專利名稱：小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑，其含有白細胞介素-6(IL-6)的拮抗劑作為有效成分。小兒慢性關節(jié)炎相關疾病包括小兒慢性關節(jié)炎，斯提爾氏病等。
背景技術：
IL-6是被稱為B細胞刺激因子2(BSF2)或干擾素β2的細胞因子。IL-6作為與B淋巴細胞系細胞的活化相關的分化因子被發(fā)現(xiàn)(Hirano，T.etal.，Nature(1986)324，73-76)，之后，已明確IL-6為對各種細胞的功能有影響的多功能細胞因子(Akira，S.et al.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78)。有報告指出，IL-6是誘導T淋巴細胞系細胞的成熟化的因子(Lotz，M.et al.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258)。
IL-6在細胞上通過兩種蛋白質(zhì)傳遞其生物學活性。其一是，IL-6結合的分子量約80kD的配體結合性蛋白質(zhì)的IL-6受體(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825-828)。IL-6受體除了跨細胞膜在細胞膜上表達的膜結合型外，主要也作為從其細胞外區(qū)域形成的可溶性IL-6受體存在。
另一個是與非配體結合性的信號傳遞有關的分子量約130kD的膜蛋白質(zhì)gp130。IL-6和IL-6受體通過形成IL-6/IL-6受體復合體、然后和gp130結合，使IL-6的生物學活性被傳遞入細胞內(nèi)(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573-581)。
IL-6拮抗劑為阻礙IL-6的生物學活性傳遞的物質(zhì)。到目前為止，已知對于IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、對于IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、對于gp130的抗體(抗gp130抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。
關于抗IL-6受體抗體，有很多報告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137-146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621-630、國際專利申請公開號WO 95-09873、法國專利申請公開號FR2694767、美國專利號US 521628)。已知其中之一是通過將小鼠抗體PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)的互補決定區(qū)(CDR)向人抗體移植得到的人源化PM-1抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)。
小兒慢性關節(jié)炎(Chronic Arthritides Diseases of Childhood)是以未滿16歲發(fā)生的慢性關節(jié)炎疾病為主的疾病，且是在小兒中發(fā)生的膠原性疾病中最多的疾病。由于與成人的慢性風濕關節(jié)病(Rheumatoid Arthritis(RA))有區(qū)別，不能說是類似的疾病，有各種各樣的病型，因此有將其作為與成人的慢性風濕關節(jié)病不同的疾病進行處理的傾向。
作為小兒慢性關節(jié)炎的名稱，在日本是按照美國的診斷基準使用“幼兒型類風濕關節(jié)炎Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA))”，但在歐洲則主要使用幼兒慢性關節(jié)炎Juvenile Chronic Arthritis(JCA)。最近也使用自發(fā)性慢性關節(jié)炎Idiopathic Chronic Arthritis(ICA)或是幼兒自發(fā)性關節(jié)炎Juvenile Idiopathic Arthritis(JIA)等。
小兒慢性關節(jié)炎的類型被分成幾類，美國風濕病學協(xié)會(AmericanCollege of Rheumatology(ACR))將在未滿16歲的小兒中發(fā)生的持續(xù)6周或以上的關節(jié)炎疾病的分為1)全身型(Systemic onset JRA)、2)多關節(jié)炎型(Polyarticular)、3)少關節(jié)炎型(Pauciarticular)三種(ARA分類)(JRA Criteria Subcommittee of the Diagnostic andTherapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism AssociationArthritis Rheum 20(Suppl)195，1977)。另外在歐洲，European LeagueAgainst Rheumatism(EULAR)雖然在關節(jié)炎的持續(xù)時間在三個月或以上這一點，或由于牛皮蘚、強直性脊椎炎等原因引起的關節(jié)炎除外這一點等與上述ARA分類不同，但進行了同樣三種病型的分類。(Bulletin 4，Nomenclature and classification of Arthritis in Children.Basel，NationalZeitung AG，1977)。
最近，有重新認識這種分類的傾向，International League of Associationfor Rheumatolagy(ILAR)在1995年提出小兒自發(fā)性關節(jié)炎(IdiopathicArthritides of Childhood)的分類提案(Fink CW，Proposal for thedevelopment of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood.J.Rheumatol.，vol.22 1566(1995))，進一步在1997年將對其的修改作為ILAR案提案(Southwood TR，Classifying childhood arthritis.Ann.Rheum.Dis.Vol.56，79(1997))。這種分類中分為1)全身型關節(jié)炎(SystemicArthritides)、2)多關節(jié)炎型(RF陽性型)(Polyarthritis RF positive)、3)多關節(jié)炎型(RF陰性型)(Polyarthritis RF negative)、4)少關節(jié)炎型(Oligoarthritis)、5)發(fā)展型少關節(jié)炎型(Extended oligoarthritis)、6)附著部炎癥相關關節(jié)炎(Enthesitis related Arthritis)、7)牛皮癬相關關節(jié)炎(Psoriatic Arthritis)、8)其他。
進一步本發(fā)明者們提案將小兒慢性關節(jié)炎分為1)小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(Primary Chronic Arthritides ofChildhood)(1)PARASH綜合征(SPRASH syndrome)(SPRASH高熱(spikingfever)，心包炎(pericarditis)，皮疹(rash)，關節(jié)炎(arthritis)，脾(腫)大(splenomegaly)，肝腫大(hepatomegaly))。
首先出現(xiàn)弛張熱和皮疹癥狀、診斷有漿膜炎、肝脾腫大癥狀，同時或延遲并發(fā)關節(jié)炎，但有時未診斷是關節(jié)炎。
(2)小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(Idiopathic Chronic Arthritides ofChildhood)沒有基礎病患，關節(jié)炎即是病患的中心。
a)類風濕病因子(RF)陽性型b)抗核抗體(ANA)陽性型
c)RF/ANA陰性型2)小兒繼發(fā)性慢性關節(jié)炎(Secondary Chronic Arthritides ofChildhood)伴隨遺傳性，非遺傳性的原疾病表現(xiàn)的關節(jié)炎(橫田俊平、“小児慢性関節(jié)炎の最近の治療法の進步”、リウマ于、39卷、860、(1999))。
有報道指出小兒慢性關節(jié)炎與各種細胞因子有關。特別是，認為炎癥細胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α與抗炎癥細胞因子IL-1 ra(IL-1受體-拮抗劑)、IL-10、IL-13、sTNFR(可溶性TN F受體)的不平衡與疾病相關。
作為小兒慢性關節(jié)炎的治療，以往使用非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)甾體藥、抗風濕藥(金劑等)、免疫抑制劑、氨甲蝶呤(MTX等)治療。但是不同患者其治療效果不一定，所以希望開發(fā)出更有效的治療方法。
斯提爾氏病(Stilldisease)，是1897年英國的小兒科醫(yī)生斯提爾報道的，該疾病是作為與成人的慢性風濕關節(jié)病具有明顯不同的臨床癥狀的疾病被報道的在小兒到成人(成人主要是青年期)中發(fā)病的疾病，主要癥狀為發(fā)熱、紅斑、關節(jié)炎、漿膜炎等。其中將成人病例稱為成人斯提爾氏病(Adult onset Still’s disease)，在斯提爾氏病中，類風濕病因子通常是陰性的。
斯提爾氏病，在小兒中，是在未滿16歲的小兒中發(fā)生的慢性關節(jié)炎的幼兒性風濕疾病(Juvenile Rheumatoid Arthritis(JRA)，JCA(JuvenileChronic Arthritis)，Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA))中的全身發(fā)癥型(Systemic Type)的別名。斯提爾氏病的病因，雖然有關于病毒等的環(huán)境要因或HLA等的宿主要因或免疫異常等的報道，但是現(xiàn)在還不十分清楚。
成人斯提爾氏病與小兒斯提爾氏病雖然除了發(fā)病年齡不同外還有某些臨床癥狀不同，但基本可認為是同種疾病。小兒斯提爾氏病指的是上述的全身發(fā)病型的JRA，但由于JRA在臨床上與成人的風濕關節(jié)疾病(Rheumatoid Arthritis，(RA))有很多地方不同，因此作為別的疾病治療，也由于同樣原因，成人的斯提爾氏病大多作為風濕性疾病中獨立的疾病單位被處理。
作為斯提爾氏病的診斷標準，已知有Yamaguchi(Journal ofRheumatology.19(3)424-30，1992)、Reginato(Seminars in Arthritis&Rheumatism.17(1)39-57，1987)、Cush(Rheumatology Grand Rounds，University of Pittsburgh Medical CenterJan.30，1984)、Goldman(Southern Medical Journal 73555-563，1980)等標準。
關于斯提爾氏病與細胞因子的關系，曾報道了IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細胞因子與斯提爾氏病的關系，認為其中的IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥性細胞因子與斯提爾氏病的病態(tài)有某些關聯(lián)。
關于IL-6，de Benedetti等人報告指出在小兒斯提爾氏病中，血清中IL-6值上升(Arthritis Rheum.Vol.34，1158，1991)，同樣據(jù)de Benedetti等人報道，小兒斯提爾氏病患者的血清中存在大量IL-6/可溶性IL-6受體(sIL-6R)復合體，可看到這種復合體的水平與CRP值有相關關系(J.Clin.Invest.Vol.93，2114，1994)。另外Rooney等人也作了在小兒斯提爾氏患者的血漿中IL-6與TNF-α的水平上升的報道(Br J Rheumatol.Vol.34 454，1995)。
作為斯提爾氏病的治療，以往用非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)甾體藥、抗風濕藥(金劑等)、免疫抑制劑、γ球蛋白制劑、氨甲蝶呤(MTX等)。但是由于患者不同其治療效果不一定，因此希望開發(fā)出更有效的治療方法。
發(fā)明的公開因此本發(fā)明是要提供一種與以往的小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑不同形式的新的小兒慢性關節(jié)炎相關疾病的治療劑。在本發(fā)明中，小兒慢性關節(jié)炎相關疾病包括小兒慢性關節(jié)炎以及斯提爾氏病。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題，進行了各種研究，結果發(fā)現(xiàn)白細胞介素-6(IL-6)的拮抗劑對小兒慢性關節(jié)炎相關疾病有治療效果，并完成了發(fā)明。
因此本發(fā)明提供一種含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分構成的小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑。
更具體地說，本發(fā)明提供一種含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分的小兒慢性關節(jié)炎治療劑。
本發(fā)明進一步提供一種含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分的斯提爾氏病治療劑。
發(fā)明的實施方案上述IL-6拮抗劑優(yōu)選是對于IL-6受體的抗體，也優(yōu)選是對于人IL-6受體的單克隆抗體或對于小鼠IL-6受體的單克隆抗體。作為上述對于人IL-6受體的單克隆抗體可以列舉PM-1抗體，另外，作為對于小鼠IL-6受體的單克隆抗體可以列舉MR16-1抗體。
上述的抗體優(yōu)選嵌合抗體，人源化抗體或是人抗體，例如有人源化PM-1抗體。
作為本發(fā)明治療劑治療對象的小兒慢性關節(jié)炎，包括前所述的ARA、EULAR、ILAR以及發(fā)明者們所分類的所有疾病。隨著血清學診斷法和治療方法的進步，現(xiàn)在關于小兒慢性關節(jié)炎的疾病類型分類在世界范圍內(nèi)已被重新認識，可以說正處于“病型分類的混亂期”，但是作為本發(fā)明治療劑的優(yōu)選治療對象，有ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型、少關節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型、少關節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性)、多關節(jié)炎型(RF陰性)、少關節(jié)炎型、發(fā)展型少關節(jié)炎型，在本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(SPRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型，b.抗核抗體(ANA)陽性型，c.RF/ANA陰性型))；作為特別優(yōu)選的治療對象，是ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性)、多關節(jié)炎型(RF陰性)、發(fā)展型少關節(jié)炎型，本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(SPRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型))。進一步，作為最優(yōu)選的治療對象，可列舉ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型，EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型，ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性)、發(fā)展型少關節(jié)炎型，本發(fā)明者們的分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(S PRASH綜合征、小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型)。
在本發(fā)明使用的IL-6拮抗劑，若為對小兒慢性關節(jié)炎相關疾病顯示出治療效果，則不論其由來、種類和形狀。
IL-6拮抗劑為隔斷IL-6產(chǎn)生的信號傳遞、阻礙IL-6的生物學活性的物質(zhì)。IL-6拮抗劑優(yōu)選為對IL-6、IL-6受體及gp130的任一個的結合具有阻礙作用的物質(zhì)。作為IL-6拮抗劑，可以列舉例如抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或者IL-6或IL-6受體的部分肽、以及和它們顯示相同活性的低分子物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的抗體、以及通過基因工程的手段產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的抗體。該抗體通過與IL-6結合，阻礙IL-6與IL-6受體結合、阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗體(Sato，K.et al.，第21次日本免疫學會總會、學術紀錄(1991)21，166)等。
產(chǎn)生抗IL-6抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術、如下所述進行制備。即，使用IL-6作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞按照通常的細胞融合法和已知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆的抗體產(chǎn)生細胞來制備。
具體地，制備抗IL-6抗體可按下面的方法進行。例如，作為取得抗體的致敏抗原被使用的人IL-6可以通過使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列得到。
在公知的表達型載體系中插入IL-6的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用公知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6蛋白質(zhì)，可將該純化IL-6蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將IL-6蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，可以使用公知的手段作為多克隆抗體或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的物質(zhì)、和通過基因工程的手段，產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的物質(zhì)。該抗體通過與IL-6受體結合，阻礙IL-6與IL-6受體結合、阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MR16-1抗體(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗體(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)等。其中，作為特別優(yōu)選的抗體可以列舉PM-1抗體。
另外，產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤細胞株作為PM-1，基于布達佩斯條約，在平成2年7月10日、作為FERM BP-2998被國際保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號)。另外，產(chǎn)生MR16-1抗體的雜交瘤細胞株作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1，基于布達佩斯條約，在平成3年3月13日、作為FERM BP-5875被國際保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號)。
產(chǎn)生抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用已知技術、如下進行制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞按照通常的細胞融合法和已知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產(chǎn)生細胞來制備。
具體地說，制備抗IL-6受體抗體可按下面的方法進行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的人IL-6受體可以通過使用在歐洲專利申請公開號EP 325474中公開的、小鼠IL-6受體可以通過使用在日本專利申請公開號特開平3-155795中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列來得到。
IL-6受體蛋白質(zhì)，有在細胞膜上表達的蛋白質(zhì)和從細胞膜脫離的蛋白質(zhì)(可溶性IL-6受體)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673-676)兩種?？扇苄訧L-6受體抗體是由與細胞膜結合的IL-6受體的實質(zhì)性細胞外區(qū)域構成的，在缺損跨細胞膜區(qū)域或跨細胞膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域方面與膜結合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質(zhì)只要是在本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的制備中作為致敏抗原使用，就可以使用任一種IL-6受體。
在公知的表達型載體系中插入IL-6受體的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用已知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6受體蛋白質(zhì)，可將該純化IL-6受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達IL-6受體的細胞或IL-6受體蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
含有含編碼人IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)，基于布達佩斯條約，在1989年1月9日、作為HB101-pIBIBSF2R，保藏號FERM BP-2232被國際保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所。
本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產(chǎn)生于雜交瘤中的抗體、和通過基因工程的手段產(chǎn)生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的抗體。該抗體通過和gp130結合，阻礙IL-6/IL-6受體復合體與gp130結合、并阻斷IL-6的生物學活性向細胞內(nèi)傳遞。
作為這種抗體，可以列舉AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)B-S12抗體以及B-P8抗體(特開平8-291199)等。
產(chǎn)生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術、如下所述進行制備。即，使用gp130作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞通過通常的細胞融合法和公知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產(chǎn)生細胞來制備。
具體地，制備單克隆抗體可按下面的方法進行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的gp130可以使用在歐洲專利申請公開號EP 411946中公開的gp130基因/氨基酸序列來得到。
在已知的表達型載體系中插入gp130的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用已知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的gp130蛋白質(zhì)，可將該純化gp130受體蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達gp130的細胞或gp130蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)作為致敏抗原使用。
作為用致敏抗原免疫的哺乳動物，雖沒有特別的限制，但是優(yōu)選考慮與在細胞融合中使用的親代細胞的相容性來進行選擇，一般地可以使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
用致敏抗原免疫動物時可以按已知的方法進行。例如，作為一般的方法，通過在哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原進行。具體地說，用適量的PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)或生理鹽水等稀釋致敏抗原、懸濁液根據(jù)需要混合通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑，乳化后，優(yōu)選每4-21日向哺乳動物給藥數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時也可以使用適當?shù)妮d體。
這樣進行免疫、確認血清中所期望的抗體水平上升后，從哺乳動物中取出免疫細胞、進行細胞融合。作為進行細胞融合的優(yōu)選的免疫細胞，特別可以列舉脾細胞。
作為和上述免疫細胞融合的另一親代細胞的哺乳動物骨髓瘤細胞，適宜使用以前、已知的各種細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immnnol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合基本可以按照已知的方法、例如Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等進行。
更具體地說，上述細胞融合例如可在細胞融合促進劑存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行。作為融合促進劑，可使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血細胞凝集病毒(HVJ)等，進一步，根據(jù)需要，為了提高融合效率、也可以添加二甲基亞砜等的輔助溶劑來使用。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例，例如，相對于骨髓瘤細胞、免疫細胞優(yōu)選為1-10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用在上述骨髓瘤細胞株的增殖中適合的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，除此之外，還可使用在該種細胞培養(yǎng)中可使用的通常的培養(yǎng)液，進一步，也可能并用胎牛血清(FCS)等的血清補液。
細胞融合是將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的規(guī)定量在上述培養(yǎng)液中充分混合，通常在30-60％(w/v)的濃度下添加預先加熱至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量為1000-6000左右的PEG溶液，通過混合形成目的融合細胞(雜交瘤)。然后，通過反復進行依次添加適當?shù)呐囵B(yǎng)液，離心除去上清液的操作、可以除去雜交瘤的繁殖中不優(yōu)選的細胞融合劑等。
該雜交瘤通過在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來進行選擇。在該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)使目的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)滅絕所需的充分的時間、通常要持續(xù)數(shù)日-數(shù)周。然后，實施通常的極限稀釋法、進行產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤的篩選和克隆。
另外，除了在人以外的動物中免疫抗原得到上述雜交瘤以外、將人淋巴細胞在體外被所期望的抗原蛋白質(zhì)或抗原表達細胞致敏、使致敏B淋巴細胞和人骨髓瘤細胞、例如U266融合，也可以得到對期望的抗原或抗原表達細胞具有結合活性的所期望的人抗體(參照特公平1-59878)。進一步，也可以對具有人抗體基因儲藏庫的轉基因動物給與抗原或抗原表達細胞，按上述方法得到所期望的人抗體(參照國際專利申請公開號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
產(chǎn)生這樣制備的單克隆抗體的雜交瘤，可在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，另外，也可在液氮中長期保存。
從該雜交瘤取得單克隆抗體時，可以采用將該雜交瘤用通常的方法培養(yǎng)、得到其培養(yǎng)上清液的方法，或將雜交瘤投入與其有相容性的哺乳動物中使其增殖、得到其腹水的方法等。前者的方法適于得到高純度的抗體，另一方面，后者的方法適于抗體的大量生產(chǎn)。
例如，產(chǎn)生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備，可以按照特開平3-139293中公開的方法進行。可以進行將基于布達佩斯條約，在平成2年年7月10日、作為FERM BP-2998被國際保藏在工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(茨城縣つくば市東1丁目1番3號)的產(chǎn)生PM-1抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)、得到腹水，從該腹水純化PM-1抗體的方法，或將該雜交瘤在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中、例如10％胎牛血清、含有5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)等中培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清液純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用基因重組技術，由雜交瘤克隆抗體基因，將其整合入適當?shù)妮d體，然后將載體導入宿主中而產(chǎn)生的重組型抗體(例如，參照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體地，產(chǎn)生目的抗體的細胞，例如由雜交瘤分離編碼抗體的可變(V)區(qū)域的mRNA。mRNA的分離可以按照公知的方法，例如胍超離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制備總RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。另外，通過使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)直接制備mRNA。
由得到的mRNA使用逆轉錄酶合成抗體V區(qū)域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進行。另外，進行cDNA的合成及擴增中也可以使用用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制)及PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)。由得到的PCR產(chǎn)物純化目的DNA片斷，與載體DNA連結。進一步，由此制備重組載體、導入大腸桿菌等中、選擇集落制備所期望的重組載體。目的DNA的堿基序列可通過已知的方法、例如脫氧法確認。
若得到編碼目的抗體的V區(qū)域的DNA、將其和編碼期望的抗體恒定區(qū)域(C區(qū)域)的DNA連結，整合入表達型載體中。另外，也可以將含有編碼抗體的V區(qū)域的DNA整合入含有抗體C區(qū)域的DNA的表達型載體中。
制備本發(fā)明中使用的抗體，是將下述的抗體基因整合入表達型載體，以使其在表達控制區(qū)域、例如在增強子、啟動子的控制下表達。然后，通過該表達型載體轉化宿主細胞、可以使抗體表達。
本發(fā)明中，以降低對人的異種抗原性等作為目的、可以使用人為地改變了的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體。這些修飾抗體可以用已知的方法制備。
嵌合抗體可通過將編碼上述得到的抗體V區(qū)域的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結，通過將其整合入表達型載體中、導入宿主產(chǎn)生得到(參照歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO92-19759)。使用該已知方法，可以得到本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，含有編碼嵌合PM-1抗體的L鏈及H鏈的V區(qū)域的DNA的質(zhì)粒，分別被命名為pPM-k3和pPM-h1，具有該質(zhì)粒的大腸桿菌基于布達佩斯條約，在1991年2月11日分別作為NCIMB 40366和NCIMB 40362被國際保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collectionsof Industrial and Marine Bacteria Limited)。
人源化抗體也被稱為重構人抗體，是將人以外的哺乳動物、例如小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植入人抗體的互補決定區(qū)得到的抗體，也知道其一般的基因重組方法(參照歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO 92-19759)。
具體地說，將設計為連結小鼠抗體的CDR和人抗體的構架區(qū)域(FR)的DNA序列，通過PCR法由在制造成末端部分具有重疊部分的多個寡核苷酸合成。將得到的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結，然后通過整合入表達型載體中，將其導入宿主產(chǎn)生可得到(參照歐洲專利申請公開號EP 239400、國際專利申請公開號WO 92-19759)。
通過CDR連結的人抗體的FR，可選擇互補決定區(qū)域形成良好的抗原結合部位的物質(zhì)。根據(jù)需要，也可以置換抗體可變區(qū)域的構架區(qū)域的氨基酸以使重構人抗體的互補決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗體、人源化抗體中也可以使用人抗體C區(qū)域。作為人抗體C區(qū)域，可以列舉Cγ，例如，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，為了改善抗體及其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)域。
嵌合抗體由來自人以外的哺乳動物的抗體的可變區(qū)域和來自人的抗體C區(qū)域構成，人源化抗體由來自人以外的哺乳動物的抗體的互補決定區(qū)域和來自人抗體的構架區(qū)域和C區(qū)域構成，為了降低人體內(nèi)的抗原性，它們作為本發(fā)明中使用的抗體是有用的。
作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選具體實例，可以列舉人源化PM-1抗體(參照國際專利申請公開號WO 92-19759)。
另外，作為人抗體的取得方法，除上述方法以外，已知還有使用人抗體的基因庫，通過淘選取得人抗體的技術。例如，將人抗體的可變區(qū)域作為單鏈抗體(scFv)用噬菌體顯示方法使其在嗜菌體表面表達，可選擇與抗原結合的嗜菌體。如果解析選擇的嗜菌體基因，可以決定與抗原結合的編碼人抗體的可變區(qū)域的DNA的序列。如果明確了與抗原結合的scFv的DNA序列，則可使用該序列制作適當?shù)谋磉_載體，從而可以取得人抗體。這種方法已是眾所周知的，可以參考WO 92/01047，WO 92/20791，WO93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388。
如上所述構建的抗體基因，可以通過公知的方法使之表達、取得。在哺乳類細胞的情況下，可通過功能性結合了經(jīng)常使用的有用的啟動子、被表達的抗體基因、在其3′側下游的poly A信號的DNA或含有該DNA的載體使之表達。例如作為啟動子/增強子，可以列舉人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。
另外，作為其它在本發(fā)明中使用的可用于抗體表達時的啟動子/增強子，也可以使用逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV 40)等的病毒啟動子/增強子或人促進因子-1α(HEF1α)等來自哺乳類細胞的啟動子/增強子。
例如，使用SV 40啟動子/增強子時，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108-114)，或者，在使用HEF1α啟動子/增強子時，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地實施。
在大腸桿菌的情況下，可以功能性結合被經(jīng)常使用的有用的啟動子、為了抗體分泌的信號序列、被表達的抗體基因并使之表達。例如作為啟動子，可以列舉1acZ啟動子、arab啟動子。在使用1acZ啟動子時，可以按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用arab啟動子時，可以按照Better等的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041-1043)。
作為為了抗體分泌的信號序列，在產(chǎn)生于大腸桿菌的周質(zhì)間隙時，可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分離產(chǎn)生于周質(zhì)間隙的抗體后，將抗體的結構適當?shù)卦僬郫B使用(例如，參照WO96/30394)。
作為復制起點，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的物質(zhì)，進一步，為了增加宿主細胞系中的基因復制數(shù)量，表達型載體，可以含有氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。
為了制備本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產(chǎn)系。對于為制造抗體的生產(chǎn)系，有體外和體內(nèi)的生產(chǎn)系。作為體外的生產(chǎn)系，可以列舉使用真核細胞的生產(chǎn)系或使用原核細胞的生產(chǎn)系。
使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞的生產(chǎn)系。作為動物細胞，已知(1)哺乳類細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero等，(2)兩棲類細胞，例如爪蟾卵細胞，或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細胞，已知來自煙草(Nicotiana tabacum)的細胞，可以將其進行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細胞，已知酵母、例如酵母(Saccharomyces)屬、例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀真菌、例如曲霉(Aspergillus)屬、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產(chǎn)系。作為細菌細胞，已知大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過轉化將目的抗體基因導入這些細胞中，通過在體外培養(yǎng)被轉化的細胞可得到抗體。培養(yǎng)按公知的方法進行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清補液。另外，通過將導入了抗體基因的細胞移入動物的腹腔等，也可以在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
另一方面，作為體內(nèi)的生產(chǎn)系，可以列舉使用動物的生產(chǎn)系或使用植物的生產(chǎn)系。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲的生產(chǎn)系等。
作為哺乳動物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotech nology Applications，1993)。另外，作為昆蟲，可以使用蠶。使用植物時，例如可以使用煙草。
在這些動物或植物中導入抗體基因，在動物或植物的體內(nèi)使抗體產(chǎn)生，然后回收。例如，在編碼山羊β酪蛋白那樣的在乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因中插入抗體基因作為融合基因進行制備。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片斷注入山羊的胚胎中，將該胚胎導入母山羊體內(nèi)。從容納該胚胎的山羊生出的轉基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁中可得到所期望的抗體。為了增加由轉基因山羊產(chǎn)生的含有期望抗體的乳汁量，也可以對轉基因山羊使用適宜的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
另外，使用蠶時，可使蠶感染插入了目的抗體基因的桿狀病毒，通過該蠶的體液得到期望的抗體(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592-594)。另外，使用煙草時，在植物表達用載體、例如pMON 530中插入目的抗體基因，在根癌病菌樣的細菌中導入該載體。使煙、例如煙草感染該細菌，通過該煙葉可得到期望的抗體(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述，在用體外或體內(nèi)的生產(chǎn)系產(chǎn)生抗體時，可以將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合入表達型載體中、同時轉化宿主，或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合入單一的表達型載體中、使宿主轉化(參照國際專利申請公開號WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體，只要適于使用在本發(fā)明中，也可以是抗體的片斷或其修飾物。例如，作為抗體的片斷，可以列舉Fab、F(ab′)2、Fv或H鏈和L鏈的Fv用適當?shù)倪B接物連結而成的單鏈Fv(scFv)。
具體地說，抗體用酶、例如木瓜酶、胃蛋白酶處理生成抗體片段，或者，構建編碼這些抗體片段的基因、將其導入表達型載體中后，在適當?shù)乃拗骷毎惺怪磉_(例如，參照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可以通過連結抗體的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域得到。該scFv中，H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域通過連接物、優(yōu)選通過肽連接物被連結(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域可以是來自上述記載的抗體的任一種。作為連結V區(qū)域的肽連接物，可以使用例如由12-19個氨基酸殘基組成的任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA，可以通過將編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)域的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)域的DNA作為模板，使用規(guī)定其兩端的引物對，通過PCR法將這些序列中編碼期望的氨基酸序列的DNA部分擴增，然后，進一步組合引物對并擴增得到，該引物規(guī)定編碼肽連接物部分的DNA并使其兩端分別連結H鏈、L鏈。
另外，一旦制備編碼scFv的DNA、則可以按照常規(guī)方法得到含有它們的表達型載體和該表達型載體轉化的宿主，另外，使用該宿主按照常規(guī)方法，可以得到scFv。
這些抗體的片斷，可以與上述相同，取得它的基因并使之表達、通過宿主產(chǎn)生。在本發(fā)明中所說的“抗體”中也包含這些抗體的片段。
作為抗體的修飾物，可以使用和聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。在本發(fā)明中所說的“抗體”中也包含這些抗體的修飾物。為了得到這種抗體修飾物，可通過對得到的抗體進行化學修飾得到。這些方法在該領域已經(jīng)被確立。
如上所述生產(chǎn)、表達的抗體可以從細胞內(nèi)外、宿主分離純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可以用親和層析進行。作為親和層析中使用的層析柱，可以列舉例如蛋白質(zhì)A柱、蛋白質(zhì)G柱。作為蛋白質(zhì)A柱中使用的載體，可以列舉例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用在通常的蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法，沒有什么限制。
例如，若適當選擇、組合除上述親和層析以外的色譜法、過濾、超濾、鹽析、透析等，可以分離、純化本發(fā)明中使用的抗體。作為色譜法，可以列舉例如離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾等。這些色譜法適用于HPLC(高效液相色譜)。另外，也可以使用反相HPLC(反相HPLC)。
上述所得抗體的濃度測定可以通過吸光度的測定或ELISA等進行。即，用吸光度的測定時，用PBS(-)適當稀釋后、測定280nm的吸光度、1mg/ml相當于1.35OD、算出濃度。另外，用ELISA時，可以如下進行測定。即，將用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)100μl加入96孔板(Nunc制)中，在4℃下溫育1夜、固定化抗體。封閉后、添加適當稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或作為標準品的人IgG(CAPPEL制)100μl、室溫下溫育1小時。
洗滌后，加入稀釋了5000倍的堿性磷酸酯酶標記的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，在室溫下溫育1小時。洗滌后，加入底物溶液溫育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體，具有和IL-6受體的結合活性、且為不傳遞IL-6的生物學活性的物質(zhì)。即，雖然IL-6變異體相對于IL-6受體與IL-6競爭結合，但是由于不傳遞IL-6的生物學活性，故將阻斷IL-6產(chǎn)生的信號傳遞。
IL-6變異體是通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基、引入變異而制備的。雖然不管作為IL-6變異體原料的IL-6的由來，但是若考慮到抗原性等、優(yōu)選人IL-6。
具體地說，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)來預測其二次結構，通過進一步評價被置換的氨基酸殘基對總體的影響來進行。決定適當?shù)闹脫Q氨基酸殘基后、以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，按照通常使用的PCR法引入變異使氨基酸被置換，可以得到編碼IL-6變異體的基因。按照需要，將其整合入適當?shù)谋磉_型載體中、按照上述重組型抗體的表達、產(chǎn)生及純化方法可以得到IL-6變異體。
作為IL-6變異體的具體實例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公開。
本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，具有和各自IL-6受體或IL-6的結合活性，且為不傳遞IL-6生物學活性的物質(zhì)。即，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結合，通過捕捉它們可特異地阻礙IL-6與IL-6受體的結合。其結果，由于不傳遞IL-6的生物學活性，因此將阻斷IL-6產(chǎn)生的信號傳遞。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是由在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中與IL-6和IL-6受體的結合相關區(qū)域的一部分或全部的氨基酸序列組成的肽。這種肽通常由10～80、優(yōu)選為20～50、更優(yōu)選為20～40個氨基酸殘基組成。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，可通過在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中特定與IL-6和IL-6受體的結合相關的區(qū)域，將其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法來制備。
通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可將編碼期望的肽的DNA序列整合入表達型載體中，按照上述重組型抗體的表達、產(chǎn)生及純化方法可以得到。
通過肽合成法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以使用在肽合成中通常用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體地說，也可以按照續(xù)藥品的開發(fā)第14卷肽合成監(jiān)修矢島治明廣川書店1991年中記載的方法進行。作為固相合成法，可以使用使與要合成的肽的C末端對應的氨基酸與例如在有機溶劑中不溶性的支撐體結合，通過交互重復進行將用適當?shù)谋Ｗo基團保護了α-氨基及側鏈官能團的氨基酸按從C末端到N末端方向的順序逐一縮合氨基酸的反應、和使樹脂上結合的氨基酸或肽的α-氨基的保護基團脫離的反應，使肽鏈延長的方法。固相肽合成法根據(jù)使用的保護基團種類，可大致分為Boc法和Fmoc法。
這樣合成目的肽后，進行脫保護反應以及將肽鏈從支撐體切斷的反應。與肽鏈的切斷反應中，在Boc法中可以通常使用氟化氫或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氫中，在苯甲醚存在的情況下處理上述保護肽樹脂。然后，進行保護基團的脫離和從支撐體的切斷、回收肽。通過將其凍結干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以進行與上述相同的操作，進行脫保護反應以及從支撐體切斷肽鏈的反應。
得到的粗肽，由于適用于HPLC，因此可以進行分離、純化。洗脫時，可以使用在蛋白質(zhì)的純化中通常使用的水-乙腈系溶劑在最適條件下進行。分別取得相當于所得色譜法的曲線峰的餾分、將其冷凍干燥。對于這樣純化的肽餾分、通過根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量解析、氨基酸組成分析、或氨基酸序列解析等來鑒定。
IL-6部分肽及IL-6受體部分肽的具體實例，在特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及美國專利公報US 5210075中公開。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的IL-6信號傳遞阻礙活性，可以用通常使用的方法評價。具體地說，培養(yǎng)IL-6依賴性人骨髓瘤細胞株(S6B45，KPMM2)，人レンネルトT淋巴瘤細胞株KT3，IL-6依賴性細胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同時使IL-6拮抗劑共存，由此可以測定IL-6依賴性細胞的3H-胸苷的攝取。另外，培養(yǎng)IL-6受體表達細胞U266、加入125I標記的IL-6，同時加入IL-6拮抗劑，由此測定與IL-6受體表達細胞結合的125I標記的IL-6。在上述分析體系中，如果除了使IL-6拮抗劑存在的組以外、還準備不含IL-6拮抗劑的陰性對照組，比較兩者得到的結果，可以評價IL-6拮抗劑的IL-6抑制活性。
如下述實施例所示，由于通過給藥抗IL-6受體抗體，在小兒慢性關節(jié)炎患者中能夠看到治療效果，因此表明抗IL-6受體抗體等IL-6拮抗劑作為小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑是有用的。
本發(fā)明的治療對象是哺乳動物。治療對象的哺乳動物優(yōu)選為人。
本發(fā)明的小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑可以口服或非口服地全身或局部給藥。例如，可以選擇點滴等的靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，可以按照患者的年齡、癥狀來選擇適宜的給藥方法。有效給藥量在每次1kg體重0.01mg～100mg的范圍內(nèi)選擇?；蛘?，也可以選擇每個患者1～1000mg、優(yōu)選為5～50mg的給藥量。優(yōu)選的給藥量、給藥方法是，例如，在抗IL-6受體抗體的情況下，血液中存在的游離抗體程度的量為有效給藥量，作為具體的例子，1kg體重每月(4周)分1次到幾次給藥0.5mg～40mg、優(yōu)選1mg～20mg，例如在2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等給藥日程表下，用點滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法的給藥方法等。給藥日程表可以在觀察病情和血液檢查值的動向的同時將給藥間隔由2次/周或1次/周調(diào)整為1次/2周、1次/3周、1次/4周那樣延長給藥間隔。
本發(fā)明的小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑，也可以同時含有在給藥路徑下藥物所容許的載體或添加物。作為這種載體及添加物的例子，可以列舉水、藥物中容許的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、一縮二丙二醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為藥品添加物容許的表面活性劑等。使用的添加物，按照劑型可以從上述中適宜選擇或組合使用，但不限于這些。
實施例以下，通過實施例和參考例對本發(fā)明進行具體的說明，但本發(fā)明并不僅限于這些。
實施例1對有以下經(jīng)過的全身型幼兒風濕性關節(jié)患者(5歲、男性)，實行MRA治療。
治療前的經(jīng)過弛張熱(連日～40℃的單峰性發(fā)熱)、兩膝關節(jié)痛、皮疹癥狀。白血球增多，抗核抗體陰性、類風濕因子陰性、血沉值亢進、CRP值高等診斷后，開始用阿司匹林給藥，但是并未改善弛張熱和關節(jié)炎，且全身狀癥狀惡化。因此改為大量口服給藥甾體藥物(強的松龍30mg/日)，看到各種癥狀的改善。但是伴隨著強的松龍的逐漸減少，在量為10mg/日時，又復發(fā)了，住院后，用甲基強的松龍(mPSL)脈沖療法和血漿交換療法，進一步同時并用環(huán)孢霉素A(Cs A)也無改善，炎癥癥狀增強(白血球數(shù)25400/μL、CRP11.2mg/dL)，基于用血漿交換療法+mPSL脈沖療法+Cs A的見解，作為后療法用強的松龍-氟聯(lián)苯丙酸進行控制弛張熱，臨床上能看到退熱，但是血液的炎癥卻仍然維持很高的值(CRP＞5mg/dL)，出院后由于有周期性的弛張熱，實行外來中心的治療觀察。但是，患者訴說在發(fā)熱時背部疼痛增強，MBI等的精查結果，確認在第4～5胸椎有破壞性傷，可認為是由于甾體導致的受壓骨折。由于有必要向胸椎免負荷，在床上保持安靜狀態(tài)約一年，下肢肌肉顯著衰退，成為完全不能步行的狀態(tài)。雖然繼續(xù)強的松龍+氟聯(lián)苯丙酸+Cs A三者療法，但CRP也未降低至5mg/dL或以下。
治療結果由于開始以2mg/kg給藥，沒見到特別的副作用，因此增加至4mg/kg，每周給藥一次。在那以前確認的發(fā)熱很快消失，CRP約2周后陰性化，全身倦怠感也被去除，能見到患者有朝氣。強的松龍可慢慢減量，減至1mg/日。
從以上結果可知，MRA對阿司匹林、氟聯(lián)苯丙酸等非甾體抗炎藥，長期大量的甾體藥物(強的松龍(プレドニン)、甲基強的松龍(メドロ—ル)等)、環(huán)孢霉素A、甲氨蝶呤等免疫抑制藥都不能抑制病狀的小兒慢性關節(jié)炎的治療是有效的。因此，IL-6拮抗劑，特別是抗IL-6受體抗體對小兒慢性關節(jié)炎，特別是作為ARA分類的全身型、EULAR分類的全身型、ILAR分類的全身型、本發(fā)明者們分類的SPRASH綜合征的小兒慢性關節(jié)炎的治療劑是有用的。
實施例2
22歲女性。1998年4月，大腿、前胸部、手指處出現(xiàn)點狀紅斑，5月肩、肘、膝關節(jié)痛。出現(xiàn)38℃的發(fā)熱。開始使用非甾體抗炎藥抗炎劑(NSAIDs)，但發(fā)熱還是持續(xù)，7月白血球數(shù)18100/μl，CRP 18.3mg/dl，血清鐵蛋白440ng/ml。診斷為成人斯提爾氏病。2000年1月初出現(xiàn)39℃的發(fā)熱以及出現(xiàn)關節(jié)痛，認為成人斯提爾氏病的復發(fā)(CRP 15.8mg/dl，鐵蛋白205.8mg/ml)。
由于甾體減量困難，因此并用氨甲蝶呤MTX及環(huán)孢霉素(CsA)，但不能抑制病勢。由于病勢加重，呼吸狀態(tài)惡化，需要人工呼吸管理。用甾體脈沖療法改善了病勢，但并發(fā)了重癥骨質(zhì)疏松癥。開始用人源化的抗IL-6受體抗體(MRA)治療。每2周通過點滴靜脈注射MRA 200mg。給藥6日后炎癥反應陰性化，腎上腺皮質(zhì)甾體藥物能順利的減量，也未見嚴重的副作用。
從以上結果可知，MRA對于聯(lián)用MTX和CsA也不能抑制病狀的成人斯提爾氏病有效。因此，IL-6的拮抗劑，特別是抗IL-6受體抗體作為斯提爾氏病特別是成人斯提爾氏病的治療劑是有用的。
參考例1.人可溶性IL-6受體的制備使用含有編碼按Yamasaki等的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)得到的IL-6受體的cDNA的質(zhì)粒pBSF2R.236，通過PCR法制備可溶性IL-6受體。用限制酶Sph I消化質(zhì)粒pBSF2R.236，得到IL-6受體cDNA、將其插入mp18(Amersham制)中。使用設計為以便在IL-6受體cDNA中導入終止密碼子的合成寡引物，通過體外突變形成系統(tǒng)(Amersham制)、用PCR法在IL-6受體cDNA中導入變異。通過該操作終止密碼子被導入氨基酸345的位置，得到編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細胞中表達可溶性IL-6受體，使其與質(zhì)粒pSV(Pharmacia制)連結，得到質(zhì)粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的質(zhì)粒pECEdhfr中插入用Hind III-Sal I切斷的可溶性IL-6受體cDNA，得到CHO細胞表達質(zhì)粒pECEdhfr344。
通過磷酸鈣沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745-2751)向dhfr-CHO細胞株DXB-1l(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)轉染10μg的質(zhì)粒pECEdhfr344。將轉染的CHO細胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μ/ml鏈霉素的不含核苷的αMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3周。
被選擇的CHO細胞用極限稀釋法篩選，得到單一的CHO細胞克隆。用20nM～200nM濃度的氨甲蝶呤擴增該CHO細胞克隆，得到產(chǎn)生人可溶性IL-6受體的CHO細胞株5E27。用含有5％FBS的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM、Gibco制)培養(yǎng)CHO細胞株5E27?；厥张囵B(yǎng)上清液，用ELISA測定培養(yǎng)上清液中的可溶性IL-6受體的濃度。其結果，可以確認在培養(yǎng)上清液中存在可溶性IL-6受體。
參考例2.抗人IL-6抗體的制備用10μg的重組型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠，每周連續(xù)進行免疫至血清中能檢出抗IL-6抗體為止。從局部淋巴節(jié)中取出免疫細胞，用聚乙二醇1500使其與骨髓瘤細胞株P3U1融合。按照使用HAT培養(yǎng)液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，SanFrancisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤。
產(chǎn)生抗人IL-6抗體的雜交瘤如下所示進行IL-6結合分析。即，將柔軟的聚乙烯制的96孔微孔板(Dynatech Laboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氫鹽碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，將板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室溫下處理2小時。
將其用PBS洗滌后，在各孔中加入100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清液、在4℃下溫育一夜。洗滌該板后、在各孔中加入125I標記的重組型IL-6使其達到2000cpm/0.5ng/孔，洗滌后用γ計數(shù)器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定各孔的放射活性。通過IL-6結合分析，216雜交瘤克隆中32個雜交瘤克隆為陽性。在這些克隆中可得到最終穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產(chǎn)生的抗IL-6抗體MH166具有IgG1κ型的亞型。
然后，使用IL-6依賴性小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2研究與MH166抗體導致的雜交瘤增殖相關的中和活性。將MH60.BSF2細胞分別注入小孔中達到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗體的試樣，培養(yǎng)48小時，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，進而連續(xù)培養(yǎng)6小時。將細胞放置在玻璃濾紙上，用自動采集機(LaboMash Science Co.，Tokyo，Japan)處理。作為對照使用兔抗IL-6抗體。
其結果，MH166抗體，劑量依賴性地阻礙被IL-6誘導的MH60.BSF2細胞的3H胸苷的攝取。由此可知，MH166抗體中和IL-6的活性。
參考例3.抗人IL-6受體抗體的制備使按Hirata等的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900-2906)制備的抗IL-6受體抗體MT18與通過CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)按照附上的配方結合，純化IL-6受體(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825-828)。將人骨髓瘤細胞株U266用含有1％毛地黃皂苷(Wako Chemicals制)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM對氨基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals制)(毛地黃皂苷緩沖液)裂解，和與瓊脂糖4B珠結合的MT18抗體混合。然后，將該珠用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次、作為用于免疫的部分純化IL-6受體。
用由3×109個U266細胞得到的上述部分純化IL-6受體每10天免疫BALB/c小鼠4次，然后用常規(guī)方法制備雜交瘤。用下述方法調(diào)查來自成長陽性孔的雜交瘤培養(yǎng)上清液對IL-6受體的結合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)標記的5ラ107個U266細胞，用上述毛地黃皂苷緩沖液使之裂解。將裂解的U266細胞和0.04ml容量的與瓊脂糖4B珠結合的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，使用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)使35S-蛋氨酸標記的IL-6受體洗脫，用0.025ml的1M Tris(pH 7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清液和0.01ml的蛋白G瓊脂糖(Phramacia制)混合。洗滌后，將瓊脂糖和上述制備的0.005ml35S標記的IL-6受體溶液一起溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉降物，研究與IL-6受體反應的雜交瘤培養(yǎng)上清液。其結果確立了反應陽性雜交瘤克隆PM-1(FERM BP-2998)。產(chǎn)生于雜交瘤PM-1的抗體具有IgG1κ型的亞型。
用人骨髓瘤細胞株U266研究雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體相對于人IL-6受體的IL-6的結合抑制活性。人重組型IL-6用大腸桿菌制備(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41-45)、用Bolton-Hunter試劑(NewEngl and Nuclear，Boston，MA)進行125I標記的(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981)。
將4×105個U266細胞與70％(v/v)雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清液和14000cpm的125I標記的IL-6一起培養(yǎng)一小時。將70μl樣品鋪到400μl的微植菌聚乙烯管中的300μl的FCS上，離心后，測定細胞上的放射活性。
結果表明，雜交瘤PM-1產(chǎn)生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結合。
參考例4.抗小鼠IL-6受體抗體的制備通過Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168-173記載的方法，制備對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)產(chǎn)生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞，從其培養(yǎng)上清液使用將抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝膠(Biorad制)的親和性色譜柱純化小鼠可溶性IL-6受體。
混合得到的小鼠可溶性IL-6受體50μg和弗氏完全佐劑，向ウイスタ—大鼠的腹部注射。2周后開始用弗氏不完全佐劑追加免疫。第45天采集大鼠脾臟細胞，使2×108個脾臟細胞按照常規(guī)方法與1×107個小鼠骨髓瘤細胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)細胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制)的板上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液后，使小鼠可溶性IL-6受體反應。然后，通過使用兔抗小鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酯酶標記的的綿羊抗兔IgG的ELISA法篩選對于小鼠可溶性IL-6受體產(chǎn)生抗體的雜交瘤。對已確認產(chǎn)生抗體的雜交瘤克隆進行2次亞篩選，得到單一的雜交瘤克隆。此克隆被命名為MR16-1。
用MH60.BSF2細胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951-956)用3H胸苷的攝取研究該雜交瘤產(chǎn)生的抗體在小鼠IL-6的信息傳遞中的中和活性。在96孔板上制備MH60.BSF2細胞至1ラ104個/200μl/孔。在該板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)44小時后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小時后測定3H胸苷的攝取。結果表明，MR16-1抗體抑制MH60.BSF2細胞的3H胸苷攝取。
因此表明，雜交瘤MR16-1(FERM BP-5874)產(chǎn)生的抗體，阻礙IL-6與IL-6受體的結合。
權利要求
1.一種小兒慢性關節(jié)炎相關疾病治療劑，含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分組成。
2.一種小兒慢性關節(jié)炎治療劑，含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
3.如權利要求2中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，IL-6拮抗劑是對IL-6受體的抗體。
4.如權利要求3中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的單克隆抗體。
5.如權利要求4中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對人IL-6受體的單克隆抗體。
6.如權利要求4中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
7.如權利要求3～6的任一項中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是重組抗體。
8.如權利要求5中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
9.如權利要求6中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
10.如權利要求3～5的任一項中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
11.如權利要求10中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，其特征在于，對IL-6受體的人源化抗體是人源化的PM-1抗體。
12.如權利要求2～11的任一項中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型、少關節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型、少關節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性型)、多關節(jié)炎型(RF陰性型)、少關節(jié)炎型、發(fā)展型少關節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型、c.RF/ANA陰性型))。
13.如權利要求2～11的任一項中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性型)、多關節(jié)炎型(RF陰性型)、發(fā)展型少關節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型、b.抗核抗體(ANA)陽性型))。
14.如權利要求2～11的任一項中記載的小兒慢性關節(jié)炎治療劑，上述小兒慢性關節(jié)炎是ARA分類中的全身型、多關節(jié)炎型；EULAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型；ILAR分類中的全身型、多關節(jié)炎型(RF陽性型)、發(fā)展型少關節(jié)炎型；本發(fā)明者們分類中的小兒原發(fā)性慢性關節(jié)炎(SPRASH綜合征，小兒自發(fā)性慢性關節(jié)炎(a.類風濕病因子(RF)陽性型)。
15.一種斯提爾氏病治療劑，含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
16.如權利要求15中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，IL-6拮抗劑是對于IL-6受體的抗體。
17.如權利要求16中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對于IL-6受體的抗體是對于IL-6受體的單克隆抗體。
18.如權利要求17中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對人IL-6受體的單克隆抗體。
19.如權利要求17中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
20.如權利要求16～19的任一項中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是重組抗體。
21.如權利要求18中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對人IL-6受體的單克隆抗體是PM-1抗體。
22.如權利要求19中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對小鼠IL-6受體的單克隆抗體是MR16-1抗體。
23.如權利要求16～18的任一項中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的抗體是對IL-6受體的嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
24.如權利要求23中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，對IL-6受體的人源化抗體是人源化的PM-1抗體。
25.如權利要求15～24的任一項中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，斯提爾氏病是成人斯提爾氏病。
26.如權利要求15～24的任一項中記載的斯提爾氏病治療劑，其特征在于，斯提爾氏病是小兒的斯提爾氏病。
全文摘要
一種小兒慢性關節(jié)炎相關疾病，如小兒慢性關節(jié)炎，斯提爾氏病等的治療劑，以白細胞介素－6(IL－6)拮抗劑為有效成分。
文檔編號C07K16/28GK1499983SQ0280778
公開日2004年5月26日 申請日期2002年4月2日 優(yōu)先權日2001年4月2日
發(fā)明者吉崎和幸, 弘, 西本憲弘, 巖本雅弘, 次, 簑田清次, 平, 橫田俊平, 佳子, 宮前多佳子 申請人:中外制藥株式會社