專利名稱：一種新的人類溶血相關(guān)膜蛋白、其編碼序列、制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人類溶血相關(guān)膜蛋白的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
溶血按癥狀發(fā)展速度可分為急性溶血和慢性溶血。急性溶血常起病急驟，短期大量溶血可有嚴(yán)重的腰背及四肢酸痛，伴頭疼、嘔吐、寒戰(zhàn)，隨后是高熱、面色蒼白和黃疸。這是由于紅細(xì)胞大量破壞，其分解產(chǎn)物對肌體的毒性作用所致，更加嚴(yán)重者可有周圍循環(huán)衰竭。由于溶血產(chǎn)物引起腎小管細(xì)胞壞死和管腔阻塞，最后導(dǎo)致急性腎功能衰竭。慢性溶血起病緩慢，癥狀輕微，有貧血、黃疸、肝脾腫大三大特征。慢性溶血患者由于長期的高膽紅素血癥可并發(fā)膽石癥和肝功能損害等表現(xiàn)。
溶血疾病中最常見的是貧血。由于骨髓血細(xì)胞的生成能力較大，具有產(chǎn)生正常紅細(xì)胞6～8倍代償能力，如紅細(xì)胞的壽命縮短、破壞加速，而骨髓造血仍能代償時(shí)，可不出現(xiàn)貧血，稱為溶血性疾患。當(dāng)平均紅細(xì)胞壽命期短于15～20d，紅細(xì)胞破壞速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過骨髓的代償能力，則將出現(xiàn)貧血。
目前溶血性貧血的治療方法大致有下列幾種方法一、腎上腺糖皮質(zhì)激素。對免疫性貧血有效，也可應(yīng)用于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿，對其他類型溶血基本無效。
二、脾切除術(shù)。主要適用于異常紅細(xì)胞主要在脾破壞者，如遺傳性球形細(xì)胞增多癥；需較大劑量腎上腺皮質(zhì)激素維持的自身免疫性溶血性貧血，以及某些類型的血紅蛋白病。
三、免疫抑制劑。如環(huán)孢素A、環(huán)磷酰胺等，僅對少數(shù)免疫性溶血性貧血有效。
四、輸血。雖可暫時(shí)改善病人的癥狀，但對某些溶血性貧血反可帶來嚴(yán)重反應(yīng)。如自身免疫性溶血性貧血，由于其自身抗體與輸入紅細(xì)胞膜上相應(yīng)抗原可有強(qiáng)陽性反應(yīng)，而易引起嚴(yán)重醫(yī)療性貧血；給陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿者輸血有時(shí)也可誘發(fā)溶血。
然而，多數(shù)溶血性貧血目前尚無根治辦法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開始從基因和蛋白水平研究紅細(xì)胞代謝調(diào)控系統(tǒng)。
本發(fā)明的hHR具有溶血素III(Hly-III)家族的典型序列。目前發(fā)現(xiàn)的該家族成員不下十幾種，但是本發(fā)明的hHR還未曾有人報(bào)道。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，該蛋白被命名為(hHR)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的(hHR)的方法。
本發(fā)明還提供了hHR基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有(hHR)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ IDNO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從97-753位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hHR蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hHR蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hHR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hHR蛋白的重組細(xì)胞；
(c)在適合表達(dá)hHR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hHR蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為2013個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于97-753位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hHR蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中97-753位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQID NO.1序列的編碼框97-753位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中97-753位核苷酸序列同源性低至約90％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列的同源性至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與(HHR)相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hHR蛋白多肽”指具有hHR蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與(hHR)相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N術(shù)端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hHR蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與hHR DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hHR多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hHR多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括hHR多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hHR多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hHR蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hHR多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hHR多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)hHR的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hHR多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hHR的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測hHR核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于hHR多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對hHR DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于hHR基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hHR基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hHR蛋白的分子，也包括那些并不影響hHR蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hHR基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hHR基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hHR或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，2013；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，2013；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hHR功能的抗體以及不影響hHR功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hHR基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hHR基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的(hHR)核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。當(dāng)然，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，hHR的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人睪丸λgt10cDNA文庫(Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A15＇-catcatgt ctggctaccg ccg-3＇為正向引物；寡核苷酸A25＇-CCTTTCA GTCAGTTTGG GAGG-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)所得片段長度為七百個(gè)堿基左右。將上述的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(EpicentreTechnologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后獲得全長cDNA序列，共1780bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于97-753位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hHR的氨基酸序列，共218個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的hHR蛋白質(zhì)序列中具有結(jié)果發(fā)現(xiàn)hHR的蛋白質(zhì)序列中具有溶血素3(Hly-III)家族的典型序列。該家組成員都是內(nèi)膜蛋白，由于該家族中一個(gè)從Bacillus cereus中分離出來的具有溶血素活性的蛋白成員而得名。1995年，Baida GE等人一個(gè)從Bacillus cereus VKM-B164分離得到的基因已被克隆到大腸桿菌中并被測序，該溶血素又稱為溶血素III。因此，本發(fā)明的hHR可能與凝血過程有關(guān)，通過對本發(fā)明的深入研究，一定能發(fā)現(xiàn)它與許多溶血相關(guān)疾病的關(guān)系，并最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。將本發(fā)明(hHR)核酸(編碼序列或反義序列)引入細(xì)胞，可以提高(hHR)的表達(dá)水平或者抑制(hHR)的過度表達(dá)。本發(fā)明的(hHR)蛋白或其活性多肽片段也可以施用于病人，以治療或減輕因(hHR)缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜龅臄U(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1780bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于97-753位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hHR的氨基酸序列，共218個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2結(jié)構(gòu)分析用hHR的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hHR的蛋白質(zhì)序列中具有溶血素3(Hly-III)家族的典型序列。
本發(fā)明的hHR中符合溶血素III(Hly-III)家族保守序列的部分為SALDCVLSSFQMTNETVNIWTHFLPTWYFLWRLLALAGGPGFRAEPYHWPLLVFLLPACLYPFASCCAHTFSSMSPRMRHICYFLDYGALSLYSLGCAFPYAAYSMPASWLHGHLHQFFVPAAALNSFLCTGLSCYSRFLELESPGLSKVLRTGAFAYPFLFDNLPLFYRLGLCWGRGHGCGQEALSTSHGYHLFCALLTGFL(SEQ ID NO 2中從第9-212位)(http//smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)。該家組成員都是內(nèi)膜蛋白，由于該家族中一個(gè)從Bacillus cereus中分離出來的具有溶血素活性的蛋白成員而得名。1995年，BaidaGE等人一個(gè)從Bacillus cereus VKM-B164分離得到的基因已被克隆到大腸桿菌中并被測序。由該序列推測得到的氨基酸序列含有219個(gè)氨基酸殘基，分子量約為24.4kDa.，該溶血素又稱為溶血素III(Biochim Biophys Acta 1995；1264(2)151-4)。因此，本發(fā)明的hHR可能與凝血過程有關(guān)，通過對本發(fā)明的深入研究，一定能發(fā)現(xiàn)它與許多臨床病例的關(guān)系，并最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。
本發(fā)明的hHR除了可作為溶血素III(Hly-III)家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明的hHR還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。針對本發(fā)明hHR的抗體，用于篩選具有類似結(jié)構(gòu)域的其他蛋白，或者用于親和純化相關(guān)蛋白。
例如，本發(fā)明hHR核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高h(yuǎn)HR的表達(dá)水平或者抑制hHR的過度表達(dá)。本發(fā)明的hHR蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因hHR缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3hHR在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對應(yīng)于編碼hHR的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hHR的cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-AGAT GGATCCATGT CTGGCTACCG CCGCC-3＇該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是hHR編碼序列氨基端的部分核苷酸序列；3＇端引物序列為5’-CAGCAAGCTT GTCAGTTTGG GAGGCGAAG A-3’該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個(gè)翻譯終止子和hHR的編碼序列的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證hHR的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)達(dá)0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hHR。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hHR?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例4hHR在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，用對應(yīng)于編碼hHR的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hHR cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5＇-AGAT AAGCTTATGT CTGGCTACCG CCGCC-3＇該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是hHR編碼序列的氨基端部分核苷酸序列；3’端引物序列為5’-CAGCGGATCC GTCAGTTTGG GAGGCGAAG-3’該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和hHR的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證hHR的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例4和5中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀(hHR)基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
實(shí)例6基因定位發(fā)明蛋白的編碼序列還可用于基因定位。例如，通過熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(可通過Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過連鎖分析來鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
實(shí)例7作為微矩陣的底物微矩陣(Microarrays)，又稱DNA芯片。芯片可通過使用噴墨技術(shù)及一系列化學(xué)方法如射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等把樣品固定在底物上得到，形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。一塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件，可通過手工或用適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備制備。雜交反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的探針，然后用掃描儀來檢測發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)的程度。探針與每一個(gè)芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過對掃描出的圖像的分析來判斷。
全長cDNA、EST、或基因片段都可以作為固定于底物上的樣品。適合于雜交的片段可通過用一些著名的生物軟件(如LASERGENE SOFTWARE(DNASTAR))，來選擇。這些全長cDNA、EST、與本發(fā)明的核酸序列相關(guān)的片斷、或與這項(xiàng)發(fā)明有關(guān)的cDNA庫中隨機(jī)選出的片段被有序的排列于玻璃等載體上。cDNA固著于玻片的方法是紫外線交聯(lián)、熱學(xué)、化學(xué)處理、干燥(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)GenomeRes.6639-645.)等。將探針用熒光標(biāo)記后，再與固著地反應(yīng)元件雜交。雜交結(jié)果可用于推斷基因功能，理解疾病產(chǎn)生的基因基礎(chǔ)，診斷疾病，并可改進(jìn)及監(jiān)測藥劑的活性。
本發(fā)明的hHR核苷酸序列或其全長片段可作微矩陣的對象，檢測出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，從而對相關(guān)疾病的診斷治療起輔助作用。
實(shí)施例8試劑盒的制備試劑盒1它含有(1)特異性擴(kuò)增hHR的引物對，和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ ID NO1的序列，長度為15-35。對逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測樣品中是否含有hHR的核酸序列。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑，例如緩沖液等。
試劑盒2該試劑盒含有針對hHR的特異性的抗體(例如實(shí)施例5中制備的多克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗hHR的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用于直接檢測樣品中是否存在hHR蛋白。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測免疫復(fù)合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與hHR的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩沖液。該試劑盒通過核酸分子與hHR特異性探針之間的雜交反應(yīng)來檢測樣品中是否存在hHR的核酸分子。
試劑盒也可用于檢測出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，并檢測出一系列與本發(fā)明的hHR相關(guān)的基因，從而對相關(guān)疾病的診斷、治療起輔助作用。
實(shí)施例9制成藥物本發(fā)明的hHR蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等可作為藥物，用于診斷和治療與溶血有關(guān)的疾病等有重要價(jià)值的小分子藥物。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
此外，本發(fā)明hHR核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細(xì)胞，以提高h(yuǎn)HR的表達(dá)水平或者抑制hHR的過度表達(dá)。本發(fā)明的hHR蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因hHR缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
當(dāng)本發(fā)明的hHR蛋白多肽被用作藥物時(shí)，治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重—約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
序列表<210>1<211>1780<212>核苷酸<213>人類<220><221>編碼序列<222>(97)..(753)<223><400>1cagcagcctt ggactccgcc cgtggagccc tgggcctgtt gacccaccag cttaggagca 60cccaccaagc tctgggtgtt ctgggaagat ggcatc atg tct ggc tac cgc cgc 114Met Ser Gly Tyr Arg Arg15ccc acc agc tcg gct ttg gac tgt gtc ctc agc tcc ttc cag atg acc 162Pro Thr Ser Ser Ala Leu Asp Cys Val Leu Ser Ser Phe Gln Met Thr10 15 20aac gag acg gtc aac atc tgg act cac ttc ctg ccc acc tgg tac ttc 210Asn Glu Thr Val Asn Ile Trp Thr His Phe Leu Pro Thr Trp Tyr Phe25 30 35ctg tgg cgg ctc ctg gcg ctg gcg ggc ggc ccc ggc ttc cgt gcg gag 258Leu Trp Arg Leu Leu Ala Leu Ala Gly Gly Pro Gly Phe Arg Ala Glu40 4550ccg tac cac tgg ccg ctg ctg gtc ttc ctg ctg ccc gcc tgc ctc tac 306Pro Tyr His Trp Pro Leu Leu Val Phe Leu Leu Pro Ala Cys Leu Tyr55 60 65 70ccc ttc gcg tcg tgc tgc gcg cac acc ttc agc tcc atg tcg ccc cgc 354Pro Phe Ala Ser Cys Cys Ala His Thr Phe Ser Ser Met Ser Pro Arg75 80 85atg cgc cac atc tgc tac ttc ctc gac tac ggc gcg ctc agc ctc tac 402Met Arg His Ile Cys Tyr Phe Leu Asp Tyr Gly Ala Leu Ser Leu Tyr90 95 100agt ctg ggc tgc gcc ttc ccc tat gcc gcc tac tcc atg ccg gcc tcc 450Ser Leu Gly Cys Ala Phe Pro Tyr Ala Ala Tyr Ser Met Pro Ala Ser105 110 115tgg ctg cac ggc cac ctg cac cag ttc ttt gtg cct gcc gcc gca ctc 498Trp Leu His Gly His Leu His Gln Phe Phe Val Pro Ala Ala Ala Leu120 125 130aac tcc ttc ctg tgc acc ggc ctc tcc tgc tac tcc cgt ttc ctg gag 546Asn Ser Phe Leu Cys Thr Gly Leu Ser Cys Tyr Ser Arg Phe Leu Glu135 140 145 150ctg gaa agc cct ggg ctc agt aag gtc ctc cgc aca gga gcc ttc gcc 594Leu Glu Ser Pro Gly Leu Ser Lys Val Leu Arg Thr Gly Ala Phe Ala155 160 165tat cca ttc ctg ttc gac aac ctc cca ctc ttt tat cgg ctc ggg ctg 642Tyr Pro Phe Leu Phe Asp Asn Leu Pro Leu Phe Tyr Arg Leu Gly Leu170 175 180tgc tgg ggc agg ggc cac ggc tgt ggg cag gag gcc ctg agc acc agc 690Cys Trp Gly Arg Gly His Gly Cys Gly Gln Glu Ala Leu Ser Thr Ser185 190 195cat ggc tac cat ctc ttc tgc gcg ctg ctc act ggc ttc ctc ttc gcc 738His Gly Tyr His Leu Phe Cys Ala Leu Leu Thr Gly Phe Leu Phe Ala200 205 210tcc caa act gac tga aaggctggca ccaggacgct ttgattacat cggccacagc 793Ser Gln Thr Asp215caccagttat tccacatctg tgcagtgctg ggcacccact tccagctgga ggcagtgctg853gctgatatgg gatcacgcag agcctggctg gccacacagg aacctgccct gggcctggca913ggcacagtgg ccacactggt cttggctgca gctgggaacc tactcattat tgctgctttc973acagccaccc tgcttcgggc ccccagtaca tgccctctgc tgcagggtgg cccactggag 1033gggggtaccc aggccaaaca acagtgaggc cccatccctg accctgtcct ggagggggca 1093gaggccaggc cccagtgctg acgaggagcc cagatttggg cctaatcagg tggggacgca 1153tctcagcctg gaaccaacag gggctgagga gagagggcac aggagagagg gcagagaaga 1213ggaggggtgt ctagggggac tggcagagtg tgagagggac cgtgaggggg ctcttgatgg 1273gagtggaaga agtgctgagg gtctgagagg ggagatgcat gcgtgtccag gctgaagatg 1333cccctatatt ctgtcaaagg ttggcggggg gaggtgttgg ggtcctttca tctggctccg 1393tttctggtgc ttctggaagt ctctgctcag cacagggaag aactaacacg actaacctag 1453gcctaccctg aatgcttctt gctaaccagg ccgagaggcc acacacttgc ccccccatcc 1513ccacaaacca ggtaatgcca gtttgccagc agctatttgc ctatagagat gagtctgtcc 1573tggtcataac tgtgtgctca aggtgtccag gcttttgggg gtgggcctat ctgggtgcat 1633tatggatggt ttggtggatt gaggtgtggg gaggagggtc ctaggctaga gggggtatcc 1693ctagttagac tttgggaagc caccttcaac gttttctgga acaaggcagg tacaaataaa 1753aaaataaaac tttaaaaaaa aaaaaaa<210>2<211>218<212>蛋白質(zhì)<213>人類<400>2Met Ser Gly Tyr Arg Arg Pro Thr Ser Ser Ala Leu Asp Cys Val Leu1510 15Ser Ser Phe Gln Met Thr Asn Glu Thr Val Asn Ile Trp Thr His Phe2025 30Leu Pro Thr Trp Tyr Phe Leu Trp Arg Leu Leu Ala Leu Ala Gly Gly3540 45Pro Gly Phe Arg Ala Glu Pro Tyr His Trp Pro Leu Leu Val Phe Leu50 55 60Leu Pro Ala Cys Leu Tyr Pro Phe Ala Ser Cys Cys Ala His Thr Phe65 70 7580Ser Ser Met Ser Pro Arg Met Arg His Ile Cys Tyr Phe Leu Asp Tyr85 90 95Gly Ala Leu Ser Leu Tyr Ser Leu Gly Cys Ala Phe Pro Tyr Ala Ala100 105 110Tyr Ser Met Pro Ala Ser Trp Leu His Gly His Leu His Gln Phe Phe115 120 125Val Pro Ala Ala Ala Leu Asn Ser Phe Leu Cys Thr Gly Leu Ser Cys130 135 140Tyr Ser Arg Phe Leu Glu Leu Glu Ser Pro Gly Leu Ser Lys Val Leu145 150 155 160Arg Thr Gly Ala Phe Ala Tyr Pro Phe Leu Phe Asp Ash Leu Pro Leu165 170 175Phe Tyr Arg Leu Gly Leu Cys Trp Gly Arg Gly His Gly Cys Gly Gln180 185 190Glu Ala Leu Ser Thr Ser His Gly Tyr His Leu Phe Cys Ala Leu Leu195 200 205Thr Gly Phe Leu Phe Ala Ser Gln Thr Asp210 21權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有(hHR)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸97-753位的序列。
4.一種分離的hHR蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有hHR蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有hHR蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hHR蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hHR蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hHR蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hHR蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸97-753位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的hHR蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人類溶血相關(guān)膜蛋白(hHR)的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
文檔編號C07K14/435GK1390935SQ02112270
公開日2003年1月15日 申請日期2002年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月27日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎, 郭金虎 申請人:復(fù)旦大學(xué)