入了Cripto cDNA，和FAST cDNA。能阻斷Cripto-依賴(lài)性Nodal信號(hào)傳導(dǎo)的抗體是可阻斷Cripto信號(hào)傳導(dǎo)功能的抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用測(cè)量Cripto活性的其它試驗(yàn)，例如，軟瓊脂生長(zhǎng)試驗(yàn)(參見(jiàn)下文實(shí)施例4)。細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)能力與細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)，該試驗(yàn)是測(cè)量腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況的一種典型的體外試驗(yàn)。用于測(cè)定對(duì)活性的抑制情況的其它試驗(yàn)包括塑料上進(jìn)行的體外試驗(yàn)，等。
治療用途本發(fā)明的抗體還可用于治療目的，例如調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，為診斷目的而檢測(cè)或定量Cripto，以及純化Cripto。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控受試者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
另一實(shí)施方案中，提供了能特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的抗體。一個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是過(guò)表達(dá)Cripto的細(xì)胞系，例如源自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的癌細(xì)胞系。
可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員用到的常規(guī)方法(如下文實(shí)施例4所示)篩選抗-Cripto抗體的體內(nèi)活性，以便將其作為潛在的抗癌藥物。這些方法的實(shí)例已由國(guó)立癌癥研究所(NCI)在其″in vivo cancer models screening″protocols，NIH publication number 84-2635(Feb 1984)中作了概述。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體可用于治療患有癌性腫瘤的受試者。
本發(fā)明所述抗體可與藥物學(xué)可接受的賦形劑聯(lián)合，以治療有效劑量施用給受試者。關(guān)于抑制腫瘤生長(zhǎng)方法的討論參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利6,165,464。
另外，本發(fā)明還包括對(duì)患有與Cripto異常水平(即，升高或耗竭)相關(guān)的病癥的受試者進(jìn)行治療的方法，其中該方法包括向受試者施用有效量的可特異性結(jié)合Cripto的配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中表位的抗體，所述表位包括但不限于EGF-樣結(jié)構(gòu)域或富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
另外，本發(fā)明還包括對(duì)患有與Cripto異常水平(即，升高或耗竭)相關(guān)的病癥的受試者進(jìn)行治療的方法，其中該方法包括向受試者施用有效量的可特異性與Cripto形成復(fù)合體且針對(duì)具有下述特征的表位的抗體，即該表位是選自下列的抗體針對(duì)的表位A6C12.11，A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)，A7H1.19，A8F1.30，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A8H3.2，A19A10.30，A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A2D3.23，A7A10.29，A9G9.9，A15C12.10，A15E4.14，A17A2.16，A17C12.28，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)，A17H6.1，A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312)，A19E2.7，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)和B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)。
通過(guò)檢測(cè)Cripto進(jìn)行的診斷可以很容易地用本發(fā)明的新抗體通過(guò)常規(guī)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這就使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可檢測(cè)Cripto在多種樣本、培養(yǎng)物等中的特異性存在。
用于本發(fā)明任一目的的含本發(fā)明所述抗體的試劑盒也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。通常，本發(fā)明所述試劑盒包括一種抗體免疫特異性針對(duì)的對(duì)照抗原。實(shí)施方案包括含有所有試劑及其使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。
本發(fā)明的其它特征可從下列說(shuō)明性的實(shí)施例中清楚地看出。
實(shí)施例實(shí)施例1Cripto的表達(dá)和純化通過(guò)將編碼人Cripto 1-169位氨基酸殘基(即SEQ ID NO1中第1-169位氨基酸)與人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域(即，“CR(del C)-Fc”)融合體的cDNA亞克隆入載體pEAG1100，得到名為pSGS480的表達(dá)質(zhì)粒。該載體的更詳細(xì)描述，參見(jiàn)于2000年9月18日提交的同時(shí)待審的序列號(hào)為No.60/233,148的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)。載體pEAG1100是GIBCO-BRL Life Technologies質(zhì)粒pCMV-Sport-betagal的衍生物，其在CHO瞬間轉(zhuǎn)染中的用途由Schifferli等，1999，F(xiàn)ocus2116所述。它是將報(bào)道基因β-半乳糖苷酶NotI片段從質(zhì)粒pCMV-Sport-Betagal(產(chǎn)品目錄號(hào)為10586-014)中除去而得到的，該過(guò)程如下用NotI和EcoRV消化該質(zhì)粒，凝膠純化出4.38 kb NotI載體骨架片段并連接。將連接后的DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從分離的單個(gè)克隆中分離出含目的重組體的質(zhì)粒pEAG1100。pEAG1100的序列跨越了啟動(dòng)子、多聚接頭及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，這一點(diǎn)得到證實(shí)。
將質(zhì)粒pSGS480瞬間轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，將該細(xì)胞在28℃下培養(yǎng)7天。用Western印跡試驗(yàn)測(cè)定這些細(xì)胞及條件培養(yǎng)基(conditioned medium)中有無(wú)CR(del C)-Fc蛋白的存在。就Westem印跡試驗(yàn)而言，將取自Cripto轉(zhuǎn)染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和細(xì)胞在還原條件下4-20％梯度凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳轉(zhuǎn)移到消化纖維膜上，用兔抗Cripto 17-元(mer)肽(含SEQ IDNO1中第97-113位殘基)-匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物的多克隆抗血清檢測(cè)Cripto融合蛋白。離心除去細(xì)胞后，Westem印跡試驗(yàn)表明CR(del C)-Fc蛋白有效地分泌到適應(yīng)后培養(yǎng)基(上清)中。將該上清加樣于蛋白A-Sepaharose(Pharmacia)，用25mM磷酸鈉pH2.8，100mM NaCl洗脫結(jié)合蛋白。洗脫的蛋白質(zhì)用pH8.6的0.5M磷酸鈉中和，從240-340nm處的吸光度測(cè)量值推算出總蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE純化。洗脫后的蛋白質(zhì)用0.2微米濾器過(guò)濾，存儲(chǔ)于-70℃。
實(shí)施例2抗體的制備和篩選用洗脫得到的CR(del C)-Fc蛋白注射小鼠，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。
A.抗體的制備具體而言，用完全弗氏佐劑(GibcoBRL#15721-012)乳化后的純化人CRdel C-Fc 25μg腹膜內(nèi)免疫雌性羅伯遜小鼠(Jackson Labs)。用不完全弗氏佐劑(GibcoBRL#15720-014)乳化后的純化人CR del C-Fc 25μg腹膜內(nèi)方式加強(qiáng)免疫，并用蛋白微珠上的形式加強(qiáng)一次。最后一次加強(qiáng)免疫的3周后篩選血清，具有最佳滴度的小鼠在融合的3天前用50μg可溶性CR del C-Fc腹膜內(nèi)加強(qiáng)免疫。融合的前一天用50μg CR del C-Fc加強(qiáng)免疫小鼠。將小鼠脾細(xì)胞與FL653骨髓瘤細(xì)胞以1個(gè)脾細(xì)胞6個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的比例融合，然后以100,000，33,000和11,000個(gè)細(xì)胞/孔加入裝有選擇培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板。1周后用FACS和ELISA篩選出生長(zhǎng)陽(yáng)性的孔。進(jìn)行兩次融合。
B.抗體的篩選首先，用ELISA板篩選第一或第二次融合得到的上清對(duì)Cripto del C和/或Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域蛋白的識(shí)別。用對(duì)照融合蛋白(LT-β受體-Fc)包被ELISA板，以丟棄識(shí)別人Fc表位的單克隆抗體。按照下面C部分的描述進(jìn)行ELISA。第一次融合中，初步的上清也可以通過(guò)FACS來(lái)篩選其識(shí)別睪丸腫瘤細(xì)胞系NCCIT表面Cripto蛋白的能力。第二次融合中，也可以通過(guò)FACs測(cè)試上清識(shí)別NCCIT和乳腺癌細(xì)胞系DU4475這兩種腫瘤細(xì)胞系表面的Cripto的能力。次級(jí)篩選包括測(cè)試單克隆抗體上清識(shí)別一系列腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞表面Cripto的能力(結(jié)果參見(jiàn)表1和2)，免疫組化試驗(yàn)中單克隆抗體識(shí)別人乳腺和結(jié)腸腫瘤組織切片上的人Cripto的能力，單克隆抗體阻斷Cripto-Nodal信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)的能力，阻斷塑料或軟瓊脂試驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的能力，內(nèi)化細(xì)胞表面Cripto的能力。
C.ELISAELISA試驗(yàn)操作如下材料板Costar高結(jié)合力易清洗96孔平板(07-200-642)2’抗Pierce山羊抗-鼠IgG(H+L)-HRP(P131430)底物Pierce TMB底物試劑盒(34021)終止溶液1N H2SO4緩沖液結(jié)合緩沖液0.1M NaHPO4 pH9.0封閉緩沖液PBS+10％Donor Calf Serum洗滌緩沖液PBS+0.1％tween-20將抗原CR-del-C-Fc及CR-EGF-fc、作為對(duì)照用的人IgGl融合蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋至500ng/ml。每孔加入100μl，37℃下孵育1小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜。倒去液體，倒扣平板，吸干。然后加入250μl/孔封閉緩沖液，然后在37℃下孵育30分鐘。重復(fù)一次，倒去液體，倒扣平板，吸干。上清用洗滌緩沖液作150稀釋?zhuān)?0μl/孔鋪板，然后室溫孵育1小時(shí)。用250μl/孔洗滌緩沖液劇烈洗板3次。然后向每孔中加入100μl用洗滌緩沖液1∶10，000稀釋后的2’抗體，然后室溫下孵育30分鐘。然后用250μl/孔洗滌緩沖液劇烈洗板3次，然后加入底物100μl/孔。顯色至充分變暗，然后加入終止緩沖液100μl/孔，然后讀取該板在450nm處的吸光度。
D.流式細(xì)胞計(jì)量Cripto陽(yáng)性細(xì)胞系可用于經(jīng)細(xì)胞表面染色及流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定單克隆抗體與Cripto的結(jié)合，操作如下37℃下用2ml加有5mM EDTA的PBS作用10分鐘，將細(xì)胞從T162燒瓶上消化下來(lái)。用加有血清的培養(yǎng)基補(bǔ)至20ml，上下吹打幾次，分散細(xì)胞。1200rpm離心5分鐘。用5-10ml 4℃的加有0.1％BSA的PBS(洗滌緩沖液)洗滌細(xì)胞。1200rpm離心5分鐘。以4×106-107/ml濃度重懸于洗滌緩沖液。置于冰上。
制備用于染色的抗體。用洗滌緩沖液將純化后的抗體稀釋至1-10μg/ml。將50μl細(xì)胞加入96-孔Linbro V形底的平板(ICN 7632105)。待分析細(xì)胞系的每一種對(duì)照都鋪一孔細(xì)胞，包括不加抗體，只加2°抗體，雜交瘤培養(yǎng)物、陽(yáng)性對(duì)照抗體上清，如果可以，或純化抗體，以及IgG亞類(lèi)對(duì)照(如果使用純化后的抗體)的細(xì)胞。
待分析細(xì)胞系的每一試驗(yàn)樣本都鋪一孔細(xì)胞。將平板4℃下用臺(tái)式離心機(jī)，1200rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。反扣平板倒出緩沖液，搖動(dòng)直至液體基本清除干凈。向孔中加入40-50μl抗體(或者向不加抗體或只加2°抗體的對(duì)照孔加入洗滌緩沖液)。4℃孵育至少30分鐘至1小時(shí)。旋轉(zhuǎn)平板，1200rpm 5分鐘。倒掉抗體溶液。每孔加200μl洗滌緩沖液洗孔兩次，洗滌后離心。倒掉緩沖液。
將R-PE標(biāo)記的Fc特異性山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoresearchLaboratories Cat#115-116-071)(用洗滌緩沖液)1∶200稀釋?zhuān)靠字械募?xì)胞用該稀釋液50μl重懸。暗室中4℃孵育20分鐘。向每孔細(xì)胞加150μl洗滌緩沖液。1200rpm旋轉(zhuǎn)平板5分鐘。每孔用200μl洗滌緩沖液洗滌1次。將細(xì)胞重懸于150μl含1％PFA的PBS。將每孔內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至單個(gè)管(5mlFalcon聚苯乙烯圓底管-352052)中。用錫紙將管包起來(lái)。
然后用流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x讀取管中的內(nèi)容物。
用該方法制備的單克隆抗體的兩次篩選的結(jié)果產(chǎn)生了下列結(jié)果，概述于下表1和2，其中第一列提供的是雜交瘤亞克隆的命名，接下來(lái)給出的是ELISA篩選的結(jié)果，其余列顯示的是4種cripto-陽(yáng)性細(xì)胞系流式細(xì)胞計(jì)量測(cè)定的結(jié)果。結(jié)果以平均熒光指數(shù)(MFI)為單位。
表1抗-Cripto單克隆抗體特性

表2抗-Cripto單克隆抗體特性


實(shí)施例3用于測(cè)定Cripto信號(hào)傳導(dǎo)抑制情況的無(wú)效細(xì)胞(null cell)試驗(yàn)下面描述的是用于評(píng)估對(duì)Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抑制的F9 Cripto無(wú)效細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)。
第0天，用0.1％明膠包被6孔板，2ml/孔，37℃下作用15分鐘。
種植細(xì)胞，每孔6×105個(gè)F9 CRIPTO無(wú)效細(xì)胞。
第1天轉(zhuǎn)染向下列每一試樣加入300μl OptiMeml，得到每一試樣的溶液A試樣10.5μg(N2)7螢光素酶FAST報(bào)道cDNA加1.5μg空載體cDNA。
試樣20.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg FAST，和1μg空載體cDNAs。
試樣30.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto ADD 0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣40.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣50.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣60.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣70.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣80.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
試樣90.5μg(N2)7螢光素酶，0.5μg Cripto，0.5FAST，和0.5μg空載體cDNAs。
溶液B含30μl脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine)外加270μl OptiMeml。
對(duì)于每一試樣，將溶液A與溶液B混合在一起。室溫孵育45分鐘。用2m1/孔OptiMeml洗孔。吸出后馬上進(jìn)行下一步驟。
向每一溶液A+B的混合物加入2.4ml OptiMeml，混合，每孔加入1.5ml，雙份孔。37℃下孵育5小時(shí)。向接受了試樣1-3的孔每孔加入1.5mlDMEM+20％FCS，2mM Gln，P/S。按下述要求加入抗-Cripto抗體試樣4的孔A27F6.1，10μg/ml；試樣5的孔A27F6.1，2μg/ml；試樣6的孔A40G12.8；10μg/ml，試樣7的孔A40G12.8 2μg/ml；試樣8的孔A10B2.18，10μg/ml；試樣9的孔A10B2.18，2μg/ml.
第2天除去培養(yǎng)基，用PBS洗孔，2ml/孔。向相同的孔內(nèi)加入DMEM+0.5％FCS，2mM Gln，P/S(其中含有與前一天相同量的Cripto抗體)。
第3天顯示螢光素酶信號(hào)。用PBS+Ca2+和Mg2+，2ml/孔，洗孔。使用LucLite試劑盒，Packard cat#6016911。室溫加入緩沖液和底物。暗光。用10ml緩沖液重配底物。用PBS+Ca2+和Mg2+作1∶1稀釋。吸干孔。用連排移液槍向每孔中快速加入250μl稀釋后的底物。漩渦溶液，并轉(zhuǎn)移200μl至96孔白色、底部不透明的板，F(xiàn)alcon 35-3296。使用Winglow用發(fā)光儀讀板，將數(shù)據(jù)提交到Excel。
該試驗(yàn)的結(jié)果概述于下表3。
表3Cripto信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)用抗-Cripto單克隆抗體抑制

實(shí)施例4體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)
Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抑制也可通過(guò)測(cè)量GEO細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)，例如，Ciardiello等，Oncogene.1994 Jan；9(1)291-8；Ciardiello等，Cancer Res.1991 Feb 1；51(3)1051-4。
首先，熔化3％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂。放置于42℃水浴中。然后，將3％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂溶液與預(yù)熱的完全培養(yǎng)基混合得到0.6％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂溶液，42℃保溫。向6cm平皿內(nèi)澆注4ml該溶液，冷卻至少30分鐘以形成底層瓊脂。胰蛋白酶消化GEO細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸至105個(gè)細(xì)胞/ml。向細(xì)胞懸液加入待分析抗體或?qū)φ?，?0μg到1μg滴定抗體。GEO細(xì)胞懸液與0.6％細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂等體積混合，在底層瓊脂表面覆蓋2ml。冷卻至少1小時(shí)。37℃下CO2孵箱中孵育14天。計(jì)數(shù)不需顯微鏡就可見(jiàn)的集落。與陰性對(duì)照相比未出現(xiàn)的集落，表明測(cè)試抗體能夠體外抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
該試驗(yàn)產(chǎn)生抗體A27F6.1和B6G7.10的結(jié)果，如表4所示，二者都顯示出削弱GEO細(xì)胞集落生長(zhǎng)的能力。
表4軟瓊脂試驗(yàn)中的生長(zhǎng)結(jié)果

實(shí)施例5體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)為了測(cè)定腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制的情況，將人腫瘤細(xì)胞系皮下植入無(wú)胸腺裸鼠(athymic nude mice)，觀察本發(fā)明所述抗體的作用效果，加或不加對(duì)腫瘤抑制有協(xié)同或輔助作用的化療。
替代地，該試驗(yàn)可以使用不同腫瘤細(xì)胞系，例如，GEO(一種良好分化的人結(jié)腸癌體外細(xì)胞系，獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))，DU-4475(一種乳腺癌體外細(xì)胞系，獲自ATCC)，NCCIT(一種睪丸腫瘤細(xì)胞系，獲自ATCC)，或其它本領(lǐng)域已知的細(xì)胞系。這類(lèi)試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例如下
用耳朵打孔的方式單個(gè)標(biāo)記動(dòng)物。所述GEO細(xì)胞系體外或體內(nèi)傳代1-4代。將該GEO細(xì)胞在右側(cè)腹區(qū)域皮下植入動(dòng)物。可使用下列組的動(dòng)物組# 治療 小鼠#1.鹽水對(duì)照，0.2ml/小鼠，i.p.，每周三次(一，三，五) 202.mAb，低劑量，i.p.103.mAb，中劑量，i.p.104.mAb，高劑量，i.p.105.5-FU，30mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，3Rx/wk(一，三，五) 106.順鉑，2mg/kg/注射，皮下，3Rx/wk(一，三，五) 107.阿霉素，1.6mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，3Rx/wk(一，三，五)108.Irinotecan，10mg/kg/注射，腹膜內(nèi)，5Rx/wk(一-五) 109.mAb，低劑量，i.p.+5-FU(中間劑量) 1010. mAb，中劑量，i.p.+5-FU(中間劑量) 1011. mAb，高劑量，i.p.+5-FU(中間劑量) 1012. mAb，低劑量，i.p.+順鉑(中間劑量) 1013. mAb，中劑量，i.p.+順鉑(中間劑量) 1014. mAb，高劑量，i.p.+順鉑(中間劑量) 1015. mAb，低劑量，i.p.+阿霉素(中間劑量) 1016. mAb，中劑量，i.p.+阿霉素(中間劑量) 1017. mAb，高劑量，i.p.+阿霉素(中間劑量) 1018. mAb，低劑量，i.p.+Irinotecan(中間劑量) 1019. mAb，中劑量，i.p.+Irinotecan(中間劑量) 1020. mAb，高劑量，i.p.+Irinotecan(中間劑量) 10第0天植入腫瘤，記錄動(dòng)物的初始體重。
第1天按照上述要求啟動(dòng)治療。
第5天開(kāi)始測(cè)量腫瘤大小及體重，每周兩次直至試驗(yàn)終止。
測(cè)量初始體重、腫瘤大小及體重，宰殺時(shí)的組織學(xué)，以及對(duì)腫瘤的免疫組化分析，以此來(lái)分析Cripto表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)、及對(duì)生長(zhǎng)的抑制。
實(shí)施例6體內(nèi)種間腫瘤移植模型-阻斷富含cys的結(jié)構(gòu)域的抗-Cripto抗體為了評(píng)估NCCIT的應(yīng)答，將可結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域的抗體皮下植入人睪丸腫瘤細(xì)胞系。試驗(yàn)方法如下。結(jié)果示于

圖1。
方法和材料動(dòng)物使用無(wú)胸腺雄性裸鼠。用耳朵打孔的方式逐個(gè)編號(hào)動(dòng)物。
腫瘤NCCIT，縱隔混合的生殖細(xì)胞，最初獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的人睪丸癌體外細(xì)胞系。細(xì)胞系用不加抗生素的RPMI-1640/10％FBS體外傳代6代。在動(dòng)物右側(cè)腹將5×106個(gè)細(xì)胞/0.2ml matrigel皮下植入動(dòng)物。
組# 治療 小鼠#1 介質(zhì)對(duì)照，(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.2)， 200.2ml/小鼠，腹膜內(nèi)注射，Q14D治療從第-1天開(kāi)始2.A8G3.5，1mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D 10治療從第-1天開(kāi)始3.A8G3.5，3mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D 10治療從第-1天開(kāi)始4.A8G3.5，10mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D 10治療從第-1天開(kāi)始5.順鉑，2mg/kg/皮下注射，3x/wk(M，W，F(xiàn))共六次 10治療從第1天開(kāi)始測(cè)試方案第-1天將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照和治療組。記錄動(dòng)物初始體重。向抗體組施用第一次治療。制備計(jì)量溶液。治療對(duì)技術(shù)人員保密直至試驗(yàn)結(jié)束。
第0天植入腫瘤。在植入小鼠的腫瘤上澆注細(xì)菌培養(yǎng)物。
第1天向陽(yáng)性化療組施加第一次治療。
第4天在matrigel上記錄初始腫瘤大小測(cè)量值作為腫瘤基線。繼續(xù)記錄小鼠的腫瘤大小及體重，每周2次。監(jiān)測(cè)每日研究，記錄動(dòng)物的任何反常表現(xiàn)。
終點(diǎn)初始體重腫瘤大小及體重測(cè)量值實(shí)施例7體內(nèi)種間移植腫瘤模型-阻斷EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗-Cripto抗體為了評(píng)估NCCIT的應(yīng)答，將可結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域的抗體皮下植入人睪丸腫瘤細(xì)胞系。試驗(yàn)方法如下。結(jié)果示于圖2。
方法和材料動(dòng)物使用無(wú)胸腺雄性裸鼠。用耳朵打孔的方式逐個(gè)編號(hào)動(dòng)物。
腫瘤NCCIT，縱隔混合的生殖細(xì)胞，最初獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的人睪丸癌體外細(xì)胞系。細(xì)胞系用不加抗生素的RPMI-1640/10％FBS體外傳代6代。在動(dòng)物右側(cè)腹將5×106個(gè)細(xì)胞/0.2ml matrigel皮下植入動(dòng)物。
組# 治療小鼠#1 介質(zhì)對(duì)照，(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH7.2)，180.2ml/小鼠，腹膜內(nèi)注射，Q14D治療從第-1天開(kāi)始2.A27F6.1，1mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D10治療始于第-1天，荷載劑量2.6mg/kg/小鼠3.A27F6.1，10mg/kg/腹膜內(nèi)注射，Q14D 10治療從第-1天開(kāi)始，荷載劑量21.2mg/kg/小鼠4.順鉑，2mg/kg/皮下注射，3x/wk(M，W，F(xiàn))共六次 10治療從第1天開(kāi)始測(cè)試方案第-1天將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照和治療組。記錄動(dòng)物初始體重。向抗體組施用第一次治療。制備計(jì)量溶液。治療對(duì)技術(shù)人員保密直至試驗(yàn)結(jié)束。
第0天植入腫瘤。在植入小鼠的腫瘤上澆注細(xì)菌培養(yǎng)物。采樣的24小時(shí)和48小時(shí)后，細(xì)菌培養(yǎng)物為污染物陰性。
第1天向陽(yáng)性化療組施加第一次治療。
第4天在matrigel上記錄初始腫瘤大小測(cè)量值作為腫瘤基線。繼續(xù)記錄小鼠的腫瘤大小及體重，每周2次。監(jiān)測(cè)每日研究，記錄動(dòng)物的任何反常表現(xiàn)。
終點(diǎn)初始體重腫瘤大小及體重測(cè)量值實(shí)施例8阻斷ALK4結(jié)合的Cripto mabs為了評(píng)估Cripto-特異性單克隆抗體能否干擾Cripto結(jié)合活化素I型受體Alk4的能力，我們?cè)诹魇郊?xì)胞計(jì)量術(shù)中使用了穩(wěn)定表達(dá)Alk4的293細(xì)胞系。為了制備該細(xì)胞系，用表達(dá)C末端加了HA表位的Alk4的質(zhì)粒和表達(dá)藥物嘌呤霉素的質(zhì)粒按10∶1的比例共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。然后用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞直至集落形成。然后，挑取集落，擴(kuò)增，然后用HA的western印跡試驗(yàn)分析Alk4的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照用的未轉(zhuǎn)染293細(xì)胞相比，克隆21(293-Alk4-21)表達(dá)高水平的Alk4。
為了用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析Cripto-Alk4結(jié)合，使用一種與人IgG Fc部分(CrdelC-Fc)融合的可溶型Cripto(第1-169位氨基酸)。取約5μg/mlCrdelC-Fc或?qū)φ沼肍c蛋白，在總體積50μl的FACS緩沖液(PBS加0.1％BSA)中與3×105個(gè)293-Alk4-21細(xì)胞冰上孵育30分鐘。對(duì)于含有抗-Cripto抗體的試樣而言，加細(xì)胞前，5μg/ml CrdelC-Fc與50μg/ml的每一種Cripto抗體(A10.B2.18，A40.G12.8，A27.F6.1，A8.H3.1，A19.A10.30，A6.F8.6，A8.G3.5，A6.C12.11)冰上預(yù)孵育。然后用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞，通過(guò)用購(gòu)自Jackson Immunologics的R-藻紅蛋白-偶聯(lián)的山羊抗-人IgG(Fc片段特異性)孵育細(xì)胞來(lái)檢測(cè)結(jié)合后的Fc蛋白。然后再次洗滌樣本，用含1％多聚甲醛的PBS固定，用常規(guī)流式細(xì)胞計(jì)量方法分析。FACS的結(jié)果圖示于圖3。
上述本發(fā)明的一些實(shí)施方案下文概述，包括但不限于下述實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)的前題下可以對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方案作出多種多樣的改動(dòng)和修飾。無(wú)疑所有這些修改后的實(shí)施方案都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
因此本申請(qǐng)中引述的每一出版物作為一個(gè)整體在此引入作為參考。
序列表<110>比奧根公司(Biogen，Inc.)米歇爾·薩尼科拉-內(nèi)德?tīng)?Sanicola-Nadel，Michele)凱文·威廉斯(Williams，Kevin)蘇珊·希弗(Schiffer，Susan)保羅·雷霍恩(Rayhorn，Paul)<120>Cripto阻斷抗體及其用途<130>A117 PCT<140>待定<141>2002-04-16<150>60/286,782<151>2001-04-26<150>60/293,020<151>2001-05-17<150>60/301,091<151>2001-06-26<150>60/367,002<151>2002-03-22<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>188<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>1Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile1 5 10 15Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly20 25 30His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp35 40 45Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser50 55 60Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg65 70 75 80Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala85 90 95Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys100 105 110Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
115 120 125Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala145 150 155 160Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met165 170 175Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr180 185<210>2<211>188<212>PRT<213>人(Homo Sapien)<400>2Met Asp Cys Arg Lys Met Val Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile1 5 10 15Met Ala Ile Ser Lys Ala Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly20 25 30His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Asp Leu Ala Phe Arg Asp35 40 45Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser50 55 60Gln Arg Val Leu Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg65 70 75 80Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Glu Ser Phe Cys Ala85 90 95Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys100 105 110Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys115 120 125Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala145 150 155 160Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met165 170 175Leu Ala Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr180 185
CR-1的188個(gè)氨基酸的序列如下[SEQ ID NO1]MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGICLSIQSYYCR-3的188個(gè)氨基酸的序列如下[SEQ ID NO2]MDCRKMVRFSYSVIWIMAISKAFELGLVAGLGHQEFARPSRGDLAFRDDSIWPQEEPAIRPRSSQRVLPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLESFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPHDTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLAGICLSIQSYY
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合Cripto配體/受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的表位的抗體。
2.權(quán)利要求1中的抗體，其中所述的Cripto選自SEQ ID NO1或2。
3.權(quán)利要求2中的抗體，其中所述的表位為EGF-樣結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求2中的抗體，其中所述的表位為富含cys的結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求2中的抗體，該抗體選自A6C12.11，A6F8.6，A7H1.19，A8F1.30，A8G3.5，A8H3.1，A8H3.2，A19A10.30，A10B2.18，A27F6.1，A40G12.8，A2D3.23，A7A10.29，A9G9.9，A15C12.10，A15E4.14，A17A2.16，A17C12.28，A17G12.1，A17H6.1，A18B3.11，A19E2.7，B3F6.17，和B6G7.10。
6.權(quán)利要求3中的抗體，該抗體選自A40G12.8，A8H3.1，A27F6.1，B6G7.10，A17G12.1和A18B3.11。
7.權(quán)利要求4中的抗體，該抗體選自A19A10.30，A8G3.5，A6F8.6和A6C12.11。
8.一種抗體，它與Cripto第46-62位氨基酸殘基所示結(jié)構(gòu)域中的表位特異性結(jié)合。
9.權(quán)利要求8中的抗體，該抗體為A10B2.18和B3F6.17。
10.一種與表位特異性結(jié)合的抗體，所述表位選自可被下列抗體結(jié)合的表位A6C12.11，A6F8.6，A7H1.19，A8F1.30，A8G3.5，A8H3.1，A8H3.2，A19A10.30，A10B2.18，A27F6.1，A40G12.8，A2D3.23，A7A10.29，A9G9.9，A15C12.10，A15E4.14，A17A2.16，A17C12.28，A17G12.1，A17H6.1，A18B3.11，A19E2.7，B3F6.17，和B6G7.10。
11.一種特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。
12.權(quán)利要求11中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。
13.權(quán)利要求12中的抗體，該抗體選自A40G12.8，A8H3.1和A27F6.1。
14.權(quán)利要求11中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
15.權(quán)利要求14中的抗體，該抗體為A6C12.11。
16.權(quán)利要求11中的抗體，該抗體選自A40G12.8，A8H3.1，A27F6.1，和A6C12.11。
17.一種特異性結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。
18.權(quán)利要求17中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。
19.權(quán)利要求17中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
20.權(quán)利要求17中的抗體，該抗體選自A27F6.1，A8G3.5和B6G7.10。
21.一種能特異性結(jié)合Cripto、調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。
22.權(quán)利要求21中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。
23.權(quán)利要求21中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
24.權(quán)利要求21中的抗體，該抗體為A27F6.1。
25.一種由選自下列的雜交瘤制備的抗體A6F8.6(ATCC保藏號(hào)PTA-3318)，A8G3.5(ATCC保藏號(hào)PTA-3317)，A8H3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3315)，A10B2.18(ATCC保藏號(hào)PTA-3311)，A27F6.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3310)，A40G12.8(ATCC保藏號(hào)PTA-3316)，A17G12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-3314)，A18B3.11(ATCC保藏號(hào)PTA-3312)，B3F6.17(ATCC保藏號(hào)PTA-3319)，和B6G7.10(ATCC保藏號(hào)PTA-3313)。
26.一種特異性結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4之間相互作用的抗體。
27.權(quán)利要求26中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。
28.權(quán)利要求26中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
29.權(quán)利要求26中的抗體，該抗體選自A8G3.5，A6F8.6和A6C12.11。
30.一種能特異性結(jié)合Cripto、阻斷Cripto和ALK4之間相互作用且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。
31.權(quán)利要求30中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto的EGF-樣結(jié)構(gòu)域中的表位。
32.權(quán)利要求30中的抗體，該抗體可特異性結(jié)合Cripto富含cys的結(jié)構(gòu)域中的表位。
33.權(quán)利要求30中的抗體，該抗體為A8G3.5。
34.一種能內(nèi)化Cripto的Cripto抗體。
35.權(quán)利要求34中的抗體，其中所述抗體與化療藥物偶聯(lián)。
36.權(quán)利要求34中的抗體，該抗體選自A27F6.1和B3F6.17。
37.一種用于向患有表達(dá)Cripto的腫瘤的受試者施用的組合物，該組合物包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)所述的抗體。
38.權(quán)利要求37中的組合物，其中所述的受試者為人。
39.權(quán)利要求37中的組合物，還包括一種可藥用賦形劑。
40.權(quán)利要求37中的組合物，其中所述的抗體與一種化療藥物偶聯(lián)。
41.權(quán)利要求37中的組合物，還包括未偶聯(lián)的化療藥物。
42.一種體外調(diào)控樣本中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括向樣本中加入權(quán)利要求37所述組合物的步驟。
43.一種調(diào)控受試者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的權(quán)利要求37所述組合物。
44.權(quán)利要求43中的方法，其中所述受試者為人。
45.一種治療過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要求37所述組合物。
46.一種治療過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要求39所述組合物。
47.一種治療過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要求40所述組合物。
48.一種治療過(guò)表達(dá)Cripto的腫瘤患者的方法，該方法包括向所述受試者施用有效量的權(quán)利要求41所述組合物。
49.權(quán)利要求42中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
50.權(quán)利要求43中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
51.權(quán)利要求44中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
52.權(quán)利要求45中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
53.權(quán)利要求46中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
54.權(quán)利要求47中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
55.權(quán)利要求48中的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自乳腺、睪丸、結(jié)腸、肺、卵巢、膀胱、子宮、子宮頸、胰腺以及胃的腫瘤細(xì)胞。
56.一種測(cè)定組織是否表達(dá)Cripto的方法，該方法包括使用權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述抗體通過(guò)免疫測(cè)定對(duì)取自受試者的組織進(jìn)行分析的步驟。
57.一種測(cè)定細(xì)胞系是否表達(dá)Cripto的方法，該方法包括使用權(quán)利要求1-37中任一項(xiàng)所述抗體通過(guò)免疫測(cè)定對(duì)該細(xì)胞系進(jìn)行分析的步驟。
58.權(quán)利要求1中的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
59.權(quán)利要求1中的抗體，其中所述抗體為人源化抗體。
60.權(quán)利要求1中的抗體，其中所述抗體為人抗體。
61.一種治療受試者中與不良細(xì)胞增生相關(guān)的病癥的方法，該方法包括向所述受試者施用權(quán)利要求37所述組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了Cripto阻斷抗體，或其生物功能片段。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能調(diào)控Cripto信號(hào)傳導(dǎo)的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能阻斷Cripto和ALK4間相互作用的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto，調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明提供了可結(jié)合Cripto，阻斷Cripto和ALK4間相互作用，且能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的抗體。本發(fā)明還提供了使用這些抗體進(jìn)行治療、診斷和研究的方法。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1606453SQ02812887
公開(kāi)日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2002年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月26日
發(fā)明者米歇爾·薩尼科拉-內(nèi)德?tīng)? 凱文·威廉斯, 蘇珊·希弗, 保羅·雷霍恩 申請(qǐng)人:比奧根公司