專利名稱：調節(jié)植物細胞分裂的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及調節(jié)植物細胞分裂和生長的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供促進具有增長或減少細胞數(shù)量的植物的生產的轉基因載體、細胞、植株及它們的生產方法。
背景技術：
植物體模型的精心構建，主要依賴于在稱為分生組織的生長位點上準確調節(jié)細胞的分裂與細胞的分化。在種子植物中，由頂端分生組織操控頂端生長。芽尖分生組織盡管在結構上是相同的，但在個體發(fā)育方面則有差異。在胚胎發(fā)生過程中發(fā)生初生的芽尖分生組織，并成為初生幼芽的頂端。隨后在該初生幼芽的旁邊長出一些次生芽尖分生組織并形成一群側芽。在許多種子植物中，幼芽的放射形生長是由芽體內的圓柱形分生組織層即形成層賦予的。從頂端分生組織側面形成的各種過渡型分生組織中發(fā)生側向的“葉狀”器官(即，葉片、花瓣等)的生長。根系的生長是從類似的頂端分生組織和形成層分生組織發(fā)生的。目前對這些不同類型的分生組織的調節(jié)和相互作用的了解還很少。
栽培植物的商品價值直接與產量有關，即與所收獲的植株部分的大小和數(shù)量相關，這些又取決于相應植株組織中細胞分裂的數(shù)量。雖然研究植物生長的基因方法已提供了有關植株體形和器官形態(tài)發(fā)生方面的重要信息(參見例如Riechmann等人，1997 Biol.Chem.，3781079-1101；Barton，1998 Current Opin.Plant Biol.，137-42；Christensen等人，1998 Current Biol.，8643-645；Hudson，1999 CurrentOpin.Plant Biol.，256-60；Irish，1999 Dev.Biol.，209211-220；Scheres等人，1999 Current Topics Dev.Biol.，45207-247)，但是對于什么和如何調節(jié)植物細胞分裂以及由此產生的植物器官的整體大小還是知之甚少。因此，對可通過對細胞分裂的調節(jié)作用來控制器官大小的基因進行分離和處理，實際上將對每一種具有商業(yè)價值的植物物種的生產性能產生巨大的影響。
Hermerly等人(1995 EMBO J，143925-3936)使用擬南芥(Arabidopsisthaliana)Cdc2激酶基因的顯性失活突變作用研究了對煙草植株生長和發(fā)育的影響。所有各種真核生物的細胞周期要正確地運行都需要有Cdc2激酶活性。Hermerly等人指出，在煙草植物中編碼顯性失活Cdc2蛋白質的擬南芥基因的表達，可產生在形態(tài)學方面正常但由于細胞分裂頻率減少而體形變小的植物。因此，對植物細胞分裂的調節(jié)作用至少是部分地與植株的發(fā)育脫節(jié)的。但是，在正常的植物生長和發(fā)育過程中，為了促成植物細胞分裂，必須由其它的調節(jié)性蛋白質來激活Cdc2激酶活性。
已分離出大批的植物突變體，這些突變體具有各種異常的形態(tài)和生長表型(例如參見Lenhard等人，1999 Current Opin.Plant Biol.，244-50)。但是，從視覺上難以分辨出哪種植物形態(tài)表型是由于決定某個植物細胞是否生長與分裂假定的關鍵性控制基因或是規(guī)定細胞發(fā)育結局的其它一些基因中發(fā)生突變而形成。而且，即使能夠區(qū)別出這種假定的植物生長突變體，仍需要付出巨大的努力來分辨起到調節(jié)植物細胞分裂的突變基因產究竟是由哪個DNA片段編碼的。
例如，Talbert等人(1995 Development，1212723-2735)報道，擬南芥突變體中有一個稱為revoluta(REV)的基因存在缺陷，這種缺陷使得該突變植物的分生組織區(qū)域中的細胞分裂呈現(xiàn)異常調節(jié)。具體而言，原本需要該REV基因來促進頂端分生組織包括側芽(paraclade)分生組織、花的分生組織和初生芽尖分生組織的生長。同時，REV基因對葉子、花器官和莖的分生組織則起著反向的作用。即，在葉子、花器官和莖組織中，REV的作用是限制細胞分裂，從而減小植物生長的速率及其組織的最終大小。葉子、花器官和莖等組織中功能性REV蛋白質的缺失，可導致這些組織的細胞數(shù)量和大小的增加。相反，頂端分生組織細胞中功能性REV蛋白質的缺失，則可導致細胞分裂和器官大小的減少。Talbert等人(1995，本文將其納入作為參考)報道了在同質結合的revoluta植物中觀察到的詳細的形態(tài)學變化。記錄下的revoluta突變體的失常的形態(tài)學強烈表明，REV基因產物具有調節(jié)擬南芥的頂端和非頂端分生組織的相對生長的作用。這種revoluta突變作用已被用來繪制REV基因在擬南芥5號染色體比較遠端具體的位置的基因圖譜。但是，在本發(fā)明之前，關于REV基因序列以及使用多核苷酸來編碼在轉基因植物細胞中調節(jié)細胞分裂的REV蛋白質的方法還是未知的。
原則上，在DNA或蛋白質水平上比較植物生長調節(jié)基因與已知在引發(fā)細胞周期(如細胞周期蛋白)或調節(jié)生長方面起著重要作用的動物或真菌基因的序列相似性，也可鑒別出該調節(jié)基因中的突變過程。例如，周知在動物中的各種同源框(HB)基因是在規(guī)定軀體生長規(guī)劃以及調節(jié)高等生物的發(fā)育方面起到主導控制基因作用的編碼蛋白質(Gehring等人，1994，Annu.Rev.Biochem.，63487-526)。動物中的HB基因可編碼涉及到DNA結合作用的稱為同源域(HD)的大約60個氨基酸的蛋白質基元，含有HD的蛋白質是起著靶基因表達調節(jié)子作用的一種轉錄因子。植物和動物的HD區(qū)域都是高度保守的。最初是在分離具有改變葉子發(fā)育的顯性突變的稱為knottedl(knl)的玉米突變體的基礎上，鑒別出了植物同源框基因(Vollbrecht等人，199l，Nature，350241-243)。已鑒定出可編碼與玉米Knotted蛋白質同源的各種蛋白質的基因，并在其序列同源性的基礎上從很多植物物種中克隆出該基因來(參見Chan等人的綜述，1998，Biochem.et.Biophys.Acta.，14421-19)。雜交研究表明，擬南芥大約有35-70個不同的含有HD的基因(Schena等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893894-3898)。
已通過使用從保守的HD序列制備的簡并寡核苷酸作為雜交探針或PCR引物來鑒定和分離cDNA克隆，從而分離出了大批的含有HD的植物基因(Ruberti等人，1991 EMBO J.，101787-1791；Schena等人，1992；Mattsson等人，1992 PlantMol.Biol.，181019-1022；Carabelli等人，1993 Plant J.，4469-479；Schena等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，918393-8397；Soderman等人，1994 PlantMol.Biol.，26145-154；Kawahara等人，1995 Plant Molec.Biol.，27155-164，Meissner等人，1995 Planta，195541-547；Moon等人，1996 Mol.Cells，6366-373；Moon等人，1996，Mol.Cells，6697-703；Gonzalez等人，1997 Biochem.Biophys.Acta，1351137-149；Meijer等人，1997Plant J.，11263-276；Sessa等人，1998 PlantMol.Biol.，38609-622；Aso等人，1999 Mol.Biol.Evol.，16544-552)。對這些含有HD的基因的分析，揭示了在植物中存在另一大類含有HD的基因，稱為HD-Zip基因，這些基因因其所編碼的蛋白質含有與該同源域結合的亮氨酸拉鏈而得名。這類HD基因是植物所獨有的(Schena等人，1992)。在氨基酸序列相似性的基礎上，已根據(jù)HD和亮氨酸拉鏈蛋白質區(qū)域內氨基酸相似性的程度，將由該HD-Zip基因編碼的蛋白質分成4個HD-Zip亞系(Sessa等人，1994，“植物發(fā)育和代謝的分子遺傳學分析”，P.Puigdomenech和G.Coruzzi編輯，BerlinSpringerVerlag，第411-426頁；Meijer等人，1997)。但是，與Knotted類的植物HD基因類似，HD-Zip基因也被認為可編碼對植物發(fā)育起調節(jié)作用的蛋白質(Chan等人，1998)。HD-Zip蛋白質中HD和亮氨酸拉鏈區(qū)域的存在非常強烈地表明，這些蛋白質經由亮氨酸拉鏈區(qū)域形成了多聚體結構，然后經由HD區(qū)域結合到特殊的DNA序列上，以轉錄方式調節(jié)靶基因表達(Chan等人，1998)。已通過對許多HD-Zip蛋白質的體外實驗從實驗上證明了這種推論(Sessa等人，1993；Aoyama等人，1995Plant Cell，71773-1785；Ganzalez等人，1997 Biochem.Biophys.Acta.，1351137-149；Meijer等人，1997；Palena等人，1999 Biochem.J.，34181-87；Sessa等人，1999)，本文納入這些出版物作為參考。
已使用一些HD-Zip亞系I、II、III和IV基因進行反義和異位表達實驗，以阻斷HD-Zip表達和使整個植株過量生產HD-Zip蛋白質而獲得各種表型結果(Schena等人，1993；Aoyama等人，1995；Tomero等人，1996，Meijer等人，1997；Altamura等人，1998)。已從原位雜交實驗和Northern印跡雜交實驗中推斷出關于HD-Zip功能的額外證據(jù)，確定了HD-Zip基因表達在植物整個發(fā)育過程中的短暫模式，以及確定了顯示HD-Zip基因表達的特定的植物細胞或組織的位置(見表1)。但是，正如表1中匯總的信息顯示，不論是在超系還是在亞系水平上，都不存在關于HD-Zip蛋白質在植物生長和發(fā)育方面起著何種調節(jié)作用的明確模式。而且，也沒有發(fā)現(xiàn)HD-Zip基因產物參與調節(jié)植物細胞分裂的跡象。
表1.HD-Zip基因及其可能的功能
表1歸納的結果顯示，不能根據(jù)基因所處的是哪一個HD-Zip亞系來推測任何一個單獨的HD-Zip基因產物的調節(jié)作用?？赏ㄟ^對HD與亮氨酸拉鏈區(qū)域中的氨基酸序列的調整和比較確定這些HD-Zip亞系(參見Aso等人，1999，圖2關于最新的HD-Zip區(qū)域調整)。在許多情況中，根據(jù)在HD-Zip區(qū)域之外發(fā)現(xiàn)的保守蛋白質功能區(qū)中的氨基酸序列相似性的程度，就可預測到HD-Zip調節(jié)功能的保存情況。即，從不同植物物種獲得的彼此功能類似(即執(zhí)行相同的生物學功能)的HD-Zip基因產物，不僅共有保守的HD-Zip區(qū)域，而且在蛋白質鏈的全長方面還比其它執(zhí)行不同生物學作用的HD-Zip蛋白質顯示出更大的氨基酸序列相似性。因此，表1歸納的數(shù)據(jù)顯示出所推斷的各個HD-ZipI、II、III和IV基因產物的生物學功能不一致的結論是毫不足怪的。盡管如此，關于HD-Zip超系的各種蛋白質在調節(jié)植物發(fā)育中起著重要作用的推測還仍然廣為流傳(例如參見Chan等人，1998)。
鑒于植物生長在農藝學方面的重要性，如今對于各種轉基因組合物產生了強烈的需求，其中的基因序列含有在轉基因植物中表達時可調節(jié)植物生長。使用本發(fā)明的組合物和方法就可以創(chuàng)造各種有用的轉基因植物，這些植物可表達REVOLUTA轉基因而調節(jié)其細胞分裂。如本發(fā)明所提供的各種組合物和方法，可通過控制(如增加)特定的植株組織中的細胞分裂數(shù)量的能力來控制(包括增加)植株的大小。
本發(fā)明的組合物和方法提供了另一種途徑，以滿足由于世界人口的持續(xù)增長以及整個世界要提高生活標準的愿望而對糧食和植物纖維的日益增長的需求。盡管近年來在農業(yè)上成功地保持著糧食產量與世界人口同步增長，但是當今世界仍有超過8億人長期處于營養(yǎng)不良的狀態(tài)，有1.8億兒童的體重嚴重地低于其所處年齡段的體重標準，有4億育齡期婦女缺鐵和貧血，這導致嬰兒和母親死亡。到2020年還要再養(yǎng)活額外增長的20億人，并且會有多于這一數(shù)量的人將長期營養(yǎng)不良。例如，在林木中，形成層負責樹干的增長。在蕃茄(和其它許多植物)中，子房壁不僅負責成熟果實的大小，還負責可溶性固體成分的含量。在谷類作物中，胚乳決定種子的大小。在有些情況下，可通過增加果實支撐結構的長度來提高產量，如玉米果穗是修改過的莖時，該莖的長度可決定玉米籽粒的數(shù)量。此外，轉基因植物作為藥劑和工業(yè)品，來源的可能用途可能要求對器官特定生長調節(jié)過程進行控制。
農業(yè)上發(fā)展增加增長或降低增長的技術的潛力是非常大的。對于每一種農作物，小至幾個百分比的產量增加都是非常理想的。相反，在許多水果類農作物中，非常希望的是無籽的果實。在本發(fā)明中，除了可在全部現(xiàn)有各種植物種類之外應用，還可改變農作物的育種方式。植物育種可致力于耐壓抑性和抗有害生物性以及營養(yǎng)和滋味品質等方面。可在高級精選種系中引入本發(fā)明的生長賦予的品質，以強化其生產潛力。
發(fā)明概要本發(fā)明通過改變轉基因植物中REVOLUTA蛋白質的水平提供調節(jié)植物細胞分裂的各種組合物和方法。具體而言，本發(fā)明將使用REVOLUTA轉基因與增加或降低生物學活性REVOLUTA蛋白質的表達相聯(lián)系，從而調節(jié)植物細胞分裂過程。
在本發(fā)明的一個實施例中，提供了含有可編碼至少與擬南芥REVOLUTA蛋白質序列〔SEQ ID NO2〕約有70％相同的REVOLUTA蛋白質的多核苷酸序列的DNA分子。在某些實施例方面，該蛋白質至少約有80％與SEQ ID NO2相同。較佳的是，該DNA分子含有可編碼具有與擬南芥REVOLUTA蛋白質的生物學活性相同的REVOLUTA蛋白質的多核苷酸序列，即它能調節(jié)植物細胞分裂。在某些較佳實施例中，由該DNA分子編碼的蛋白質具有REV表型。
根據(jù)某些較佳實施例，本發(fā)明提供了一種與擬南芥REVOLUTA核酸序列的外顯子3-18(SEQ ID NO1的第3670-3743、3822-3912、4004-4099、4187-4300、4383-4466、4542-4697、4786-4860、4942-5048、5132-5306、5394-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6388、6477-6585、6663-6812和6890-7045的核苷酸)中的至少一個有至少80％相同的多核苷酸。
同樣，本發(fā)明提供一種含有與選自SEQ ID NO187、SEQ ID NO188、SEQ IDNO189、SEQ ID NO190、SEQ ID NO191、SEQ ID NO192、SEQ ID NO193、SEQ ID NO194、SEQ ID NO195和SEQ ID NO196的蕃茄Rev基因(或多核苷酸)中的至少一個相同至少約80％的多核苷酸序列的分離的DNA分子。
根據(jù)其它實施例，本發(fā)明提供了含有可編碼由與REV基因產物的某些區(qū)域至少相同約95％的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸序列，尤其是選自SEQ IDNO130、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO134、SEQID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137的序列的分離的DNA分子。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施例，該編碼的蛋白質含有選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO159、SEQ IDNO160、SEQ ID NO164、SEQ ID NO171和SEQ ID NO173的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了一些實施例，其中的多核苷酸序列選自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO169、SEQID NO170和SEQ ID NO172。
本發(fā)明的另一實施例提供了選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的多核苷酸序列，其中，該多核苷酸序列可編碼與野生型REV蛋白質相比在細胞分離的常規(guī)調節(jié)方面有缺陷的突變體REVOLUTA蛋白質。本發(fā)明還提供含有從野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質〔SEQ ID NO2〕和圖3所示以rev-1、rev-2，4、rev-3、rev-5和rev-6表示的各種revoluta突變體蛋白質等組成的序列群中選出的氨基酸序列的分離的蛋白質。本發(fā)明還提供了其它各種REVOLUTA蛋白質，它們含有與擬南芥REV氨基酸序列(SEQ ID NO2中顯示)至少相同約70％的氨基酸序列。
本發(fā)明的又一實施例提供了含有復制子和REVOLUTA轉基因的轉基因載體，該REVOLUTA轉基因含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。較佳的是，本發(fā)明的轉基因載體還含有針對REVOLUTA轉基因表達的結構性或組織特異性啟動子區(qū)域和Poly A額外區(qū)域。REVOLUTA轉基因的表達可引起對經本發(fā)明的轉基因載體轉化了的植株細胞的細胞分裂過程進行調節(jié)。在另一實施例中，本發(fā)明的轉基因載體含有一多核苷酸序列，該序列含有可編碼與野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質序列〔SEQ ID NO2〕至少相同約70％的蛋白質的序列。在本發(fā)明的又一實施例中，多核苷酸序列可編碼具有一個肽區(qū)域的蛋白質；該肽區(qū)域與野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質的區(qū)域至少相同約70％，在SEQ ID NO2中該肽區(qū)域限定為第114位氨基酸到包括第842位氨基酸。
本發(fā)明另一方面提供了轉基因植物，該植物含有上述多核苷酸和REVOLUTA轉基因載體中的至少一種。一方面，相對于未轉化植物，當本發(fā)明REVOLUTA轉基因在轉化的細胞中表達時，該轉化的植物的細胞分裂受到調節(jié)。具體而言，與未轉化植物的對照種群相比，本發(fā)明提供具有調節(jié)的細胞分裂的轉基因植物(在遺傳學上被含有選自有義基因、反義基因、反向復制基因或糖酶基因的REVOLUTA轉基因的核酸序列轉化)。本發(fā)明的轉基因植物可進一步繁殖，而產生具有經調節(jié)的細胞分裂特性的在遺傳學上的不分離系植物種群。此外，本發(fā)明的轉基因植物還可與其它具有一種或多種理想表型特征(如耐壓抑性和抗有害生物性或營養(yǎng)品質和滋味品質)的植物種類雜交，產生具有前述理想特征與調節(jié)細胞分裂的轉基因特性相結合的新穎植物。
另一方面，本發(fā)明提供調節(jié)植物細胞分裂的方法，該方法包括將REVOLUTA轉基因導入至少一個植物細胞中的一系列步驟。本發(fā)明的方法還包括用REVOLUTA轉基因轉化的細胞再生一種或多種植株的步驟。再生的植株可隨意篩選，以鑒別出與未轉化植株相比具有經過調節(jié)的細胞分裂特性的植株。調節(jié)了細胞分裂的轉基因植株與未轉化的植株相比，至少有一個植物器官或組織(由于細胞的數(shù)量增加或減少的體形)較大或較小。目前用于實施本發(fā)明方法的最佳的REVOLUTA轉基因是上面所述的多核苷酸序列。另外，還可使用選自有義基因、反義基因、反向復制基因和REVOLUTA核糖酶基因的REVOLUTA轉基因來實施本發(fā)明的各種方法。
本發(fā)明的又一個實施例提供了從植物中分離REVOLUTA基因的一種方法。具體而言，該方法包括下述步驟a)使用正向和反向寡核苷酸引物擴增植物多核苷酸序列，該引物可編碼與SEQ ID NO2中相應的氨基酸序列至少相同約50％的氨基酸序列；b)將該擴增的植物多核苷酸雜交到重組植物DNA克隆的文庫上；c)從與該擴增的植物多核苷酸雜交的重組DNA克隆中分離出DNA分子；d)將含有所述擴增的植物多核苷酸或DNA分子的載體轉化到植株中；e)通過比較轉化的與未轉化的植物，確定轉化植物中的細胞分裂已被調節(jié)。較佳的是，由本發(fā)明方法分離的DNA可編碼與具有SEQ ID NO2序列的REVOLUTA蛋白質中的氨基酸序列至少相同約70％的氨基酸序列。此外，較佳通過對轉基因植株或其組織或器官與相應的未轉化的植株或其組織或器官進行比較來確定細胞分裂的調節(jié)情況。與未轉化的植株相比，轉基因植物株或其組織或器官中的細胞數(shù)量的增加或減少，表明了分離的DNA分子可編碼本發(fā)明的REVOLUTA基因。
本發(fā)明還提供了一種含有嵌合型植物基因的植物，該嵌合型基因具有一個在植物細胞中起作用的啟動子序列；可引起可編碼融合多肽的RNA的產生或引起同源基因抑制的RNA轉錄的編碼序列，從而該嵌合型植物基因的表達可調節(jié)植物的生長，如調節(jié)細胞分裂；以及可編碼多腺苷酸化信號的3′非翻譯區(qū)，該信號在植物細胞中起到可引起多腺苷酸核苷酸添加到該RNA的3′端的作用；其中，該啟動子相對于該編碼序列是異源的，并適用于引起該嵌合型植物基因的充分表達，以調節(jié)該嵌合型基因轉化的植株的生長。
附圖的簡短描述對本發(fā)明上述各點和許多附帶的優(yōu)點是比較容易評價的，同時再結合各例附圖并參照相應的詳細描述，就會有更好的理解，其中

圖1是擬南芥5號染色體1.95Mb區(qū)域的遺傳圖譜。
圖2顯示了圖1中的遺傳圖譜的放大區(qū)域，其中使用單一序列長度多態(tài)性標記進行遺傳雜交確定了REVOLUTA基因的位置。
圖3表示從分離自擬南芥REVOLUTA基因〔SEQ ID NO1〕推斷得到的完整的蛋白質序列〔SEQ ID NO2〕?？招娜切伪硎揪幋aREVOLUTA的DNA序列(SEQ ID NO1〕中的外顯子和內含子核苷酸序列之間的拼合連接。暗框中表示保守的同源域和亮氨酸拉鏈基元。下面劃線的氨基酸區(qū)表示另一可能的亮氨酸拉鏈基元。倒置三角形表示內含子-外顯子連接。野生型序列下的粗體字表示rev-4突變體氨基酸C-末端延伸。
圖4顯示了擬南芥的HD-ZipIII族蛋白質的校準。使用多序列校準方程(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multh-align/multi-align.html)和boxshade(http//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)校準出各蛋白質序列。黑色區(qū)顯示的殘基相同，是灰色區(qū)域顯示的是保留的殘基。
圖5顯示各rev-1突變體的部分互補關系。圖片(A)顯示在內源啟動子(右)的控制下用空虛載體(左)或含有野生型REV基因的5′REV結構轉化所獲得的各rev-1轉基因植株的比較。圖片(B)顯示轉化了rev-1載體的植株的特寫，該植株顯示出rev突變體植物的葉腋空和虛花朵增大的特征。圖片(C)是用5′REV結構轉化的rev-1植株的特寫。與野生型類似，許多葉腋具有腋芽，花朵較小。圖片(D)是顯示反向復制結構的對照植株(空載體)，哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型。圖片(E-G)顯示用35S-REVIR結構轉化了的哥倫比亞型植株，該植株顯示出一些Rev-表型的特征，包括空葉腋(箭頭所示)。它的花與野生型的花大小類似，不像rev植株的花朵增大。圖片(H)顯示了35S-REVIP轉基因植株(左)和母本哥倫比亞型植株(右)的比較。
圖6顯示在REVmRNA水平的半定量RT-PCR分析。
圖7顯示REV mRNA的表達模式。圖片(A-C)顯示花序頂部的縱切面。(A)中箭頭表示顯示REV表達的葉腋分生組織。(B)是葉腋花序分生組織。數(shù)字表示花原基的發(fā)育期。im＝花序分生組織、g＝雌蕊群、s＝雄蕊、se＝萼片。圖片(D)顯示第1O期雌蕊群的縱切面。op＝胚珠原基、st＝柱頭。圖片(E)顯示幼齡莖生葉的縱切面。圖片(F)是在花粉囊和雌蕊群顯示最高表達的第4期營養(yǎng)組織花的縱切面。圖片(G)是在花粉囊和雌蕊群顯示最高表達的第9期花朵的橫切面。t＝營養(yǎng)組織層、PMC＝花粉母細胞。圖片(H)顯示了在雄蕊和花瓣中呈現(xiàn)REV表達的第8期花朵的縱切面。圖片(I)顯示了在雄蕊和花瓣中呈現(xiàn)REV表達的第9期花朵的縱切面。圖片(J)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，表明了在胚乳中的表達。圖片(K)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，顯示了胚乳中的REV表達。箭頭所指表示胚柄。圖片(L)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，顯示出在早期心形胚中的表達。圖片(M)顯示了發(fā)育中的魚雷形胚中組蛋白H4的表達。圖片(N)顯示了在發(fā)育中的晚期心形胚中的REV有義探針。圖片(O)顯示了具有REV有義探針的花序頂部的縱切面。圖片(P)顯示了用反義REV作為探針研究的莖部橫切面，co＝皮層。圖片(Q)顯示了具有REV有義探針的莖部橫切面。圖片(R)顯示了Talbert等人(1995)所述的在番紅O和固綠FCF中染色的rev-1莖部橫切面的亮視野像。圖片(S)顯示了野生型的莖橫切面的亮視野像。
圖8顯示rev-1和野生型組織中組蛋白H4和FIL的表達。圖片(A)是野生型花序頂部的縱切面圖，顯示組蛋白H4的表達。圖片(B)是rev-1花序頂部的縱切面圖，顯示了組蛋白H4的表達。圖片(C)是A的放大圖。圖片(D)是B的放大圖，顯示在葉的近軸側呈現(xiàn)H4表達的細胞的數(shù)量增加。圖片(E)是野生型花序分生組織(im)，包括第3和第5期花的雄蕊(st)和萼片(se)原基的橫切面圖，顯示了FIL在其中的表達。圖片(F)是野生型花的橫切面圖，顯示了心皮瓣(va)和花瓣(pe)遠軸側中的FIL表達。圖片(G-H)是rev-1花序頂部和發(fā)育中的雄蕊(st)的遠軸側中的發(fā)育第7期花的縱切面圖，顯示了FIL在其中的表達。圖片(I)是顯示FIL表達的rev-1花的橫切面圖，顯示了在心皮瓣(va)和花瓣(pe)遠軸側中FIL的表達。
圖9顯示了各種rev雙重突變體。圖片(A)顯示了花序大大縮短的rev lfy雙重突變體，該花序終止于一束短絲。該植株還呈現(xiàn)的葉片翻卷。插圖是在rev lfy植株莖部發(fā)現(xiàn)的細絲狀附器的放大圖。圖片(B)顯示花序大大縮短和葉片翻卷的rev fil雙重突變體。圖片(C)顯示了rev lfy植株上的細絲狀附器，類似于在rev突變植株的葉腋部常見的結構。圖片(D)顯示具有細絲狀附器的rev-1突變植原的葉腋。圖片(E)顯示具有一束無花細絲的rev lfy植株的花序結構，該結構呈現(xiàn)星形毛狀體或心皮樣的特征。圖片(F)顯示具有一束光滑的無花細絲的rev fil植株的花序結構。圖片(G)顯示rev fil花序的SEM。標尺長1mm。圖片(H)顯示具有心皮樣特征的revlfy花序的SEM。圖片(I)顯示rev lfy花序的SEM。
圖10顯示用空對照載體(C)轉化的標準植株和用35S-REV基因(LS)轉化的植株產生的種子大小的比較。
圖11提供了用空載體(C)轉化的植株和用35S-REV基因(LS)轉化的植株產生的蓮座短莖和葉片大小的例子。
圖12提供了用空載體(C)轉化的植株和用35S-REV基因(LS)轉化的植株產生的花序莖和莖生葉的大小的例子。
最佳實施例的詳細描述本文所用術語“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸或其殘基。以單個字母或三個字母一組來表示這些氨基酸Asp D 天冬氨酸 IleI 異亮氨酸Thr T 蘇氨酸 LeuL 亮氨酸Ser S 絲氨酸 TyrY 酪氨酸Glu E 谷氨酸 PheF 苯丙氨酸Pro P 脯氨酸 HisH 組氨酸Gly G 甘氨酸 LysK 賴氨酸Ala A 丙氨酸 ArgR 精氨酸Cys C 半胱氨酸 TrpW 色氨酸Val V 纈氨酸 GlnQ 氨酰胺Met M 甲硫氨酸 AsnN 天冬酰胺本文所用術語“核苷酸”指DNA或RNA的單體單元，其分子中含有一個糖部分(戊糖)、一個磷酸酯和一個含氮的雜環(huán)堿基。堿基通過糖苷碳鍵(戊糖的1′碳)與糖部分連接，堿基與糖的結合稱為核苷。堿基是核苷酸的特征，DNA具有4種堿基，分別是腺嘌呤(“A”)、鳥嘌呤(“C”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)。次黃嘌呤核苷(“I”)是合成堿基，能用它來取代任何天然的4種堿基(A、C、G或T)。RNA的四個堿基是A、G、C和U(尿嘧啶)。本文所述核苷酸序列是由相鄰戊糖的3′和5′碳原子之間的磷酸二酯鍵連接的核苷酸的線性陣列。
術語“DNA序列編碼”、“DNA編碼”和“核酸編碼”指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸編排順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了所翻譯的多肽鏈上氨基酸的順序。因而DNA序列可編碼氨基酸序列。
術語“重組DNA分子”指通過在體外將兩個或多個DNA分子連接成一個重組分子而產生的任何DNA分子。“重組DNA分子的文庫”指含有一批不同重組DNA分子的任何克隆庫，其中，該重組DNA分子含有可復制的載體和得自源生物體的DNA序列。
“寡核苷酸”指通過磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸的短的單鏈或雙鏈序列。寡核苷酸可由已知的方法化學合成并純化，例如，用聚丙烯酰胺凝膠純化。
術語“植物”包括全植株、植物器官(如葉、莖、花、根等)、種子和植物細胞(包括組織培養(yǎng)細胞)及其后代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的種類十分廣泛，一般為可適用于轉化技術的各類高等植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)以及某些低等植物(如藻類)。它包括各種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體。
“異種序列”是來自外來物種的序列，或者，如果是來自同一物種的序列，則該序列已在其原始形式上被大大地修改。例如，操作性連接于一個結構基因的異種啟動子，與衍生該結構基因的物種不同，或者，如果該啟動子是來自同一物種，則它已在其原始形式上被大大修改。
本文所用術語“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA轉基因”指任何可編碼REVOLUTA蛋白質或促進其表達和/或生產的多核苷酸序列。因而，術語“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉基因”包括側接REVOLUTA蛋白質編碼序列的各種序列。具體而言，術語“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉基因”包括蛋白質編碼序列(外顯子)、間插序列(內含子)、側接DNA的5′和3′區(qū)域的含有REVULOTA基因正常表達所需序列(即分別是啟動子和Poly A附加區(qū)域，以及任何增強子序列)的序列。
本文所用術語“REVOLUTA蛋白質”、“REVOLUTA同源物”或“REVOLUTA在源物”指(當用于實施本發(fā)明方法時)能調節(jié)植物細胞的分裂并且其氨基酸序列與SEQ ID NO2的第1-842個(包括本數(shù))氨基酸殘基具有至少約70％、更佳至少約75％、最佳至少約80％的相同的蛋白質。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質還與限定在SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸(包括本數(shù))的氨基酸區(qū)域相同至少約70％、更佳至少約75％、最佳至少約80％。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質還是與限定在SEQ ID NO2的第433-842個氨基酸(包括本數(shù)的氨基酸區(qū)域)有至少約70％、更佳至少約75％、最佳約80％相同的蛋白質。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質還是與限定在SEQ ID NO2的第611-745個氨基酸(包括本數(shù))的氨基酸區(qū)域有至少約70％、更佳至少約75％、最佳約80％相同的蛋白質。
可采用如下方法來確定氨基酸序列的同一性。利用2.0.9版的BLASTP程序(Altschul等人，1997 Nucleic Acids Res.，253389-3402)，使用從第1個氨基酸延伸到第842個氨基酸(包括第842個)的REVOLUTA的氨基酸序列部分(如圖3所示)來檢索核酸序列數(shù)據(jù)庫，如Genbank數(shù)據(jù)庫?；蛘?，可使用從SEQ ID NO2的第114個到第842個(包括第842個)氨基酸、或者第433個到第842個(包括第842個)氨基酸、或者第611個到第745個氨基酸的REVOLUTA蛋白質序列進行檢索。該程序使用默認模式。所檢索到的那些與SEQ ID NO2的任何上述指定的區(qū)域具有至少約70％相同的序列，都可認為是REVOLUTA蛋白質。
對兩條(或多條)多核苷酸或多肽之間的序列比較，一般是通過“比較窗”比較兩個序列，以確定和比較序列局部區(qū)域的相似性。在本文中所用的“比較窗”指在對兩條序列進行最優(yōu)排列之后，它們中至少約有20個、一般約有50-200個、更一般約有100-150個鄰接的位置的一個片段，其中一個序列與對比序列相似，具有同等數(shù)量的鄰接位置。
可采用如下方法進行用于比較的序列的最佳排列采用局部同一性或類似性算法(如Smith和Waterman，所述的算法)、1981，Adv.Appl.Math.2482)、Needleman和Wunsch所述的同源排列算法(1970，J.Mol.Biol.，48443)、Pearsn和Lipman的相似性方法的探索(1988 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，852444)、這些算法的計算機化輔助手段〔Wisconsin Genetics Sofiware Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、BLASTP2.0.9、TBLASTN、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science，Dr.Madison，Wis；Atlschul等人，1997〕或者通過檢查。
術語“同一性百分數(shù)”指當使用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi上的BLASTP2.0.9程序檢測兩條肩并肩排列的氨基酸序列或兩條核酸序列時，在相同的相對位置上所占有的氨基酸或核苷酸的百分數(shù)。本文中使用的“氨基酸序列同一性百分數(shù)”是使用BLASTP2.0.9的缺陷矩陣BLOSUM62(開放缺口＝11，缺口延伸代價＝1)來測定的。該百分數(shù)是這樣計算的測定在兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，求得匹配位置數(shù)，將此匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，然后乘以100，得到序列同一性的百分數(shù)。不論是N-或C-末端的延伸部分還是插入部分都不可解釋為它們減少了序列同一性。
術語“相似性百分數(shù)”是兩條相比較的蛋白質序列的相關性程度的統(tǒng)計學量度。相似性百分數(shù)由計算機程序算得，該程序根據(jù)其化學相似性(如比較的各氨基酸是否是酸性的、堿性的、疏水的、芳族的等)和/或在進化距離上確定該成對相比較的氨基酸的數(shù)值。進化距離是將一個可編碼相比較的成對氨基酸中的一個成員的密碼子轉化成可編碼其中另一成員的密碼子所需的堿基對改變的最小數(shù)值來算得。通過對所有可能的排列進行交互比較憑經驗將兩條序列進行最佳擬合排列后，進行計算。(Henikoff等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919)。
多核苷酸序列的“基本上相同”指使用上述程序(最佳是BLAST2)的各項標準參數(shù)，多核苷酸與參照序列比較具有至少60％、較佳至少70％、更佳至少80％、最佳至少90％的序列同一性。熟練的技術人員能夠判別這些數(shù)值可適當調整，在考慮到密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框位置等因素的情況下，來測定兩條核苷酸序列所編碼的各種蛋白質的相應的同一性。在這方面適用的氨基酸序列的基本上相同，一般指至少有60％、較佳至少有70％、更佳至少有80％的序列同一性。“基本上類似”的多肽都具有上述各種序列，除了不相同的各殘基位置因保守的氨基酸有變化而可能有所不同。保守的氨基酸取代方式指具有類似側鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側鏈的一組氨基酸族有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側鏈的一組氨基酸族有絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸族是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側鏈的一組氨基酸族是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸族是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組氨基酸族是半胱氨酸和甲硫氨酸。最佳的保守氨基酸取代群是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
核苷酸序列基本上相同的另一指征是，在嚴格的條件下，兩個分子是否相互雜交，或都與第3個核酸分子雜交。嚴格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中有所不同。通常，所選擇的嚴格條件約低于在確定的離子強度和pH中的具體序列的熱熔點(Tm)5℃。Tm是(在確定離子強度和pH下)50％的靶序列與最佳匹配探針雜交時的溫度。一般情況下，嚴格條件是鹽濃度在pH7時約為0.02摩爾和溫度至少約為60℃的條件。當在從不同物種分離得到的多核苷酸序列之間進行異種雜交時，更佳使用適度嚴格條件。
用于鑒定(用Southern印跡法)編碼REVOLUTA-同源物的附加核酸分子的高嚴格的雜交條件和洗滌條件的范例是在68℃、含有1mM Na2EDTA、20％十二烷基硫酸鈉的0.25M Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進行雜交；在含有1mM Na2EDTA、1％(w/v)十二烷基硫酸鈉的20mM Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進行洗滌(65℃洗滌3次，每次20分鐘)。
用于鑒定(Southem印跡法)編碼REVOLUTA-同源物的附加核酸分子的適度嚴格的雜交條件和洗滌條件的范例是在45℃、含有1mM Na2EDTA、20％十二烷基硫酸鈉的0.25M Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進行雜交；在55-65℃、在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉的5×SSC中進行洗滌?？s寫“SSC”指在核酸雜交溶液中使用的緩沖液。1升20×(20倍濃度)原液SSC緩沖液(pH7.0)含有175.3g氯化鈉和88.2g檸檬酸鈉。
在轉基因表達和內源基因的抑制同時發(fā)生的例子(如，通過反義、核糖酶、反向復制、有義抑制或轉基因導向的同源重組)，熟練的技術人員將可判別，插入的多核苷酸序列不需要與產生它的基因的序列完全相同，只要“基本上相同”即可。如下面所解釋，這個術語專門包羅了這類變種。
在插入的多核苷酸序列被轉錄并被翻譯而產生一種功能性多肽的情況下，熟練的技術人員將可判別，由于密碼子的簡并性，可有大量的多核苷酸序列編碼同一種多肽。這些變化方式特別地包含在術語“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉基因”的含義中。此外，這些術語特別包括與基因序列基本上相同(如下面所述測定)并且可編碼保留了REVOLUTA基因產物的功能的蛋白質的全長序列。
在使用多核苷酸來抑制內源基因表達的例子中，所導入的序列不需要與靶內源基因的序列完全相同。該導入的多核苷酸序列一般至少與該靶內源序列基本上相同(如下面所述測定)。
當如上述將兩條核酸序列或多肽校準至最大一致時，如果在該兩個序列中它們的核苷酸序列或氨基酸殘基分別相同，那么就可說這兩條核酸序列或多肽“相同”。術語“與...互補”在本文中指互補的序列與整條參考多核苷酸序列或其部分相同。
術語“細胞分裂的調節(jié)”指與對照組的植株相比，在整個植株或任何植物組織或植物器官中的細胞分裂數(shù)量發(fā)生的任何改變。例如，本發(fā)明轉基因植株中的細胞分裂的調節(jié)可，增加它的葉子的細胞數(shù)量而使該葉子大于未轉化的植株的葉子。細胞分裂的調節(jié)，可在一個植物組織或器官的細胞類型中產生，或者在整個植株中產生，這取決于負責REVOLUTA轉基因表達的啟動子。此外，由REVOLUTA轉基因引發(fā)的細胞分裂的調節(jié)，可能會在由于細胞分裂休止或減少以至其植株生長停止的轉基因植物或組織中產生。可采用植物解剖學領域中熟知的各種方法來測定細胞分裂的調節(jié)(例如參見Esau，Anatomy of Seed Plants[2nd ed.]，1977，JohnWiley & Sons，Inc.，New York)。例如，可測定轉基因植株的總質量，或者可進行器官或組織細胞計數(shù)，從而可算出代表性組織或器官橫截面中的所有的細胞。對于REVOLUTA轉基因在胚胎中表達的情況，也可通過測量含有該轉基因胚胎的種子的大小作為該胚胎內細胞的數(shù)量來確定細胞分裂的調節(jié)。
術語“變化”、“氨基酸序列變化”、“變體”和“氨基酸序列變體”指REVOLUTA蛋白質與相應的天然(即天然存在的)REVOLUTA蛋白質相比，其中的各氨基酸序列有一些不同。通常，變體與相應的天然REVOLUTA蛋白質具有至少約67％的同一性，較佳至少有約80％的同一性。本發(fā)明范圍內的REVOLUTA蛋白質的氨基酸序列變體在某些位點具有取代、刪除和/或插入等變化?？墒褂肦EVOLUTA的各種序列變體來獲得所需的提高或減少的DNA結合、蛋白質寡聚化、參與特殊的蛋白質-蛋白質相互作用或修飾的能力、轉錄調節(jié)的活性，或者調節(jié)植物細胞分裂的修正活性。
取代性REVOLUTA蛋白質變體是在天然REVOLUTA蛋白質序列中至少有一個氨基酸殘基被去除，并且在該位置插入一個不同的氨基酸的蛋白質變體。取代可以是單一的，在其分子中僅有一個氨基酸被取代，或者是多元取代，在同一分子中有兩個或多個氨基酸被取代。通過使用另一種在其側鏈的電荷和/或結構與天然氨基酸明顯不同的氨基酸取代本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質分子的氨基酸，就可使本發(fā)明的該種分子的活性發(fā)生重大的變化。使用這種類型的取代方式有可能影響多肽骨架的結構和/或該分子的取代區(qū)域中的電荷或疏水性。
通過用其電荷和/或結構與天然分子類似的側鏈取代本發(fā)明REVOLUTA蛋白質的氨基酸，使本發(fā)明的該蛋白質分子的功能性活性發(fā)生中等的變化。這種類型的取代稱為保守取代，并不期望這種取代會大大改變多肽骨架的結構或分子中取代區(qū)域的電荷或疏水性。但是，可以預期當這類變化是在對蛋白質功能起關鍵作用的氨基酸位置發(fā)生時，即使是上述保守的氨基酸取代，也可能導致蛋白質功能的劇烈變化。
插入性REVOLUTA蛋白質變體是在天然REVOLUTA蛋白質分子中緊接特定位置的氨基酸插入一個或多個氨基酸的蛋白質變體。緊接氨基酸的位置指與該氨基酸的α-羧基或α-氨基功能團連接的位置?？刹迦胍粋€或多個氨基酸。通常是插入一個或多個保守的氨基酸。與鄰近插入位點的氨基酸的電荷和/或結構類似的氨基酸都可定義為保守的。本發(fā)明則不然，其插入氨基酸的包括電荷和/或結構卻與鄰近插入位點的氨基酸大大不同。
刪除性變體是天然REVOLUTA蛋白質分子中有一個或多個氨基酸被除去的那些分子。通常，刪除性變體是在REVOLUTA蛋白質分子的特定區(qū)域中刪除了一個或兩個氨基酸。
術語“生物學活性”、“生物學上活躍的”、“活性”、“活躍的”、“生物學功能”、“REV生物學活性”和“功能性”都是指本發(fā)明REVOLUTA蛋白質，二聚化(或組合成蛋白質寡聚物)的能力、或者調節(jié)或影響天然野生型(如內源的)REVOLUTA蛋白質的二聚化的能力。但是，這些術語還包括本發(fā)明REVOLUTA蛋白質與其它分子結合和/或相互作用的能力，其中，所述結合和/或相互作用過程可介導植物細胞的分裂，并最終賦于REV表型；或者這些術語包括調節(jié)或影響其它分子與天然野生型REVOLUTA蛋白質(如內源的)的結合和/或相互作用的能力，其中，所述結合和/或相互作用過程可介導植物細胞的分裂，并最終賦予REV表型。這類分子的例子包括如HD-ZipIII族的其它一些成員。
本文所使用的關于本發(fā)明的核酸的生物學活性，是指該核酸調節(jié)或影響它的轉錄和/或翻譯，和/或最終賦予REV表型的能力。本文所使用的關于本發(fā)明核酸的生物學活性，還包括該核酸調節(jié)或影響天然野生型(如內源的)核酸REVOLUTA的轉錄和/或翻譯、和/或最終賦予REV表型的能力。
在文中使用的REV表型指由本發(fā)明的REV核酸或蛋白質賦予的表型，具體包括表現(xiàn)出與野生型相關的對器官或組織大小產生影響(如增加了種子、葉子、果實或根的大小)的特征。通常，通過檢查植株，將其中不同組織中含有的細胞數(shù)與母本植株的相應組織的細胞數(shù)進行比較。具有REV表型的植株，在其組織的代表性橫切面上的細胞數(shù)都具有統(tǒng)計學上的顯著性集確定REV表型變化。
可采用本領域周知的多種方法來測量本發(fā)明REVOLUTA蛋白質的生物學活性，例如，轉錄活性試驗法、DNA結合試驗法、或蛋白質寡聚化試驗法。Sessa等人，1993；1997 J.Mol.Biol.274303-309、1999、Gonzalez等人，1997；和Palena等人，1999 Biochem.J.，34181-87都已在關于HD-Zip蛋白質的文章中描述了這種實驗試法(本文納入上述出版物的內容作為參考)。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質的氨基酸序列變體可具有合乎需要的改變了的生物學活性，包括例如，增加或降低的對DNA靶位點的結合親和力、增加或降低形成同源和/或異源蛋白質寡聚物的能力，和改變了的靶基因的調節(jié)。
術語“載體”、“表達載體”指通常是雙鏈的一段DNA，其中可能已插入一段外源DNA。載體或復制子可以是例如質粒，或者是病毒源性的。載體含有促進其在宿主細胞中進行自主復制的“復制子”多核苷酸序列。本公開的文章中的術語“復制子”還包括靶向或促進載體序列重組到宿主染色體中的序列區(qū)域。此外，有時外源DNA從一開始就插入DNA病毒載體中，該病毒載體DNA轉化到宿主細胞中后可能導致該病毒DNA轉換成病毒RNA載體分子。外源DNA被定義為異源性DNA，它不是宿主細胞中天然發(fā)現(xiàn)的DNA，例如它可復制載體分子和可編碼可選擇或可篩選的標記物或轉基因。該載體可被用于將外源或異源DNA轉運到合適的宿主細胞中。一旦進入宿主細胞中，該載體就能獨立于宿主的染色體DNA進行復制，或與染色體DNA重合，而產生該載體和它插入的(外源)DNA的幾個拷貝?；蛘撸撦d體可以定向將外源DNA插入宿主染色體。此外，該載體還含有一些必需元素可使外源DNA轉錄成mRNA分子，或者引起該外源DNA復制多份RNA拷貝。有些表達載體還額外含有一些鄰近插入的外源DNA的序列要素，可使mRNA翻譯成蛋白質分子。由此可快速合成由該外源DNA編碼的許多mRNA和多肽分子。
術語“轉基因載體”指含有外源DNA的插入片段的載體，該插入片段就是在宿主細胞中可轉錄成mRNA或復制成RNA的“轉基因”。術語“轉基因”不僅指轉化成RNA的外源DNA的部分，還指RNA的轉錄或復制所必需的載體的一些部分。此外，轉基因不必含有包含能生產蛋白質的開放讀框的多核苷酸序列。
術語“轉化的宿主細胞”、“轉化的”和“轉化作用”指將DNA導入細胞中。該細胞的術語稱為“宿主細胞”，它可以是原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括大腸桿菌(E.coli)的各種菌株。典型的真核宿主細胞是植物細胞如玉米細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或動物細胞。所導入的DNA通常是一種含有插入的DNA片段的載體形式?？蓮呐c宿主細胞相同的物種或不同的物種中獲得該導入的DNA序列；或者該序列可以是雜合的DNA序列，含有一些外源DNA和一些得自宿主物種的DNA。
除了天然的REVOLUTA氨基酸序列外，本發(fā)明的范圍還包括除受現(xiàn)有技術限制外所包括的由刪除、取代、突變和/或插入該產生的各種序列變體?？刹捎美缤ǔ７Q為位點定向誘變的技術使可編碼野生型REVOLUTA的DNA序列發(fā)生突變，從而構建本發(fā)明的各種REVOLUTA核酸序列變體?？刹捎帽绢I域普通技術人員所熟知的各種聚合酶鏈式反應(PCR)技術，來引起本發(fā)明編碼REVOLUTA蛋白質的核酸分子發(fā)生突變。例如參見“PCR策略”，M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky編輯，1995，Academic Press，San Siego，CA(第14章)；“PCR方案方法和應用指南”，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White編輯，Academic Press，NY(1990)。
通過非限制性實施例，可使用用于Clontech的Transformer Site-DirectedMutagenesis試劑盒的兩個引物系統(tǒng)，將位點定向突變體導入本發(fā)明的REVOLUTA基因中。隨著本系統(tǒng)的靶質粒發(fā)生變性，兩條引物同時退火到該質粒上；一條引物含有合乎需要的位點定向突變，另一條含有在該質粒的另一位點上的突變而導致其限制性位點的消除。然后進行與這兩個突變緊密地連接的第二條鏈的合成，并將所形成的質粒轉化到大腸桿菌的mutS株中。從轉化的細菌中分離出質粒DNA，用相關的限制性酶進行限制(從而使各未發(fā)生突變的質粒直線化)，然后將其轉化到大腸桿菌中。這個系統(tǒng)可使表達質粒直接產生突變，而不必經過亞克隆化或產生單鏈噬粒。兩種突變的緊密連接以及接下來的未發(fā)生突變的質粒的直線化導致高的突變效率和大大減少篩選過程。在原初限制性位點引物合成之后，本方法對每個突變位點只需要使用一種新的引物類型。與分別制備各種位點性突變體相比，這樣有可能一次性合成一組“按計劃變性”的寡核苷酸引物，以便將所有合乎需要的突變同時導入在給定的位點。通過給質粒DNA的誘變區(qū)域測序以確定和挑選突變體克隆，從而篩選出相應的轉化子。然后可在突變檢測強化(Mutation Detection Enhancement)凝膠(J.T.Baker)上進行電泳，以確證在已產生的序列中沒有其它不相干的變化(通過與未誘變的對照品的條帶偏移比較)，從而限制和分析每一個突變體DNA?；蛘?，可對整個DNA區(qū)域進行測序，以確證在靶區(qū)域外沒有發(fā)生額外的突變現(xiàn)象。
可使用pET(或其它)超表達載體中經檢驗的突變體雙顯性組合，來轉化大腸桿菌例如大腸桿菌BL21(DE3)pLysS株，以獲得高水平產量的突變體蛋白質，并采用標準規(guī)程進行純化?？墒褂肍AB-MS繪圖方法快速檢查突變體表達的保真度。這種技術可提供遍及整個蛋白質的測序用片段，并提供了在測序任務中必需的可靠性。在這種類型的繪圖實驗中，用蛋白酶消化蛋白質(依即將進行修飾的特定區(qū)域而作出選擇，因為主要關注的就是這個片段，余下的圖譜應與未誘變的蛋白質的圖譜相同)。使用微孔HPLC(反相或離子交換，同樣依賴于所要修飾的特定區(qū)域)將解離的片段分級分離，每一級中要提供幾條肽，這些肽的分子量可由FAB-MS測定。然后將這些分子量和預期從預定序列的消化處理中得到的肽的分子量進行比較，并迅速確定該序列的正確性。由于這種對蛋白質修飾的誘變方法是定向的，所以如果其MS與預期值相一致，就不需對該改變的肽進行測序。如果需要核實一個改變的殘基，可使用CAD-級聯(lián)MS/MS對有問題的混合物中的一些肽類進行測序，或者依修飾的位置采用負式Edman降解法或羧肽酶Y消化法對純化的靶肽進行測序。
在特定位點定向誘變設計中，通常需要首先制備非保留性取代(如用Ala取代Cys、His或Glu)，并確定所得結果的活性是否被極大地損傷。然后特別著重于DNA靶位點結合和HD-Zip蛋白質寡聚化以檢查誘變蛋白質的特性，再采用先前所述的試驗方法，與天然REVOLUTA蛋白質的特性進行比較，就可推斷出這種特性。如果通過這種方法證明了該殘基對于活性的削弱、或者對于剔除具有重要作用，那么就可進行保守的取代，如用Asp取代Glu，以改變側鏈的長度，用Ser取代Cys，或者用Arg取代His。對于疏水性片段，其大部分的大小可有效地被改變，即使是芳族的殘基也可被烷基側鏈取代。DNA結合和蛋白質多聚化過程的變化，將揭示REVOLUTA蛋白質的哪些特性已經在突變過程發(fā)生改變。
也可對本發(fā)明的核苷酸序列使用其它位點定向誘變技術。例如，如Sambrook等人(Molecular Cloning A Laboretory Manual，第二版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，NY)在第15.3節(jié)所述，可先用限制性核酸內切酶消化DNA，接著進行綁扎，以產生REVOLUTA的各種刪除性變體。如Sambrook等人(同上)所述，可采用類似的策略構建各種插入性變體。最近Zhu等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，968768-8773)設計了一種使用各種嵌合性RNA/DNA寡核苷酸在體內使植物基因靶向突變的方法。
還可使用寡核苷酸定向誘變的方法制備本發(fā)明的各種取代性變體。該方法還可方便地用來制備本發(fā)明的各種刪除性和插入性變體。這種技術是本領域中熟知的，如Adelman等人(1983，DNA，2183)、Sambrook等人(同上)；“分子生物學中的通用方案”，1991，Wiley(NY)，F(xiàn).T.Ausubel、R.Brent、R.E.Kingston、D.D.Moore、J.D.Seidman、J.A.Smith和K.Struhl編輯中所述。
通常，至少用長度為25個核苷酸的寡核苷酸進行插入、刪除或取代可編碼本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質的核酸分子中的兩個或多個核苷酸。最佳的寡核苷酸是在供突變的核苷酸編碼的任一側具有12-15個最佳匹配的核苷酸。為了誘變可編碼本發(fā)明的野生型REVOLUTA基因的各種核酸，須在合適的雜交條件下將該寡核苷酸退火到單鏈DNA的模板分子上。然后加入DNA聚合酶，通常是用大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段。這種酶使用該寡核苷酸作為引物，來完成具有突變鏈的DNA的合成。從而DNA的一條鏈可編碼插入載體中的野生型REVOLUTA從而形成雜合雙顯性組合分子，另一條則可編碼插入相同載體中的突變形式的REVOLUTA。然后將這個雜合雙顯性組分分子轉化到合適的宿主細胞中。
可以幾種方式中的一種產生具有超過一個氨基酸取代的各種突變體。如果這些氨基酸在該多肽鏈中都處于接近的位置，那么可使用一個寡核苷酸來編碼所有合乎需要的氨基酸取代而使它們同時突變。但是，如果各氨基酸位置相互之間有一些距離(如有超過10個氨基酸將它們隔開)，那么產生一個可編碼所有所需的變化的單一的寡核苷酸就比較困難。替代的辦法是可在下述兩種方法中選擇一種。第一種方法是，為每一個被取代的氨基酸產生一個分離的寡核苷酸。然后將各該寡核苷酸同時退火到單鏈模板DNA上，從該模板合成的DNA的第二鏈就可編碼所有所需的氨基酸取代過程。另一方法是經過兩輪或多輪的誘變處理來產生所需的突變體。第一輪在單一突變體方面已有描述使用野生型REVOLUTA DNA作為模板，將編碼第一條所需的氨基酸取代的寡核苷酸強化到該模板上，就可產生雜合雙顯性組合DNA。第二輪誘變是使用在第一輪誘變中產生的突變的DNA作為模板。因此，這個模板已經含有一種或多種突變因素。然后將可編碼額外合乎需要的氨基酸取代過程的寡核苷酸強化到這個模板上，所形成的DNA鏈就可編碼第一輪和第二輪誘變所產生的一系列突變。所得的該DNA可用作第三輪誘變的模板，依次類推。轉基因植物例如將可編碼REVOLUTA的轉基因載體(如質粒、病毒等)轉移到植物中就可獲得轉基因植物。較佳的是，當該載體是質粒時，它還可含有可選擇的標記基因，如可編碼抗卡那霉素的卡那(kan)基因。最常用的植物轉化方法是，如Hoeckema等人所述(1983，Nature，303179-181)，將靶轉基因克隆到植物轉化載體中，然后將該載體轉化到含有輔助Ti-質粒的根癌農桿菌(Agrobacterium tumifaciens)中。如An等人所述(1986，Plant Physiology，81301-305；還參見Hooykaas，1989，Plant Mol.Biol.，13327-336)，將含有該轉基因載體的土壤農桿菌細胞與用于轉化的植株的葉切片一起培育。如上面所述，通過根癌農桿菌通常就可實現(xiàn)培育的植物宿主細胞的轉化過程。通常采用最初由Graham等人(1978，Virology，52546)所述后來在Sambrook等人(同上)的第16.32-16.37各節(jié)中所述的改良的磷酸鈣方法，就可使不具有剛性細胞膜隔障的宿主細胞培養(yǎng)物轉化。但是，還可使用其它可將DNA導入細胞的各種方法，如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物法(Polybrene)(Kawai等人，1984，Mol.Cell.Biol.，41172)、原生質體融合法(Schaffner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，772163)、電穿孔法(Neumann等人，1982，EMBOJ.，1841)和細胞核內直接微注射法(Capecchi，1980，Cell，22479)。通過在含有如卡那霉素和適量植物激素(如用于誘導愈傷組織和幼芽病傷組織的萘乙酸和芐基腺嘌呤的培養(yǎng)基中使細胞生長，根據(jù)可選擇的標記物選出轉化的植物。植物細胞就會再生，并可采用本領域熟練的技術人員所熟知的方法將所得到的植物轉移到土壤中。
除了上述各種方法外，本領域還已知多種可將克隆的DNA轉移到種類繁多的植物物種(包括裸子植物、被子植物、單子葉植物和雙子葉植物)中的方法(例如參見Glick和Thompson編輯，1993，Methods in Plant Molecular Biology，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida；Vasil，1994，Plant Mol.Biol.，25925-937；和Komari等人，1998，Current Opinions PlantBiol.，1161-165(綜述)；Loopstra等人，1990，PlantMol.Biol.，151-9和Brasileiro等人，1991，PlantMol.Biol.，17441-452(樹木的轉化)；Eimert等人，1992，Plant Mol.Biol.，19485-490(蕓苔的轉化)；Hiei等人，1994，Plant J.，6271-282；Hiei等人，1997，Plant Mol.Biol.，35205-218；Chan等人，1993，Plant Mol.Biol.，22491-506；美國專利第5,516,668和5,824,857號(稻子的轉化)；美國專利第5,955,362號(小麥的轉化)、5969213(單子葉植物的轉化)、5,780,798(玉米的轉化)、5,959,179和5,914,451(大豆的轉化)〕。代表性的實施例包括電穿孔-促進法的原生質體對DNA的吸收(Rhodes等人，1988，Science，240(4849)204-207；Bates，1999，Methods Mol.Biol.，111359-366；D′Halluin等人，1999，Methods Mol.Biol.，111367-373；美國專利第5,914,451號)、用聚乙二醇處理原生質體法(Lyznik等人，1989，Plant Molecular Biology，13151-161；Datta等人，1999，Methods Mol.Biol.，111335-34)、和用帶有拋射微粒的DNA轟擊細胞法(Klein等人，1989，Plant Physiol.，91440-444；Boynton等人，1988，Science，240(4858)1534-1538；Register等人，1994，Plant Mol.Biol.，25951-961；Barcelo等人，1994，Plant J.，5583-592；Vasil等人，1999，Methods Mol.Biol.，111349-358；Christou，1997，Plant Mol.Biol.，35197-203；Finer等人，1999，Curt.Top.Microbiol.Immunol.，24059-80)。此外，Birch R.G.(1997，Ann Rev PlantPhys Plant Mol Biol，48297)和Forester等人(1997，Exp.Agric.，3315-33)已綜述了各種植物轉化的策略和技術。對這些技術稍微改動就可應用于廣泛的植物物種。
對于單子葉植物的轉化，顆粒轟擊似乎是一些大學實驗室選用的最經濟方法。但是，也可使用Hiei等人的1997年1月7日出版的題為“單子葉植物轉化的方法”的美國專利第5591616號中所述的用根癌農桿菌轉化方法轉化如玉米之類的單子葉植物。另一影響玉米轉化的方法是，將從胚胎發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物中獲得的細胞與纖維(5％w/v，Silar SC-9穗須)和質粒DNA(1μg/μl)的懸浮液混合，然后將所得混合物垂直放在Vortex Genie II渦流混合器(Scientific Industries Inc.，Bohemia，NY，USA)上的多樣品頭中，或者水平放在Mixomat齒科用汞齊混合器(Degussa Canada Ltd.，Burlington，Ontario，Canada)的支架上。然后以全速混合處理60秒鐘(Vortex Genie II)或以固定速率震動1秒鐘(Mixomat)，進行轉化。這一過程導致穩(wěn)定的轉化體別無選擇的細胞種群的產生。植株可從穩(wěn)定轉化的愈傷組織中再生，據(jù)Southern雜交分析法可顯示出這些植株和它們的后代都已是轉基因植物。此方法的主要優(yōu)點是簡單和低成本。與粒子轟擊法不同，它不需要昂貴的設備和材料。Coffee等人的1995年11月7日出版的題為“植物細胞的轉化”的美國專利第5,464,765號描述了使用須狀物來轉化植物的細胞尤其是玉米。
Dan等人的1999年10月19日出版的題為“大豆轉化和再生方法”的美國專利5,968,830號描述了轉化和再生大豆的方法。Hall等人的1999年10月19日出版的美國專利第5,969,215號描述了生產轉化的甜菜(Beta vulgaris)植株如制糖甜菜的轉化技術。
上述各種轉化技術都具有不同的優(yōu)缺點。在每一種技術中，對從質粒得到的DNA進行遺傳工程改造，使其不僅含有相關的基因，還含有可選擇且可篩選的各種標記基因。一種可選擇的標記基因只可被用來選擇那些具有質粒的完整副本的細胞(其結構方式是該相關的基因和可選擇、可篩選的基因可被作為一個單元進行轉移)。該可篩選的基因可給那些僅僅攜帶相關的基因的細胞的成功培養(yǎng)提供另一種檢驗方法。
傳統(tǒng)的可用具有抗生素抗性的可選擇標記物轉化根癌農桿菌的方法還存在一些問題，因為公眾已提出反對意見，認為這種植物會給動物和人類散布不適當?shù)目股啬褪苄燥L險。采用與Komari等人的1998年3月24日出版的題為“將兩個T-DNA導入植物使之成為載體的方法”的美國專利第5,731,179號所述的類似的根癌農桿菌技術來轉化植物，就可從植株中消除這種抗生素標記物。如1998年1月27日出版的題為“單子葉植物的轉化程序”的美國專利第5,712,135號中所述，通過使用bar或pat來編碼各序列，可有效避免抗生素抗性問題。這些都是可編碼抑制或抵消谷氨酰胺合成酶抑制子除草劑膦絲菌素(glufosinate)和glufosinate銨鹽(Basta，Ignite)的作用的次級蛋白質或多肽的最佳的標記DNA。
采用先前提到的任何一種技術，可將含有這些基因中的一種或多種的質粒導入植物原生質體或愈傷組織細胞中。如果該標記基因是一種可選擇基因，那么僅有那些已摻入了DNA包的細胞才能夠在使用恰當?shù)闹参锒拘灾苿┻x擇的條件下保持生存。一旦鑒別出適當?shù)募毎⑵浞敝?，就可再生植株。必須檢驗該轉化的植株的后代，以確保該DNA包已被成功地整合到該植株的基因組中。
可影響成功轉化的因素很多。外源基因結構的設計和構建及其調節(jié)要素都可影響該外源序列整合到植物細胞核的染色體DNA中，從而影響該細胞表達該轉基因的能力。以無傷害的方式將外源基因結構導入植物細胞核的合適的方法是很重要的。尤其是，如果要遍及整個植物，則該結構所導入的細胞類型必須是采用適當?shù)脑偕桨缚墒怪偕念愋汀?br> 在本發(fā)明的初始的一些克隆步驟中，還曾使用原核生物細胞作為宿主細胞。它們特別有效于進行大批DNA的快速生產、用于位點定向誘變的單鏈DNA模板的生產、同時篩選多種突變體、以及對所產生的各種突變體進行DNA測序。合適的原核宿主細胞包括大腸桿菌K12株94(ATCC第31,446號)、大腸桿菌W311O株(ATCC第27,325號)、大腸桿菌X1776株(ATCC第31,537號)和大腸桿菌B；但是，大腸桿菌的許多菌株(如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539)和原核生物的其它種類和種屬包括芽孢桿菌類如枯草桿菌桿菌(Bacillus subtilis)、其它腸桿菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或皺縮沙雷氏菌(Serratiamarcesans)和各種假單胞菌屬菌種(Pseudomounas)都可以用作宿主。較佳的是采用Sambrook等人(同上)在1.82節(jié)中所述的氯化鈣方法來轉化具有剛性細胞壁的原核生物宿主細胞或其它宿主細胞。或者，可采用電穿孔的方法轉化這些細胞。Dower，W.J.在《遺傳工程、原理和方法》中(12275-296，Plenum Publishing Corp.，1990)和Hannahan等人(1991，Meth.Enzxymol.，20463)描述了原核生物的各種轉化技術。
本領域熟練技術人員都熟知，含有復制子的任何質粒載體和得自任何物種的相當于宿主細胞的各種對照序列都可在本發(fā)明的實施例中使用。該載體通常具有一個復制位點、提供轉化細胞的表型選擇的一些標記基因、一個或多個啟動子和含有幾個可插入外源DNA的限制性位點的多連接物區(qū)域。用于轉化大腸桿菌的質粒一般包括pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC1 19和Bluescript M13，在Sambrook等人(同上)的第1.12-1.20節(jié)中對這些質粒都進行了描述。但是，也有許多其它合適的載體可供使用。這些載體含有可編碼氨芐青霉素和/或四環(huán)素抗性的基因，這些基因可使該由這些載體轉化的細胞能在這些抗生素的存在的條件下生長。
在原核生物載體中最常用的啟動子包括，β-內酰胺酶(青霉素酶)和若干乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等人，1978，Nature，375615；Itakura等人，1977，Science，1981056；Goeddel等人，1979，Nature，281544)和色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等人，1980，Nucl.Acids Res.，84057；EPO Appl.Publ.第36,776號)、和各種堿性磷酸酶系統(tǒng)。這些都是最常使用的，但是也已經使用其它各種微生物的啟動子，并且已經出版了關于它們的核苷酸序列的詳細資料，使得熟練的技術人員能按其功能將它們連接到各種質粒載體上(參見Siebenlist等人，1980，Cell，20269)。
一般從細胞中分泌多種真核生物蛋白質都含有作為氨基酸序列一部分的內源性分泌信號序列。因而，通過將信號序列連接于一般在細胞質中發(fā)現(xiàn)的蛋白質上就可確定該類蛋白質分泌的靶向。這很容易實現(xiàn)將只要可編碼信號序列的DNA連接到可編碼該蛋白質的DNA的5′端，然后在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_此融合蛋白質?？删幋a該信號序列的該DNA可以作為限制性片段而從可編碼帶有該信號序列的蛋白質的任何基因獲得。因而，在本發(fā)明中可以根據(jù)本發(fā)明實際所用的宿主細胞的類型而使用原核生物、酵母和真核生物的信號序列。可編碼幾種真核生物基因的該信號序列部分的DNA和氨基酸序列，包括如人生長激素、胰島素原和清蛋白是已知的(參見Stryer，1988，Biochemistry，W.H.Freeman和公司，NewYork，NY，第769頁)，并且它們可在適當?shù)恼婧松锼拗骷毎杏米餍盘栃蛄?。酵母的信號序列如酸性磷酸酯?Arima等人，1983，Nuc.Acids Res.，111657)、α-因子、堿性磷酸酯酶和轉化酶可用來指示酵母宿主細胞中的分泌過程。從可編碼如Lamb或OmpF(Wong等人，1988，Gene，68193)、MalE、PhoA或β-內酰胺酶的各種基因以及其它基因獲得的原核生物信號序列，都可用作原核生物細胞在培養(yǎng)基中表達的各種靶蛋白質。
采用標準重組DNA方法可制備含有可編碼各種復制序列、調節(jié)序列、表型選擇基因和有關的REVOLUTA DNA的DNA的各種合適載體的結構。各種分離的質粒、病毒載體和DNA片段都可被分割、裁剪，并以特定的順序連接一起，以產生所需的載體，這是本領域所周知的(參見如Maniatis，同上和Sambrook等人，同上)。
如上所述，通過位點定向誘變方法可以突變方式產生各種REVOLUTA變體。這種方法需要合成和使用特殊的寡核苷酸，該寡核苷酸可編碼所需突變的序列和足量的鄰近核苷酸，以使其穩(wěn)定地雜交到DNA模板上。
本發(fā)明包括調節(jié)植物細胞分裂的各種組合物和方法?？梢允褂煤醒苌远嗪塑账岬腞EVOLUTA的多種多樣的轉基因載體來實施本發(fā)明。當本發(fā)明的各種REVOLUTA轉基因被導入植物中，并且表達RNA或RNA及隨后的蛋白質時，植物細胞的分裂就得到調節(jié)。下面提供了采用多種不同方法的一些實施例，其中可使用REVOLUTA轉基因來增加或降低轉基因植株中REVOLUTA蛋白質的量。改變的REVOLUTA蛋白質水平可在整個植株中、或者在某組織或器官中以特殊的方式發(fā)生，這取決于操作性連接于REVOLUTA轉基因的啟動子序列的類型。
本發(fā)明還提供了一種轉基因植物；含有具有可在植物細胞中起作用的啟動子序列的嵌合型植物基因；引起可編碼融合多肽的RNA產生的編碼序列、或者引起同源基因抑制而使該嵌合型植物基因表達以調節(jié)植物生長的RNA。該嵌合型植物基因還具有與可編碼多腺苷酸化信號的基因的3′端緊密連接的3′非翻譯區(qū)域。該多腺苷酸化信號在植物細胞中起作用，可引起各種多腺苷酸化核苷酸加到該RNA的3′端。用于轉錄激活該嵌合型植物基因的5′啟動子序列，是一種與該編碼序列異源的啟動子，它適用于引起該嵌合型基因充分表達，以調節(jié)由該基因轉化的植物的植株生長。REVOLUTA基因表達的抑制有多種方法可用于抑制植物中基因的表達。例如，可方便地采用反義RNA技術。先前已經證明，反義RNA在各種發(fā)育系統(tǒng)中可成功地抑制不需要的基因的表達(Van der Krol等人，1990，Plant Mol.BioL，14457；Visser等人，1991，Mol.Gen.Genet.，225289；Hamilton等人，1990，Nature，346284；Stockhaus等人，1990，EMBO J.，93013；Hudson等人，1992，Plant Physiol.，98294；美國專利第4,801,340、5,773,692、5,723,761和5,959,180號)。例如，聚半乳糖醛酸酶對蕃茄成熟后階段的果實軟化產生作用(Hiatt等人，1989，GeneticEngineering，Setlow編輯，第49頁；Sheehy等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858805；Smith等人，1988，Nature，334724)。在CaMV 35S啟動子的控制下，整合到基因組中各反義結構，可抑制這種軟化過程。對聚半乳糖醛酸酶mRNA水平的檢測結果顯示有90％的基因表達受到抑制。
反義基因是當有義基因相對于它正常的轉錄表現(xiàn)呈反向時所產生的一種DNA序列。“有義”基因指過程在其正常定向使用反義技術可控制其定向的一種基因?？梢远喾N不同方式構建反義基因，條件是能干擾有義基因的表達。較佳的是，使有義基因的編碼區(qū)域以相對于其正常的轉錄表現(xiàn)相反的方向構建反義基因，使它的互補序列進行轉錄，因此由該反義和有義基因編碼的各種RNA都可互補。據(jù)了解，本發(fā)明的結合到反義結構中的一部分可能足以有效地干擾有義基因的表達，因而術語“反義基因”在本文中包括該全長反義基因的任何功能性部分。術語“功能性”包括能有效干擾有義基因的表達的反義基因的部分。
被導入的核酸片段一般與將被抑制的內源REVOLUTA基因或基因系列的至少一部分基本上相同。但是，該序列不需完全都要抑制表達。通常，可采用較高的同源性來對較短的REVOLUTA序列的使用予以補償。此外，所導入的REVOLUTA序列不需具有相同的內含子或外顯子模式，非編碼片段的同源性可以同等有效。通常，應該使用長約25-40個核苷酸的序列和接近全長的REVOLUTA基因序列，雖然較佳的是至少長約100個核苷酸的序列，更佳的是至少長約200個核苷酸的序列，特別優(yōu)選至少長約500個核苷酸的序列。然后將此結構轉化到植株中，以產生RNA的反義鏈。
還可使用各種催化性RNA分子或核糖酶來抑制各種REVOLUTA基因的表達。設計可編碼各種RNA核糖酶的各種核糖酶轉基因是可能的，該轉基因實際上可特異地與任何靶RNA配對，并在特殊位點分裂磷酸二酯鍵骨架，從而從功能上使該靶RNA滅活。在進行這種分裂時，核糖酶自身并不改變，因而它能再使用于分裂其它分子，成為一種適用的酶。在反義RNA中包含的核糖酶序列賦予該反義RNA以RNA分裂活性，從而增加了這類結構活性。
有一類核糖酶可從能在各種植物中的多種自主分裂和復制的小型環(huán)狀RNA中產生。這些RNA或可單獨復制(類病毒RNA)或可與輔助病毒(衛(wèi)星RNA)一起復制。例子包括鱷梨曬斑病類病毒的各種RNA和煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿一時性條紋病毒、柔性煙草斑紋(velvet tobacco mottle)病毒、茄屬斑紋(solanumnodiflorum mottle)病毒和隱藏三葉草斑紋(subterranean clover mottle)病毒等的各種衛(wèi)星RNA。Haseloff等人(1988，Nature，334585-591；還參見美國專利第5,646,023號)描述了靶RNA特異性核糖酶類的設計和應用。Tabler等人(1991，Gene，108175)通過將反義RNA的優(yōu)點和核糖酶技術組合到簡單結構中，從而極大地簡化了催化性RNA的構建。核糖酶催化作用需要較小區(qū)域的同源性，因此如果是保留著一些分裂位點，就可促進基因大家族不同成員的抑制。同時，這些結果指出了使用反義RNA和/或各種核糖酶作為操控組建各種有價值的農作物的實用手段的可行性。
另一抑制REVOLUTA蛋白質表達的方法是有義抑制作用。最近的研究顯示，以有義定向方式裝配的核酸的導入，是一種可阻斷靶基因轉錄的有效的方法。采用這種方法調節(jié)各種內源基因表達的例子可參見Napoli等人(1990，Plant Cell，2279-289)、Hamilton等人(1999，Science，286950-952)和美國專利第5,034,323、5,231,020、5,283,184和5,942,657號。
最近發(fā)展了一種新的抑制靶基因表達的方法。這種方法涉及將一種反向重復轉基因導入宿主細胞中，該轉基因可指導能自行退火而形成雙鏈(ds)RNA結構的mRNA的產生(Vionnet等人，1998，Cell，95177-187；Waterhouse等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513959-13964；Misquitta等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961451-1456；Baulcombe，1999，Current Opinion Plant Biol.，2109-113；Sharp，1999，Genes and develop，13139-141)。該dsRNA分子以現(xiàn)尚未知的一種方式干擾與該dsRNA同源的各種內源基因轉錄后的表達。已顯示dsRNA的同源區(qū)域必須含有與靶基因的外顯子部分同源的區(qū)域。因而，該dsRNA可能包括與靶基因的非編碼部分同源的各種序列?；蛘撸部赏ㄟ^用兩種不同的轉基因轉化細胞而產生基因抑制性dsRNA，其中一種轉基因表達有義RNA，而另一種轉基因則與反義RNA互補。
采用下述Waterhouse等人(1998)實施的一個通用例子可制備含有反向重復的REVOLUTA轉錄序列的結構。該結構的反向重復部分含有約200-1500bp的轉錄的DNA，以頭對頭或尾對尾的排列方式重復。重復部分被約200-1500bp非重復DNA隔開，這些非重復DNA也可以是轉錄的REVOLUTA區(qū)域的一部分，或者可以從不同的基因獲得，它們可能含有內含子。將下列部分以正確的順序連接，可制備合適的REVOLUTA抑制子轉基因結構植物啟動子；從以正確的“有義”定向方式確定的REVOLUTA cDNA得到的3′區(qū)域；從該cDNA獲得的5′區(qū)域；從該cDNA獲得但以“反義”定向方式確定REVOLUTA編碼序列的相同的3′區(qū)域；最后是poly A額外信號。不論該順序如何選擇，通過將該反向重復轉基因導入靶植物所產生的轉錄的REVOLUTA RNA，都可具有形成內在dsRNA區(qū)域的潛力，該區(qū)域含有從即將被抑制的REVOLUTA轉基因獲得的各種序列。可選擇這類dsRNA序列以抑制單一的或可能多種REVOLUTA基因。在一些例子中，具有dsRNA形成潛力的序列可由兩種或多種REVOLUTA基因產生。
適合于抑制REVOLUTA活性的附加策略是要求根據(jù)顯性失活突變過程產生的一般標準REVOLUTA蛋白質以突變的或部分刪除的形式的有義表達(HerskowitzI，1987，Nature，329219-222)。該REV蛋白質是在同源域的DNA結合基元部位發(fā)生突變，或者以產生截短的REV蛋白質的方式發(fā)生突變。Mizukami(1996)、Emmler(1995)、Sheen(1998)和Paz-Ares(1990)提供了產生各種顯性失活突變過程的策略的一些例子。
通常，在需要的表達過程抑制時，所導入的序列有一些可被轉錄。當所導入的序列本身不含有編碼序列，但僅含有內含子或與存在于內源序列的原始轉錄文本中的各種序列同源的未翻譯的序列時，就可能發(fā)生這種影響。該導入的序列通常與要抑制的內源序列基本上相同。最小同一性一般大于約65％，但較大的同一性可表現(xiàn)更有效地抑制各種內源序列的表達?；旧贤恍猿^約80％時更佳，如果是約95％到完全相同則最佳。至于反義調節(jié)，這種影響應適用于表現(xiàn)同一性或基本上相同的類似基因家族內的其它任何蛋白質。
對于有義抑制過程，相對于主要的轉錄過程產物或經全長加工的mRNA，所導入的序列不需要完全相同，也不需要全長。這樣可有利于避免同時產生一些超表達的植物。短于全長的序列的較大同一性可補償較長但同一性較差的序列的不足。此外，導入的序列不需要具有相同的內含子或外顯子模式，各種非編碼片段的同一性是同等有效的。通常是使用上述大小范圍的序列來進行反義調節(jié)。
通過采用對REVOLUTA基因側接一些DNA區(qū)域來靶向該REVOLUTA編碼序列的插入性斷裂部位，也可消除或減少野生型REVOLUTA基因的功能(Miao等人，1995，Plant J.，7359-365；Kempin等人，1997，Nature，389802-803)。REVOLUTA的靶向基因的替換是由得自側接該REV基因的各種DNA區(qū)域的轉化載體中的各種序列和相應的各種染色體序列之間的同源重組來介導的。在REV的一些側接區(qū)域中含有一個可選擇的標記物如卡那霉素、bar或pat，或者含有一個可篩選的標記物，如β-葡糖醛酸酶(GUS)。這些標記物有利于對進行REV基因替換的細胞的鑒別。也可鑒別出發(fā)生了成功的REVOLUTA基因替換的各種植物，因為植物的組織中細胞數(shù)有變化。啟動子可用于本發(fā)明的實踐的應答性啟動子系統(tǒng)的直觀例子是玉米中的谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。GST是一族可給常用作芽前除草劑的各種疏水性親電子化合物解毒的酶類(Weigand等人，1986，Plant Molecular Biology，7235-243)。一些研究已顯示這種GST類直接參與引起這種增強的除草劑耐受性。其作用主要由一個特殊的1.1kb的mRNA轉錄產物介導。簡言之，玉米中天然存在著一種靜止的基因，該基因可對外部刺激應答并可被誘導產生一種基因產物。先前已鑒別和克隆了此基因。因而，在本發(fā)明的一個實施例中，從GST應答基因中取得該啟動子，將其連接到REVOLUTA的編碼序列上。如果該REVOLUTA基因得自基因組DNA，那么在構建嵌合型基因的過程中需要除去它的天然啟動子。這個經改造的基因是由對外部化學刺激應答的啟動子和負責成功產生REVOLUTA蛋白質的基因組合而成。
可誘導的啟動子是能直接或間接激活對誘導物應答的一種或多種DNA序列或一些基因的轉錄過程的啟動子。缺乏誘導物時，這類DNA序列或基因就無法轉錄。通常，特異地結合于可誘導的啟動子上以激活轉錄的蛋白質因子是以靜止形式存在，在誘導物的存在下，該啟動子就會直接或間接轉化成活性形式。誘導物可以是一種化學因子如蛋白質、代謝物、生長調節(jié)子、除草劑或酚類化合物，或者是由熱、冷、鹽或毒性元素直接強加或通過病原體或致病因子如病毒間接引起一種生理應力。通過在外部給細胞或植物使用誘導物，如采用噴灑、澆水、加熱或類似的方法，可將含有可誘導的啟動子的植物細胞暴露于該誘導物中。如果需要在植物發(fā)育過程的特定時間激活靶基因的表達，那么可在該時間使用誘導物。
這些可誘導的啟動子的例子包括，各種熱激啟動子，如黑腹果蠅(Drosphiliamelanogaster)的可誘導的70KD的熱激啟動子(Freeling等人，Ann.Rev.of Genetics，19297-323)；冷性可誘導啟動子，如從蕪菁甘藍(B.napus)獲得的冷性可誘導啟動子(White等人，1994，Plant Physiol.，106)；和由乙醇誘導的醇脫氫酶啟動子(NagaoR.T.等人，Miflin B.J.編輯，Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology，1986，第3卷，第384-438頁，牛津大學出版社，牛津)。
或者，可使用如BCE.4苷藍(B.campestris胚胎)啟動子使本發(fā)明的各種REVOLUTA轉基因表達，已顯示該啟動子可在種子發(fā)育非常早的階段指導高水平的表達(即在蕪菁素(napin)啟動子之前已轉錄)。對于芥類植物種子這是在貯存產物積累之前而色素快速的生物合成的時期(Johnson-Flanagan等人，1989，J.PlantPhysiol.，136180；Johnson-Flanagan等人，1991，Physiol.Plant，81301)。還已顯示各種種子貯存蛋白質啟動子可以種子特異性方式指導高水平的表達(Voelker等人，1989，Plant Cell，195；Altenbach等人，1989，Plant Mol.Biol.，13513；Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，996181；Russell等人，1997，Transgenic Res，6157-68)。已顯示蕪菁素(napin)啟動子可指導轉基因芥類植物中的油質蛋白基因的表達，此時油質蛋白可累積到總種子蛋白質的約1％(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，996181)。表2列出了可用于本發(fā)明的其它胚胎特異性啟動子。
表2.胚胎特異性啟動子
在選擇啟動子時，可能需要使用組織特異性或調節(jié)發(fā)育的啟動子，該啟動子使得某些組織中的表達被抑制或超表達而不影響其它組織中的表達?！敖M織特異性啟動子”指主要指導在特殊組織如根、葉、莖、雌蕊、花藥、花瓣、種皮、種仁或表皮層中的基因表達的編碼區(qū)域。可將各種轉錄刺激物、增強子或激活子整合到組織特異性啟動子中，以產生具有高活性水平并保留了組織特異性的啟動子。例如，在超表達中使用的各種啟動子最佳是具有組織特異性。在錯誤的組織中的超表達可能是有害的，如當試圖在種子貯存區(qū)域中超表達結果卻在葉子中超表達。本發(fā)明最佳的表達盒一般包括但不限于種子特異性啟動子。使用種子特異性啟動子是為了確保接下來只限于在種子中表達。
種子特異性啟動子的例子，包括Thomas等人在1999年11月2日出版的題為“用于改變植物種子脂質組合物的油質蛋白5′調節(jié)區(qū)域”(本文已全部引為參考)的美國專利第5,977,436號中所述的擬南芥油質蛋白基因的一些5′調節(jié)區(qū)域，當將該區(qū)域操作性連接于異源基因的編碼序列或與天然植物基因互補的序列時，它可指導該異源基因或在植物種子中的互補序列的表達。
這些例子還包括各種種子貯存蛋白質的啟動子，該啟動子以高度調節(jié)的方式例如在雙子葉植物的種子中表達這些蛋白質，如菜豆蛋白(豆子葉)(Sengupta-Gopalan等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823320-3324)；蕪菁素啟動子、conglycinin啟動子和大豆外源凝集素啟動子、patatin(馬鈴薯塊莖)(Rocha-Sosa等人，1989，EMBO J.，823-29)；convicilin、vicilin和莢豆蛋白legumin(豌豆子葉)(Rerie等人，1991，Mol.Gen.Genet.，259148-157；Newbigin等人，1990，Planta，180461-470；Higgins等人，1988，Plant Mol.Biol.，11683-695)；植物血凝素(豆子葉)(Voelker等人，1987，EMBO J.，63571-3577)；conglycinin和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen等人，1988，EMBO J.，7297-302)；和sporamin(甘薯塊根)(Hattori等人，1990，Plant Mol.Biol.，14595-604)。對于單子葉植物，用于本發(fā)明的實踐的啟動子包括但不限于玉米的玉米醇溶蛋白啟動子(Schemthaner等人，1988，EMBO J.，71249-1255)、玉米醇溶蛋白啟動子、蠟質啟動子、皺縮(shrunken)-1啟動子、球蛋白1啟動子和皺縮(shrunken)-2啟動子、谷蛋白(稻米胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris等人，1988，Plant Mol.Biol.，10359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(美國專利第5,650,558號)?？墒褂檬静詈Y選技術來分離在特定(發(fā)育)時間在如果實發(fā)育期間表達的啟動子。但是，可用在本發(fā)明中的其它一些啟動子都是本領域熟練技術人員所熟知的。
特別優(yōu)選的啟動子是那些使種子特異性表達的啟動子。這種啟動子可能特別有用，因為種子是應予關注的主要器官，并且種子特異性表達將避免在非種子組織中的任何潛在的有害的影響。組織特異性啟動子的例子包括但不限于各種種子貯存蛋白質的一些啟動子，該啟動子在許多植物中可表達到占總種子蛋白的90％的量。種子貯存蛋白質都受到嚴格地調節(jié)，幾乎是專一地在種子中以高度組織特異性和階段特異性的方式表達(Higgins等人，1984，Ann.Rev.Plant Physiol.，35191-221；Goldberg等人，1989，Cell，56149-160)。此外，不同的種子貯存蛋白質都可在種子發(fā)育的不同階段表達。已非常詳細地研究了不同的種子特異性基因的表達〔參見Goldberg等人(1989)和Higgins等人(1984)的綜述〕。目前有關于在各種轉基因雙子葉植物中的各種種子貯存蛋白質基因的種子特異性表達的大量例子。這些例子包括從雙子葉植物得到的豆類β-菜豆蛋白(Sengupta-Gopalan等人，1985；Hoffman等人，1988，Plant Mol.Biol.，11717-729)、豆類外源凝集素(Voelker等人，1987)、大豆外源凝集素(Okamuro等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838240-8244)、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制物(Perez-Grau等人，1989，Plant Cell，11095-1109)、大豆β-conglycinin(Beachy等人，1985，EMBO J.，43047-3053)、豌豆球蛋白(Higgins等人，1988)、豌豆convicilin(Newbigin等人，1990，Planta，180461-470)、豌豆豆球蛋白(Shirsat等人，1989，Mol.Gen.Genetics，215326-331)、油菜籽蕪菁素(Radke等人，1988，Thero.Appl.Genet.，75685-694)的基因，以及從單子葉植物獲得的基因，如玉米15kD的玉米醇溶蛋白(Hoffman的，1987，EMBO J.，63213-3221)、玉米18kD油質蛋白(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8886181-6185)、大麥β-大麥醇溶蛋白(Manrris等人，1988，Plant Mol.Biol.，10359-366)和小麥麥谷蛋白(Colot等人，1987，EMBO J.，63559-3564)的基因。此外，各嵌合型基因結構中操作性連接于各異源編碼序列的一些種子特異性基因的啟動子，也維持了它們在各種轉基因植物中的時間和空間上的表達模式。這些例子包括，使用擬南芥2S種子貯存蛋白質基因啟動子在擬南芥和蕪菁(B.napus)種子中表達腦啡肽(Vandekerckhove等人，1989，Bio/Technology，7929-932)、使用豆類的leclin和豆類的β-菜豆蛋白啟動子表達熒光素酶(Riggs等人，1989，Plant Sci.，6347-57)和使用小麥麥谷蛋白啟動子表達氯霉素乙酰轉移酶(Colot等人，1987)。
還適合用于本發(fā)明的核酸片段的表達的有從幾種大豆種子貯存蛋白質基因中獲得的異源啟動子，如Kuntiz胰蛋白酶抑制物(Jofuku等人，1989，Plant Cell，11079-1093)、大豆球蛋白(Nielson等人，1989，Plant Cell，1313-328)和β-Conglycinin(Harada等人，1989，Plant Cell，1415-425)的啟動子；對在一些轉基因植物種子發(fā)育的中到晚期，在子葉中表達mRNA或反義RNA的大豆β-conglycinin貯存蛋白質的α-和β-亞單元的一些基因的啟動子(Beachy等人，1985，EMBO J.，43047-3053)；蕪菁的異檸檬酸鹽裂解酶和蘋果酸鹽合成酶(Comai等人，1989，Plant Cell，1293-300)、從紅花(Thompson等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882578-2582)和蓖麻(Shanklin等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882510-2514)得到Δ-9去飽和酶，從擬南芥(Post-Beittenmiller等人，1989，Nucl.Acids.Res.，171777)、蕪菁(Safford等人，1988，Eur.J.Biochem.，174287-295)和B.campestris(Rose等人，1987，Nucl.Acids Res.，157197)得到的?；d體蛋白質(ACP)，從大麥得到的β-酮?；?ACP合成酶(Siggaard-Andersen等人，199l，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884114-4118)以及從玉蜀黍(Zea mays)(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，886181-6185)、大豆(Genbank登記號碼X60773)和B.napus(Lee等人，1991，Plant Physiol.，961395-1397)得到的油質蛋白。
本發(fā)明的一些核酸片段要獲得正確的表達水平，可能需要用到使用不同啟動子的不同嵌合型基因。這種嵌合型基因或者可以在單一表達的載體中一起或者以使用1個以上的載體轉移到宿主植物中。
另一方面，花粉特異性啟動子，即在授粉之前或之后不久可調節(jié)短暫的表達以誘導果實的發(fā)育和成熟而不需明顯的種子發(fā)育的一類啟動子，通常是不需要的。這種不需要的啟動子，包括但不限于各種可誘導的啟動子、小孢子或大孢子啟動子、花粉特異性啟動子或母系組織啟動子(如種子表皮啟動子)或者任何與涉及授粉或 胚珠成熟或發(fā)育的基因有關的其它啟動子。
此外，常常需要各種增強子，或者增強子有助于增加本發(fā)明的基因的表達。這些要需要操作性連接于可編碼所需蛋白質的序列，并且這些調節(jié)性要素是可操作的。各種增強子和增強子樣要素可以是天然的或者是嵌合型的核酸片段。其中可包括病毒的增強子如35S啟動子中發(fā)現(xiàn)的增強子(Odell等人，1988，Plant Mol.Biol.，10263-272)、從冠癭堿基因得到的增強子(Fromm等人，1989，Plant Cell，1977-984)、或者從任何其它來源得到的增強子，當將其加到可操作性連接于本發(fā)明的核酸片段的啟動子中時可提高轉錄過程。例如，一種結構可以包括帶有連接于煙草Etch病毒(TEV)5′非翻譯前導區(qū)的雙重轉錄增強子的CaMV 35S啟動子。該TEV前導區(qū)起到增加蛋白質產量的翻譯可增強子的作用。
可根據(jù)已完全確定的方法將表2中描述的啟動子要素與各種REVOLUTA序列和一種合適的終止物(聚腺苷酸化區(qū)域)相融合。已經可以獲得對不同組織類具有型特異性的各種啟動子，或者可使用已各種完全確定的技術分離出這種啟動子(例如參見美國專利第5,792,925、5,783,393、5,859,336、5,866,793、5,898,096和5,929,302號)。
DNA的“消化”、“剪切”或“分裂”指使用僅在DNA的具體位置起作用的酶對DNA進行的催化分裂。這些酶稱為限制性內切核酸酶，而在DNA序列上各酶分裂的位點就稱為限制性位點。用于本發(fā)明的各種限制酶可從市售獲得，并根據(jù)制造商所提供的說明來使用(參見Sambrool等人第1.60-1.61和3.38-3.39各節(jié)，同上)。
從限制酶切消化物中對DNA給定片段的“回收”或“分離”指在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上進行電泳分離所得的DNA片段，通過與已知分子量的標記DNA片段的遷移率相比鑒別感興趣的片段，取得含有所需片段的凝膠部分和從凝膠中分離出DNA。這種方法是眾所周知的。例如，參見Lawn等人(1982，Nucleic AcidsRes.，96103-6114)和Geoddel等人(1980)。
結合下述一些代表性實施例可能會更充分理解上述內容，在這些實施例中，“質?！庇蛇B接字母數(shù)字標記的小寫p表示。用于本發(fā)明的起始質?？蔁o限制地公開從商品途徑獲得，或者可采用已發(fā)表的方法由可得到的質粒構建。此外，其它相當?shù)馁|粒在本領域中是已知的，并且對于普通技工來說也容易掌握。下述一些實施例并不局限于本發(fā)明的范圍，而只是在于闡明實施本發(fā)明的多種可能方法。
實施例1REVOLUTA的鑒別使用多態(tài)DNA標記物繪制REVOLUTA基因為了使用DNA中的小差異或多態(tài)性繪制基因，已從兩種不同生態(tài)型篩選出擬南芥的隔離種群。為了產生這種隔離種群，將含有在Nossen(No)生態(tài)型的revoluta基因(rev-1)中發(fā)生一些突變過程的純合植株與Landsberg erecta(Ler)生態(tài)型的野生型植株雜交。在所得的F1代中，各對染色體中有一條是No生態(tài)型的，另一條是Ler生態(tài)型的。所有的F1代含有從No母本得到的rev-1突變和從Ler母本的野生型REVOLUTA基因。使F1代植株中的一株(稱為21A)自體受精，得到F2代種子，在此種子中已發(fā)生了No和Ler染色體之間的重組。由這些種子長成的F2代植株就會因不同的多態(tài)性或標記物以及rev-1突變而發(fā)生分離。
為了檢測不同生態(tài)型之間的多態(tài)性，使用了一種稱為簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)的技術(Bell等人，1994，Genomics，19137-144)。SSLP標記物是一組在PCR反應(聚合酶鏈式反應)中可擴增基因組DNA的特殊區(qū)域的兩個引物。擴增的基因組DNA的大小在不同的擬南芥生態(tài)型之間的特殊區(qū)域中可以是不同的。這就可確定該區(qū)域是源于Ler還是No生態(tài)型。已在確定含有REVOLUTA基因的第5條染色體的區(qū)域中鑒定出兩條SSLP引物nga129和MBK5(Talbert等人，1995)。nga129引物(表3)可擴增從來自Ler生態(tài)型的179號堿基對(bp)片段，和來自No生態(tài)型的165號bp的片段(Bell等人，1994)。已知MBK5引物可擴增來自Ler生態(tài)型的～180bp的片段(http//genome.bio.upenn.edu/SSLP_info/coming-soon.html)。在No生態(tài)型DNA上使用這些引物進行的一組實驗證明了來自No生態(tài)型的～207bp的片段可被這些引物擴增。
因此，可使用這些SSLP引物篩選上述21A子代的隔離種群。首先，從形態(tài)學上鑒別出對rev-1突變純合的F2代植株(Talbert等人，1995)。然后制備基因組DNA如下。用blue杵(Kontes Glass Co.，Vineland，NJ)在微離心管中研磨約50mg葉子材料10秒鐘。然后，加入100μl PEB(100mM Tris，8.0，50mM EDTA，0.5MNaCl，0.7％SDS和20mg/ml新鮮加入的蛋白酶K)，再研磨該葉子材料20秒鐘。最后，加入325μl PEB，繼續(xù)研磨該材料，直到不存在大塊葉子(15秒鐘)。在65℃加熱1小時后，加入260μl飽和NaCl。以高速微離心該管20分鐘。將上清液轉移到含有850μl、85％異丙醇的新管中。將此混合物離心10分鐘，在70％乙醇中洗滌所得沉積物。然后將干燥的沉積物再懸浮在200μl TE緩沖液中，然后加入133μl LiCl，4℃保存該管。在室溫下使RNA沉淀10分鐘。將上清液轉移到新管中再加入2體積的乙醇。離心10分鐘后，使所得沉積物在空氣中干燥，然后再懸浮在50μl、10mM Tris(pH8.0)中。使用1μl的此DNA或1μl 1∶10稀釋的DNA進行PCR。
在1X緩沖液、2mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.25mM寡核苷酸、2U Taq聚合酶中使用nga129引物或MBK5引物(表3)(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)進行PCR反應擴增基因組DNA。PCR條件包括在94℃變性處理3分鐘；接著在94℃30秒鐘、55℃30秒鐘、72℃40秒鐘，此為一輪循環(huán)，共進行35輪。各項實驗中包括從No、Ler和21A植株獲得的對照DNA。在(從186株植株中)最初篩選的372條染色體中，有60條具有Ler標記物，這表明在No染色體和Ler染色體之間產生了重組。在用于分析MBK5的360條染色體中，僅有15條具有Ler標記物。
使用一種稱為K21L19的nga129F/R的～3.4Mb向南(朝向端粒)SSLP標記物篩選額外的rev-1植株。此SSLP標記物和其它標記物都使用下述方法鑒定。首先，從第5條染色體的接近繪入rev-1的區(qū)域的已知DNA序列上產生DNA序列的文本文件(FASTA格式)(http//www.ncbi.nlm.hih.gov/Entrez/nucleotide.html)。僅將該DNA序列的文本文件保存為Microsoft Word 98的文件，并將其用作通過http//blocks.fhcrc.org/～jorja/blastnew/html網頁獲得的搜索引擎的數(shù)據(jù)庫。以重復性DNA串(如至少長12bp的“GA”或“TA”重復基元)搜索擬南芥數(shù)據(jù)庫。然后使用引物程序選擇側接該重復區(qū)域的各種PCR引物(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer′primner3_www.cgi)。要選擇可擴增大約150-250bp大小的區(qū)域的引物對。然后用以對從No、Ler和21A植株抽提得到的DNA樣品進行測試，以確定是否能檢測到任何多態(tài)性。進一步使用擴增的在No和Ler生態(tài)型之間具有多態(tài)性的DNA片段的引物對繪制REVOLUTA基因。這些新的SSLP標記物(見表3)都以它們被從其中發(fā)現(xiàn)的細菌人工染色體克隆(BAC)來命名(擬南芥基因組已被克隆成～100Kb的片段，被克隆到BAC或其它類似的載體中，這些片段沿著該染色體連續(xù)排列)。如果在BAC中鑒別出一個以上標記物，那么該引物對就可出現(xiàn)額外的鑒別數(shù)。
表3供SSLP使用的寡核苷酸
當使用K21L19L和K21L19R引物(K21L19L/R)(表3)從含有nga129F/R/rev-1重組染色體的植物中篩選出DNA時，在原來的60條nga129重組染色體中有6條也是在K21L19L/R DNA區(qū)域的重組子。此外，對350條以上的染色體分析了K21L19L/R多態(tài)性標記物，在所得到的總共15個重組子中僅有9條是K21L19L/R的重組子。還使用MBK5-1和MBK5-2 PCR引物(MBK5 1/2)(表3)分析了這350條重組染色體。在對總共23個MBK5 1/2重組子中的MBK5 1/2引物對所限定的MBK5位置上鑒別出8個新的重組子。K21L19L/R和MBK5 1/2位置限定了擬南芥第5號染色體中的1.95Mb的區(qū)域。
在此區(qū)域產生了其它SSLP引物/標記物，在這些引物/標記物中，最能提供信息的是MUP24-1和2(MUP24 1/2)和MAF19L和R(MAF19L/R)(表3，圖1)引物?？墒褂眠@些標記物篩選從K21L19和MBK5 1/2重組植物中分離得到的DNA。在15條K21L19L/R重組子中，有3條是對MUP24 1/2標記物的重組子，而沒有對MAF19L/R標記物的重組子。在23條MBK5 1/2重組子中，有6條是對MAF19L/R重組子的，而沒有對MUP24 1/2的重組子。如圖1所示，這些結果將REVOLUTA基因放置于MUP24 1/2和MAF19L/R之間包含～340Kb的區(qū)域中。
在此區(qū)域中可產生各種新的SSLP標記物，使用這些新的標記物可進一步限定Ler和No(含有rev-1)染色體之間產生重組過程的位置。這些標記物列在圖2中，包括MUP24 3/4、MUP24 13/14、MAE1 1/2、MAE1 3/4和MAE1 5/6。REVOLUTA被MUP24.4編碼且它是一種新的HD-ZipIII亞族成員從上述繪圖的結果可以得到，含有REVOLUTA基因的最小的染色體區(qū)域長約68,000bp。對此區(qū)域中的翻譯的開放讀框的檢測結果揭示了約有11個可編碼REVOLUTA的潛在基因。MUP24.4這種含有蛋白質的同源域亮氨酸拉鏈(HD-Zip)被確定為感興趣的基因。在從6個不同的revoluta等位基因(rev1-6)中分離出來的DNA中確定了可編碼此HD-Zip蛋白質的DNA序列。如上述可從具有不同rev等位基因的葉子制備基因組DNA。采用長距離PCR，使用表4中的各種引物可擴增MUP24.4基因，擴增條件如Henikoff等人(1998，Genetics，149307-318)所述，還要在94℃進行變性處理步驟，并且在總共40輪的PCR擴增處理中，第10輪以后的每一輪都要延長20秒鐘時間。
表4.采用LD-PCR擴增MUP24.4所用的各種引物
根據(jù)制造商的指導，將從各revoluta突變體和野生型REVOLUTA基因得到的PCR產物克隆到TOPO II載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，只是建議對TOPO載體和PCR產物的用量減半。
使用spin minikrep試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)純化含有插入片段的質粒，并使用表5中所列的各種寡核苷酸和根據(jù)制造商指導使用ABI PRISM BigDye試劑盒(Applied Biosystems，現(xiàn)在是PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)給該質粒測序。
表5用于給HD-Zip蛋白質MUP24.4測序的引物
對每個revoluta等位基因的兩個獨立產生的克隆進行的序列分析表明，REVOLUTA基因序列〔SEQ ID NO1〕在這6個revoluta等位基因的每一個中都發(fā)生了突變。在兩個假定的基因編碼序列(rev-3〔SEQ ID NO5〕和rev-5〔SEQ IDNO5))和假定內含子/外顯子拼合連接點(rev-1〔SEQ ID NO3〕、rev-2，4〔SEQ IDNO7〕和rev-6〔SEQ ID NO11〕)中都發(fā)現(xiàn)了觀察到的突變(參見圖3)。因而，DNA序列分析鑒別出在所有6個revoluta突變體基因中都能表達REV HD-Zip蛋白質的開放讀框，但是在各例子中制得的revoluta蛋白質都具有改變的氨基酸序列。圖3〔SEQ ID NO2〕顯示了對野生型REVOLUTA蛋白質的預測氨基酸序列，并標出了各突變體氨基酸和拼接位點。rev-4突變體DNA〔SEQ ID NO7〕的翻譯過程表明，突變引起了在外顯子10的起始點的翻譯移碼，產生了一個新的有8個氨基酸羧基末端的序列。rev-4蛋白質終止在讀數(shù)框終止密碼子外，因而rev-4等位基因的轉譯過程產生了截短的rev-4多肽〔SEQ ID NO8〕。SEQ ID NO1列出了完整的可編碼REVOLUTA基因的基因組DNA區(qū)域的野生型DNA序列。表6列出了各revoluta等位基因中發(fā)生突變的核苷酸位置和與各突變體等位基因相關的核苷酸的改變。
表6擬南芥的存在于revoluta的各突變體等位基因中的No-生態(tài)型變化
圖4顯示了842個氨基酸REV蛋白質序列和先前確定的HD-Zip類III族的各成員的排列方式。REV和其它4種蛋白質之間在它們的全長上還存在大范圍的同源性。REV與ATHB-9和ATHB-14具有66％的同一性(78％的相似性)，與ATHB-8具有61％的同一性(75％相似性)。REV與假定是該家族的新成員F5F19.21(AAD12689.1)具有64％的同一性和77％的相似性。當使用RT-PCR(未顯示)進行分析時F5F19.21就可表達，且可表現(xiàn)在多元Genbank EST數(shù)據(jù)庫的各登記口。當該蛋白質的含有同源框和亮氨酸拉鏈結構域的N-末端區(qū)域在校準之前被除去(剩下第114-832號各個殘基)時，這些蛋白質之間的同源性仍非常高REV與ATHB-9和ATHB-14具有64％的同一性，與F5F19具有61％的同一性，與ATHB-8具有58％的同一性。對REV蛋白質序列的進一步分析表明，該蛋白質在第432-453殘基含有第二個亮氨酸拉鏈結構。在已知的擬南芥HD-Zip III族各成員中，REV是含有第二個預測的亮氨酸拉鏈的唯一蛋白質。
實施例2REVOLUTA克隆和表達載體已制備了含有從得自擬南芥Columbia(Co)生態(tài)型和Nossen(No〕生態(tài)型的基因組DNA中分離得到的野生型REVOLUTA基因的各種重組DNA克隆。此外，已從各revoluta突變體rey-1、rev-2、rev-3、rev-4、rev-5和rev-6中獲得基因組DNA的各種克隆。revoluta突變體rev-1、rev-2和rev-4存在于No生態(tài)型背景中，rev-3、rev-5和rev-6各突變體存在于Co生態(tài)型背景中。將野生型Columbia RevolutacDNA的各重疊區(qū)域分別克隆到載體中，以進行測序。測序結果發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含不轉的5′序列的大約350個核苷酸、全部的Revoluta編碼區(qū)域和具有不轉譯的3′序列的大約400個核苷酸。該野生型Columbia REV cDNA序列與在Kazusa數(shù)據(jù)庫地址〔www.kazusa.or.jp/arabi/chr5/clone/MUP24/index.html〕中可找到的預測的拼接核苷酸序列是一致的。REVOLUTA從內源啟動子的表達進行PCR從Columbia基因組DNA擴增得到從Revoluta編碼序列(5′不轉譯的DNA)的大約2.8kb上游到初始甲硫氨酸的200bp下游之間的基因組DNA區(qū)域，并將其克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中〔使用的各種PCR引物有正向引物(包括BamHI限制位點)5′TTGGATCCGGGAACACTTAAAGTATAGTGCAATTG3′[SEQ ID NO49]，反向引物5′CAGACTTTGATCTGCTTAGGCTC3′[SEQ ID NO50]〕。對從獨立的各種PCR反應產生的各種克隆進行測序，以證實PCR擴增處理的精確度。選擇使用其序列與擬南芥數(shù)據(jù)庫相匹配的克隆，對內源Revoluta啟動子區(qū)域(SEQ IDNO1的第1-2848位核苷酸)進行克隆，只是在Revoluta編碼序列的5′端大約1.2kb的12Ts鏈上的1T bp被明顯刪除。從No生態(tài)型植株中已分離出含有REVOLUTA的基因組DNA序列的克隆pNO84。含有大約2.6kb的啟動子和上游序列以及0.2kb的REV編碼序列的2.8kb BamHI-Sal1限制性消化的DNA片段已被克隆到克隆pNO84的BamHI和Sal1位點中，以從與其內源啟動子連接的No生態(tài)型產生REVOLUTA基因。為了將3′聚腺苷酸化信號克隆到pNO84 Revoluta基因的3′端上，并使用下述寡核苷酸〔5′引物，包括NotI位點5′TTGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAGACTAATTT3′[SEQ ID NO51]；3′引物，包括ApaI和KpnI位點5′TTGGGCCCGGTACCCTCAACCAACCACATGAC3′[SEQ ID NO52]〕進行聚合酶鏈式反應，擴增起始于接近REV終止密碼子下游長約0.7kb的Revoluta Co基因的3′端。即可將擴增的poly A附加位點DNA片段克隆到REVOLUTA編碼序列3′端pNO84的NotI和ApaI位點上。通過DNA測序證實含有所需的3′poly A附加序列的REVOLUTA表達的各種轉基因。使用KpnI從原始載體中克隆出所得到的含有REV啟動子、編碼區(qū)域和3′區(qū)域的REVOLUTA轉基因，并將其連接到pCGN1547 T-DNA雙重載體上(McBride等人，1990，PlantMol.Biol.，14269-276)。從35S花椰菜花葉病毒啟動子表達REVO采用PCR，使用引物5′AAGGTACCAAGTTCGACGGAGAAGGTGA3′[SEQ IDNO53]和5′AAGGATCCTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG3′[SEQ ID NO54]由pHomer102質粒擴增可編碼大約900bp的35S花椰菜花葉病毒的DNA片段。對含有從獨立PCR反應所擴增的各DNA片段的克隆進行測序，以證實該PCR擴增過程的精確度。各PCR引物中包含了KpnI和BamHI限制位點，可為含有擴增的35S CaMV啟動子的900bp KpnI-BamHI片段的分離作準備。在克隆物pNO84中的REV基因組序列的5′端的KpnI和BamHI位點插入此KpnI-BamHI 35S CaMV片段，以產生在35S CaMV啟動子轉錄起始位點的下游大約70bp連接的NoRevoluta轉基因。采用上述同樣的方法可將該REV基因的3′端放到REV編碼區(qū)域的下游。使用KpnI可將整個35S CaMV Revoluta轉基因克隆到T-DNA雙重載體pCGN1547中。REV反向重復結構使用下列各種引物REVIR-1(TTATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAAT[SEQID NO138])和REVIR-2(TTGCGGCCGCCTG-ACAAGCCATACCAGCAA[SEQ IDNO139])；REVIR-3(TTGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGC-AATGG[SEQ IDNO140])和REVIR-4(TTGCATGCGCTAGCGTCGTCGCTTCCAAGTGAAT[SEQID NO141])；REVIR-5(TTGTCGACCCGCGGAGCTTTGCTTATCCGGGAAT[SEQID NO142])和REVIR-6(TTGATGCGCTAGCCTGACAAGCCATACCAGCAA[SEQID NO143])來擴增REV cDNA。這些PCR產物以1/2、3/4然后5/6的順序被克隆在CaMV 35S啟動子之后，然后再被克隆到pCGN1547中。所有這些IR引物在其末端都具有限制性位點。REVIR-1和REVIR5對應于第5496-6615堿基對(在外顯子12中)，REVIR-2和REVIR-6對應于第6226-6245bp(在外顯子15中)。連接的序列由對應于第6268-6288bp(在外顯子15中)的REVIR-3和對應于第6509-6528bp(在外顯子16)的REVIR-4的產物形成。因此，該結構含有CLAI限制位點5496-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6245；NOTI限制位點6268-6388、6477-6528；NHEI SPHI限制位點6245-6051、5968-5834、5748-5668、5582-5496；SACII限制位點(SEQ ID NO144)。
基本上如上述制備各種附加的反向重復結構，該結構包括從含有外顯子3-7、3670-3743的At REV、3822-3912、4004-4099、4187-4300和4383-4466(SEQ IDNO145)、外顯子15(SEQ ID NO146)和SEQ ID NO147的連接物制得的反向重復結構。同樣，從含有SEQ ID NO148和SEQ ID NO150的蕃茄REV可制得具有SEQ ID NO149的連接物的反向重復結構。從稻米可制得一些反向重復結構，包括從含有SEQ ID NO151和SEQ ID NO153的稻米Rev1制得的具有SEQ IDNO152的連接物的反向重復結構，和從含有SEQ ID NO154和SEQ ID NO156的稻米Rev2制得的具有SEQ ID NO155連接物的反向重復結構。
實施例3使用REVOUTA轉基因對revoluta突變體的互補用上述各種構建物轉化農桿菌屬菌株At503，并使其與從rev-1和野生型Nossen的2-3周齡籽苗育成的根外植體一起培育(Valvekens等人，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855536-5540)。通過比較轉化植株與沒有轉化的rev突變體植株，分析由這種組織再生的植株的rev表型的互補?；蛘撸墒褂弥仓昊铙w(in planta)轉化產生表達Revoluta轉基因的擬南芥植株(Betchtold等人，1998，Methods Mol.BioL，82259-266)。使用不與內源Revoluta mRNA明顯雜交的Revoluta轉基因特異性雜交探針進行Northem印跡雜交試驗，測定各轉基因的基因表達?；蛘?，在分離的mRNA樣品上進行反向轉錄酶反應，然后使用從該反向轉錄酶反應獲得的拷貝DNA進行PCR，從而測定Revoluta基因的表達〔參見“PCR策略”，M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky編輯，1995，Academic Press，San Diego，CA(第14章)；“PCR方案方法和應用指南”，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White編輯，Academic Press，NY(1990)〕。PCR擴增產物的量反映了植物中的Revoluta基因在收集該組織制備mRNA樣品時的表達水平。rev-1突變體的部分互補我們通過將含有野生型編碼區(qū)域的構建物轉化到純化rev-1植株中，確定了由MUP24.4編碼的HD-Zip蛋白是REV基因的產物。在6個5′REV結構轉化的多產的T2系列中有一個被發(fā)現(xiàn)有部分互補。圖5A顯示了兩株T2 rev-1植株，一株僅由載體轉化(左)，另一株則由5′REV結構轉化(右)。相對于由載體轉化的rev-1對照植析，由5′REV結構轉化的植sri在主要花序上的莖生葉的葉腋中側生芽的數(shù)量增加。相對于rev-1對照，它們還具有較狹小的葉柄，以及較小的、后卷較差的葉子。另外，此轉化系中的花如野生型的花一樣，小于rev-1對照植株的花(圖5B和5C)。這些結果一起支持了HD-Zip編碼區(qū)域是REV基因的結論，但也提出了由于沒有植株與花椰菜花葉病毒35S啟動子-Revoluta結構的互補，可能需要特殊的表達模式補償rev-1突變過程。具有反向重復轉基因對REV的抑制將反義RNA和反向重復基因導入一些野生型有機體中，其結果顯示，在大多數(shù)系統(tǒng)中它們可干擾正常的基因功能(Sharp和Zamore的綜述，2000)。最近，Waterhouse等人(1998)指出，在普遍存在的啟動子的控制下，用含有野生型基因的反向重復子的結構的野生型植株的轉化過程可誘導使內源基因沉默。這些結果已由Chuang和Meyerowitz(2000)證實。因此，為了進一步證實關于所鑒定的HD-Zip蛋白質就是REV基因的結論，我們在CaMV 35S啟動子的控制下將此ORF的反向復制結構轉化到野生型Columbia植株中，并測定Rev表型的誘導過程。在所檢測的16例獨立轉化的植株中，有5例顯示出具有與由弱等位基因rev-3和rev-5賦予的強度類似或較小的Rev表型。具體而言，與野生型Columbia植株(圖5D和H)相比，這些植株(如rev突變體植株)具有大量的空的葉腋(圖5E-H)。圖5H示出了對照Columbia植株(右)和含有該反向重復結構的Rev-樣植株(左)。
實施例4REV mRNA在增殖和不分裂組織中的表達原位雜交如http//www/arabidopsis/org/cshl-course/5-in_situ.html/中所述進行非放射性原位雜交。使用引物REVcentral-1(GGAGCCTTGAAGTTTTCACTATG[SEQ IDNO175])和REVcentral-2(AGGCTGCCTTCCTAATCCAT[SEQ ID NO176])或REV3′-1(TGAGGAGCGTGATCTCATCAG[SEQ ID NO177])和REV3′-2(CAAAATTATCACATCATTCCCTTT[SEQ ID NO178])，由上述cDNA擴增REV的455bp的中心部分或其3′端的779bp部分，并將擴增產物克隆到Topo II載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。中心REV探針用于圖7中的A-L、N-O，3′REV探針用于P-Q。使用FIL-1(CGTCTATGTCCTCCCCTTCC[SEQ ID NO179])和FIL-2(AACGTTAGCAGCTGCAGGA[SEQ ID NO180])由cDNA擴增662bp的FIL，并將其克隆到Topo II載體中。使用引物H4-1(TGGAAAGGGAGGAAAAGGTT[SEQID NO181])和H4-2(GCCGAATCCGTAAAGAGTCC[SEQ ID NO182])從cDNA擴增Histone H4，并將其克隆到Topo II載體中。使用試劑盒(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)并根據(jù)其方案產生一組有義和反義探針。使用Nikon Coolpix數(shù)碼相機在Nikon Microphot上制成一組圖象，并將所得影象輸入Adobe Photoshop4.01中。
為了測定不同組織中REV表達的水平，使用從該REV基因得到的一組引物，用從3-4周齡植株(幼小莖生葉、幼小簇狀葉)和6-7周齡植株(芽、花、莖、老的莖生葉、老的簇生葉)分離得到的RNA進行半定量RT-PCR。同時使用從肌動蛋白基因(ACT2；登記號碼ATU41998)得到的一組引物進行一系列對照反應。
采用RT-PCR對從各種植物組織制得的cDNA同時進行REV和ACT2的擴增。對所得的產物進行印跡，并用它們各自的基因進行探測。使用Phosphorimager檢測系統(tǒng)對印跡點定量，然后用NIH Image(1.60)分析。使用ACT2水平計在加樣差異方面對REV水平進行校正。對于這兩種基因，基因組序列的擴增產生的片段大于使用相同的一組引物從cDNA擴增得到的片段預期是由于缺乏一組intronic序列所致。從重復的實驗中也得到類似的結果。各泳道的組織來源如下(A)芽、(B)花、(C)莖、(D)3-4周齡植株的幼小莖生葉、(E)6-7周齡植株的老莖生葉、(F)3-4周齡幼齡簇生葉、(G)6-7周齡老齡簇生葉、(H)沒有cNDA的對照，(I)0.005ng基因組(c)DNA、(J)0.05ng基因組DNA、(K)0.5ng基因組DNA、(L)5ng基因組DNA。
進行PCR擴增后，對各所得反應產物用它們各自的基因進行印跡和探測。經歸一化為ACT2信號后的REV信號定量的強度表明了在所有受試的組織中都可檢測到REV mRNA，如圖6中所示。但是，REV mRNA的量在花和芽中最豐富(圖6，泳道A和B)。莖和幼小的莖生葉中REV mRNA的量下降了約兩倍(泳道C和D)，并在老的莖生葉和簇生葉中進一步下降(泳道E、F和G)。
使用REV反義探針進行的原位雜交試驗所獲得的結果與使用RT-PCR試驗的結果一致，該結果顯示圖7中。在頂端和整個植株中細胞分裂活躍的區(qū)域，該REVmRNA最豐富(圖7A-L)。REV在野生型花序的分生組織中表達，并且它在花的原基中的表達增加(圖7A-C)。在花的分生組織中，相對圍繞花組織的器官，萼片、雄蕊和心皮原基中的REV mRNA濃度增加(圖7C-D和7F-I)。但是，REV的表達在晚期花的萼片中下降，而在此階段的發(fā)育中的心皮和雄蕊的表達仍維持強度(圖7A、C和F)。REV mRNA在輔助分生組織中的量也是豐富的(圖7A)。在莖生葉中同時檢測到了兩個梯度的表達，一個沿著葉子的近端向遠端下降，另一個沿著葉子的近軸端向遠軸端減少(圖7E)。在早期的胚胎中可檢測到REV mRNA(圖7K)，并且在胚胎發(fā)生的整個細胞分裂階段以及在胚乳中可持續(xù)檢測到高水平REVmRNA(圖7L和J)。最后，在莖的成熟的不分裂組織中，尤其在皮層和脈管區(qū)域中可檢測到REV mRNA(圖7P)。與野生型莖(圖7S)相比較，這種表達模式與在rev-1莖的皮層中(圖7R)發(fā)現(xiàn)的細胞層的數(shù)量增加有關。顯示S-階段細胞改變模式的Rev-1突變體植株histone H4基因僅在活躍分裂的細胞和進行核內復制的細胞中轉錄。因而，可使用histone H4 mRNA作為細胞周期活性的標記物。為了更好理解REV基因影響發(fā)育中植株的細胞分裂模式，在野生型和rev-1突變體植株中進行了histone H4mRNA的原位雜交。如圖8A和8B所示，rev-1突變體植株中表達H4 mRNA的細胞的數(shù)量相對于野生型植株有所增加。這在莖生葉的近軸端和莖中特別明顯，這兩個區(qū)域都是rev突變體過度生長的區(qū)域。這種明顯局限在rev莖生葉的近軸端區(qū)域的細胞分裂可影響整個葉子的長度。在腋的近端增厚區(qū)域，rev-1突變體(圖8D)中的細胞分裂簇相對于野生型植株(圖8C)更常見。
實施例5REV雙重突變體FIL在rev突變體中的正確表達REV雙重突變體如Talbert等人(1995)所述獲得lfy REV雙重突變體。簡言之，從rev-1 X lfy-6/+雜交得到的各種REV F2個體，都是可用于測試lfy rev F3的雙重突變體的分離現(xiàn)象的子代。因為rev和lfy緊密連接，所以要進行PCR測試假定的lfy-6 rev-1植株，以證實lfy突變的存在。所使用的各種lfy-6 CAPS標記物可設計成可利用單個堿基對改變以引起lfy-6的突變第32個密碼子上的CAA變成UAA。引物是AACGAGAGCATTGGTTCAAG[SEQ ID NO183]和CAACGAAAGATATGAGAGAG[SEQ ID NO184]。使用MaeIII剪切所得的PCR產物，可從野生型基因辨別lfy-6突變體。將純合的rev-1植株的與雜合的fil-1植株的花粉進行雜交可得到rev fil突變體。將雜合后代與rev-1花粉雜交，就可鑒定olant純合植株的rev-1和fil-1。
掃描電子顯微鏡檢查用3％戊二醛的0.02M、pH7.0的磷酸鈉溶液固定樣品，真空浸潤15-30分鐘，然后4℃保存16小時或以上。將樣品放到1％四氧化鋨(Polyscience，Warrington，PA)中2-4小時再用乙醇體系進行脫水。使用Denton DCP-1 Critical Point DryingApparatus(Denton Vacuum Inc.，Moorestown，NJ)對樣品干燥處理。將樣品固定于與SEM的樣品載片連接的導電碳墊上，并用Au/Pd涂覆。使用Jeol JSM-840A型掃描顯微鏡。使用Polaroid 55型膠片成象，然后掃描并輸入Adobe Photoshop 4.01。
在各種fil突變體中，在野生型植株中花形成較早，由于莖生葉的基底明顯缺少分生組織的形成的緣故導致沒有形成第三級幼芽，并且花顯示出異常的數(shù)目、形狀和花器的排列。此外，嚴重的fil等位基因有時可形成無花的花梗，或者在它們的遠端形成與rev植株中形成的花絲(Chen等人，1999；Sawa等人，1999)類似的具有單一萼片結構的花梗。在fil rev雙重突變體中，初級花序嚴重縮短，所有的花原基出現(xiàn)與無花花梗一樣的結局。這些結構，如野生型花上的花梗，都是平滑的。但是，因為所有的花原基都成為無花花梗，一度曾認為，REV和FIL是在促進花原基中花的形成方面的局部性多余的功能(Chen等人，1999)。
這種強烈的雙重突變體表型可能有助于確定FIL mRNA在rev植株中的表達。在野生型植株中，F(xiàn)IL mRNA在整個SAM中的表達是微弱的，但由于花的分生組織與SAM截然不同，因而FIL在該分生組織遠端側的表達增加(Siegfried等人，1999)。FIL在rev-1組織中的部位與野生型對照并無區(qū)別，這表明rev基因產物的損壞沒有影響FIL的表達(圖7E-I)。
具有其它突變的rev的相互作用為了充分地理解花分生組織中的REV活性，我們培育了一些rev-1 lfy-6雙重突變體植株。LFY功能是正確鑒定花分生組織的性狀所需要的。如圖9所示，lfy rev雙重突變體如rev fil雙重突變體，是具有終端形成束狀花絲結構的單一花序的短小植株。與rev fil雙重突變體中形成的通常平滑和類似無花花梗的花絲結構(圖9B、F和G)不同，在rev lfy雙重突變體上形成的花絲結構是從根部向頂端由平滑變成毛糙，并且是具有星形毛狀體的葉子樣結構(圖9A、E、H-I)也有些是心皮樣結構。在各花絲的基部可以看到鱗狀結構(圖9H和I)，可能是退化的襯托器官(Long和Barton，2000)。此外，rev lfy雙重突變體通常在第一片莖生葉的對側具有一個或多個莖部的絲狀附器(圖9A和C)。該附器與通常在rev單突變體的軸中檢測到的結構(圖9D)類似。與fil rev雙重突變體一樣，lfy rev雙重突變體表明了REV具有維護花的分生組織的作用。
與LFY一致，需要有APETALA 1來建立花分生組織。植株發(fā)育過程中LFY或AP1的異位表達可導致早熟花的形成〔Weigel和Nilsson(1995)，Nature，377，495；Mandel和Yanofsky(1995)，Nature，377522)。AP1在第一和第二輪生體中的萼片和花瓣器官的身份確定中起輔助性作用。尤其是，在ap1-1突變體中，萼片被轉化成莖生葉或苞葉樣結構，花瓣由于缺乏而無法引發(fā)。此外，花分生組織在莖生葉樣萼片的軸中被部分或完全轉化成花序分生組織，導致高度分支結構的產生(Bowman，1993，Dev 119，721-743，圖9)。與rev lfy雙重突變體不同，rev-1ap1-1雙重突變體可產生具有預期來自各自單一突變體表型的花的各種缺陷的正常大小的花序(圖9)。rev-1 ap1-1突變體的花與單一的ap1-1突變體的花類似(圖91)。雖然rev-1 ap1-1突變體的這種表型是附加的，但是rev-1突變體的附屬分生組織的缺乏，對于ap1-1突變體的附屬分生組織數(shù)量的增加是一種上位關系，這導致產生了無分支的結構(圖9)。
AGAMOUS是調節(jié)花器性狀的另一種多功能基因，它是確定花的生長所需要的。在ag-1突變體中，在第三輪生體花瓣的發(fā)育替代了雄蕊，在第四輪生體新的花萌發(fā)面替代心皮。rev-1 ag-1突變體的表型可加上與rev-1植株一樣的產生擴大的花瓣的雙在突變體花，但是，與ag-1一樣在第三輪生體上具有花瓣(圖9)。同樣，rev-1 ag-1雙重突變體的花與ag-1單突變體的花一樣，在第四輪生體上重復出現(xiàn)花的發(fā)育。
CLAVATA基因控制著頂端分生組織的大小。喪失clv功能的突變體由于未分化干細胞在頂端分生組織的中心區(qū)域聚集，而具有擴大的頂端分生組織。強的clv1-4突變體也由于額外的心皮的存在而具有三葉草花形種籽莢。clv1-4 rev-1雙重突變體表型是協(xié)調的，因為在它們花蕾內有大量過度生長的結構。這些愈傷組織樣的組織竟然會繼續(xù)生長而從種籽莢中爆裂出來。這一結果與REV限制的花組織(如該雙重突變體表型所顯示)中細胞分裂的作用相同，這類組織由于雙重突變體表型而顯示CLV1有部分過剩。
實施例6從其它植物物種中鑒別和分離REVOLUTA本發(fā)明的一個實施例提供了一種對各種REVOLUTA基因和蛋白質在分離它們的各種植物中所起的細胞分裂調節(jié)物功能的鑒別和使用方法。結合使用“序列類似性試驗”和REVOLUTA“基因功能試驗”來分離與擬南芥REVOLUTA基因直向同源的各種REVOLUTA基因。首先，采用聚合酶鏈式反應，使用擴增各種亞族III HD-Zip多核苷酸的“CODEHOP”PCR引物(Rose等人，1998，Nucleic AcidsRes.，261628-1635)從靶植株DNA中分離出候選的REVOLUTA基因序列，例如維持在基因庫中的基因組DNA或DNA。然后對擴增的DNA進行測序，以確定該PCR產物對蛋白質一個區(qū)的編碼，該編碼的區(qū)與對應于該PCR擴增區(qū)域的擬南芥REVOLUTA蛋白質序列至少具有約70％的同一性、更佳至少約為75％的同一性、最佳至少約為80％的同一性。然后使用從候選REVOLUTA編碼序列得到的多核苷酸區(qū)進行“基因功能試驗”，該編碼序列已被轉移到植株轉化載體中，并被轉化回從中產生該候選REVOLUTA基因的植物物種中。實際的REVOLUTA基因是那些當REVOLUTA轉基因在轉化的植株中表達時可調節(jié)細胞分裂的基因。
HD-ZipIII亞族PCR引物的鑒別為了產生HD-ZipIII亞族CODEHOP引物，使已知的HD-ZipIII氨基酸序列輸入位于Hutchinson Cancer Research Center websitehttp//blocks/fhcrc.org中的信息編組(blockmaker)程序中。該程序相當于序列，并可產生保存在不同蛋白質之間的同源信息組。表8列出了從六個HD-ZipIII族成員中制得的HD-ZipIII氨基酸信息組。
表8使用Fred Hutchinson Cancer Research Center“block”計算機程序鑒別HD-ZipIII氨基酸信息組HD-ZiP信息組 氨基酸序列HD-ZiP蛋白質HD-ZipIII信息組A(信息組寬度＝43)REVOLUTA124 GKYVRYTAEQVEALERVYAECPKPSSLRRQQLIRECSILANIESEQ ID No.2Athb-14 24 GKYVRYTPEQVEALERVYTECPKPSSLRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.55Athb-8 14 GKYVRYTPEQVEALERLYNDCPKPSSMRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.56Athb-9 20 GKYVRYTPEQVEALERVYAECPKPSSLRRQQLIRECPILCNIESEQ ID No.57CRHB1 19 GKYVRYTSEQVQALEKLYCECPKPTLLQRQQLIRECSILRNVDSEQ ID No.58F5F 19.21 16 GKYVRYTPEQVEALERLYHDCPKPSSIRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.59HD-ZipIII信息組B信息組寬度＝42REVOLUTA70 IKVWFQNRRCRDKQRKEASRLQSVNRKLSAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.2Athb-14 70 IKVWFQNRRCREKQRKEAARLQTVNRKLNAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.55Athb-8 60 IKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAVNRKLTAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.56Athb-9 66 IKVWFQNRRCREKQRKESARLQTVNRKLSAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.57CRHB1 65 IKVWFQNRRCREKQRKEWCRLQSLNGKLTPINTMLMEENVQLSEQ ID No.58F5F19.2162 IKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAVNRKLTAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.59HD-ZipIII.信息組C信息組寬度＝29REVOLUTA154 SPAGLLSIAEETLAEFLSKATGTAVDWVQSEQ ID No.2Athb-14 167 NPAGLLSIAEEALAEFLSKATGTAVDWVQSEQ ID No.55Athb-8 153 SPAGLLSIADETLTEFISKATGTAVEWVQSEQ ID No.56Athb-9 163 NPANLLSIAEETLAEFLCKATGTAVDWVQSEQ ID No.57CRHB1 109 HVAQLVTINHALRRQLSSTPSHFRFPTVSSEQ ID No.58F5F19.21154 SPAGLLSIAEETLAEFLSKATGTAVEWVQSEQ ID No.59HD-ZipIII信息組D信息組寬度＝31REVOLUTA 446 VLCAKASMLLQNVPPAVLIRFLREHRSEWADSEQ ID No.2Athb-14 464 VLCAKASMLLQNVPPAVLVRFLREHRSEWADSEQ ID No.55Athb-8452 VLCAKASMLLQNVPPSILLRFLREHRQEWADSEQ ID No.56Athb-9460 VLCAKASMLLQNVPPLVLIRFLREHRAEWADSEQ ID No.57CRHB1 138 LMNIYAIVRLQHVPIPECRS2XXXXXXXXXXXSEQ ID No.58F5F19.21 453 VLCAKASMLLQNVPPAILLRFLREHRSEWADSEQ ID No591此數(shù)值表明使用在所提及的SEQ ID數(shù)值中公開的各蛋白質序列中的氨基酸數(shù)值的各信息組中第一氨基酸的氨基酸位置；2X指在最佳的計算機排列中沒有發(fā)現(xiàn)相應的氨基酸。
通過使用吉布斯算法或基元算法將表8中的HD-ZipIII“信息組”序列數(shù)據(jù)輸入CODEHOP程序中，用HD-ZipIII“信息組”氨基酸序列設計HD-ZipIII族PCR引物。通過選擇具體的植物物種(在本實施例中是稻米)進一步精選PCR引物輸出，其中所挑選的PCR引物對于根據(jù)為稻米編碼的優(yōu)選使用的密碼子的這些具體的植物具有偏好(也可使用CODEHOP程序選擇其它植物偏好的密碼子)。表9列出一組可使用CODEHOP程序編制以擴增來自稻米、大麥和玉米的HD-ZipIIIPCR基因的各種可能的CODEHOP HD-ZipIII PCR引物。
表9使用Fred Hutchinson Cancer Research Center“CODEHOP”計算機程序設計的HD-ZipIII PCR引物HD-Zip信息組 寡核苷酸序列1HD-ZipIII信息組A正向稻米 A1F 5′-GGCGGCAGCAGCTGathmgngartg-3′SEQ ID No.60 R Q Q L I R E CDegen2＝48，temp3＝62.4稻米 A2F 5′-GGAGAGGGTGTACTGCGAGtgyccnaarcc-3′SEQ ID No.61 E R V Y C E C P K PDegen＝16，temp＝62.2 rice A2稻米 A3F 5′-TGCGGTACACCCCCgarcargtnea-3′SEQ ID No.62 R Y T P E Q V EDegen＝32，temp＝63.3稻米 A4F 5′-TGCGGTACACCCCCGArcargtnsarg-3′SEQ ID No.63 R Y T P E Q V E ADegen＝64，temp＝63.3稻米 A5F 5′-CGGTACACCCCCGAGcargtnsargc-3′SEQ ID No.64 R Y T P E Q V E ADegen＝32，temp＝64.2稻米 A6F 5′-TGGAGAGGGTGTACTGCgantgyccnaa-3′SEQ ID No.65 E R V Y C E C P K
Degen＝32，temp＝60.4稻米 A7F 5′-TGGAGAGGGTGTACTGCGAntgyccnaarc-3′SEQ ID No.66E R V Y C E C P K PDegen＝64，temp＝60.4稻米 A8F 5′-CCGACCTCCATGCGGmgncarcaryt-3′SEQ ID No.67P S S L R R Q Q LDegen＝64 temp＝60.8稻米 A9F 5′-CCATGCGGCGGcarcarytnat-3 ′SEQ ID No.68L R R Q Q L IDegen＝32，temp＝62.4HD-ZipIII信息組A反向稻米 A1R 5′-CGGGGGTGTACCGCacrtayttncc-3′SEQ ID No.69Degen＝16，temp＝62.1與下列序列互補4G K Y V R Y T P EccnttyatrcaCGCCATGTGGGGGC稻米 A2R 5′-CTGCTCGGGGGTGTACcknacrtaytt-3′SEQ ID No.70Degen＝32，temp＝60.1與下列序列互補K Y V R Y T P E QttyatrcankcCATGTGGGGGCTCGTC稻米 A3R 5′-ACCTGCTCGGGGTGtancknacrta-3′SEQ ID No.71
Degen＝64，temp＝60.1與下列序列互補Y V R Y T P E Q VatrcankcnatGTGGGGGCTCGTCCA稻米 A4R 5′-CCACCTGCTCGGGGgtrtancknac-3′SEQ ID No.72Degen＝64，temp＝63.2與下列序列互補V R Y T P E Q V EcankcnatrtgGGGGCTCGTCCACC稻米 A5R 5′-CACCCTCTCCAGGGCCtsnacytgytc-3′SEQ ID No.73Degen＝32，temp＝61.2與下列序列互補E Q V E A L E R VctygtycanatCCGGGACCTCTCCCAC稻米 A6R 5′-CAGTACACCCTCTCCAGGGcytsnacytgyt-3′SEQ ID No.74Degen＝64 temp＝62.0與下列序列互補Q V E A L E R V Y CtygtycanstycGGGACCTCTCCCACATGAC稻米 A7R 5′-CAGTACACCCTCTCCAGGgcytsnacytg-3′SEQ ID No.75Degen＝32，temp＝62.0與下列序列互補Q V E A L E R V Y CgtycanatycgGGACCTCTCCCACATGACHD-ZipIII信息組B正向稻米 B1F 5′-CCATGAACAAGATGCTGatggargaraa-3′SEQ ID No.76M N K M L M E E N
Degen＝4，temp＝63.3稻米 B2F 5′-CGGCTGCAGACCGTGaayvgnaaryt-3′SEQ ID No.77R L Q S V N R K LDegen＝96，temp＝63.3稻米 B3F 5′-GACCGCCATGAACAAGATGytnatggarga-3′SEQ ID No.78T A M N K M L M E EDegen＝16，temp＝60.1稻米 B4F 5′-CCGCCATGAACAAGATGCTnatggargara-3′SEQ ID No.79A M N K M L M E E NDegen＝16，temp＝62.2稻米 B5F 5′-CCATGAACAAGATGCTGATggargaraayg-3′SEQ ID No.80M N K M L M E E N DDegen＝8，temp＝63.3HD-ZipIII信息組B反向稻米B1R 5′-CGGCCCGCCGGttytgraacca-3′SEQ ID No.81Degen＝4，temp＝64.2與下列序列互補W F Q N R R C RaccaargtyttGGCCGCCACGGC稻米 B2R 5′-ATCTGGTTCATGGCGGTCaryttncbrtt-3′SEQ ID No.82Degen＝96，temp＝60.1與下列序列互補N R K L T A M N K M
ttrbcnttyraCTGGCGGTACTTGTTCTA稻米 B3R5′-CGCCGGTTCTGGaaccanacytt-3 ′SEQ ID No.83degen＝8，temp＝64.3與下列序列互補K V W F Q N R RttycanaccaaGGTCTTGGCCGC箱米 B4R5′-GCACCGCCGGTTCtgraaccanac-3′SEQ ID No.84degen＝8，temp＝61.0與下列序列互補V W F Q N R R CcanaccaargtCTTGGCCGCCACGHD-ZipIII信息組D正向稻米 D1F5′-CCAAGGCCACCATGCTGytncarmaygt-3′SEQ ID No.85 K A S M L L Q N VDegen＝64，temp＝62.3稻米 D2F5′-AAGGCCACCATGCTGCTncarmaygtnc-3′SEQ ID No.86 K A S M L L Q N V PDegen＝128，temp＝60.4稻米 D3F5′-CCACCATGCTGCTGcarmaygtncc-3′SEQ ID No.87 S M L L Q N V PDegen＝32，temp＝60.1稻米D4F5′-CCCGTCTGCATCCGGttyytnmgnga-3′SEQ ID No.88 A V C I R F L R EDegen＝128，temp＝63.1稻米 D5F 5′-CCGTCTGCATCCGGTTCytnmgngarca-3′SEQ ID No.89 V C I R F L R E HDegen＝128，temp＝61.2稻米 D6F 5′-GTCTGCATCCGGTTCCTGmgngarcaymg-3.′SEQ ID No.90 V C I R F L R E H RDegen＝64，temp＝60.2稻米 D7F 5′-TGCGGGAGCACCGGnvngartgggc-3′SEQ ID No.91 R E H R S E W ADegen＝96，temp＝62.9稻米 D8F 5′-GCGGGAGCACCGGTCngartgggcng-3′SEQ ID No.92 R E H R S E W A DDegen＝32，temp＝62.6稻米 D9F 5′-GGAGCACCGGTCGgartgggcnga-3′SEQ ID No.93 E H R S E W A DDegen＝8，temp＝60.3HD-ZipIII信息組D反向稻米 D1R 5′-GACGGGCGGCggnacrtkytg-3′SEQ ID No.94Degen＝32，temp＝60.4與下列序列互補Q N V P P A VgtyktrcanggCGGCGGGCAG稻米D2R 5′-GACGGGCGGCGgnacrtkytgna-3′SEQ ID No.95Degen＝128，temp＝60.4與下列序列互補Q N V P P A VangtyktrcangGCGGCGGGCAG稻米 D3R 5′-CACTCCGACCGGTGCtcncknarraa-3′SEQ ID No.96Degen＝128，temp＝61.5與下列序列互補F L R E H R S E WaarrankcnctCGTGGCCAGCCTCAC1第一行顯示CODEHOP設計的引物的寡核苷酸序列。CODEHOP所使用的簡化核苷酸字母表是A→A，C→C，G→G，T→T，R→AG，Y→CT，M→AC，K→GT，W→AT，S→CG，B→CGT，D→AGT，H→ACT，V→ACG，N→ACGT。第二行顯示由所有多余的引物編碼的氨基酸序列。
2“Degen”指編碼指定氨基酸序列的引物組合中簡并的寡核苷酸數(shù)。
3“Temp”指簡并寡核苷酸引物組合的平均熔點溫度。
4“與下列序列互補”指指定反向寡核苷酸與之互補的HD-Zip氨基酸信息組，即HD-Zip信息組肽編碼鏈序列區(qū)域。
通過改變表9中列出的各種引物的序列可以選擇其它各種HD-ZipIII PCR引物，以反映靶植物種類的適當?shù)拿艽a子使用偏好。但是，如下面所示，特異地為稻米設計的各種CODEHOP HD-ZipIII引物也能擴增來自單子葉植物玉米和大麥的HD-Zip片段。
單子葉植物HD-Zip克隆的分離使用選自表9的CODEHOP引物稻米A2F[SEQ IDNO71]和稻米B2R[SEQIO81]或稻米A2F和稻米B2R[SEQ ID NO82]來鑒別單子葉植物的各種HD-ZipIII同源物。這些引物在20μL的使用2單位Amplitaq Gold(perkin Elmer)的PCR反應中使用，所用的緩沖液為2mM MgCl2、0.2mM dNTPs，各引物使用0.5μM。用于PCR的各種模板DNA有1.5μL稻米(Oryza sativa L.indicamvar.IR36)cDNA庫(Stratagene FL1041b)；1.5μL純化基因組的稻米(Oryzasativa)DNA(大約400ng)；1.5μL純化基因組的大麥(Hordeum vulgare)DNA(大約400ng)；1.5μL純化基因組的玉米(Zea may)DNA(大約400ng)。PCR條件包括95℃培育9分鐘，繼以95℃(30秒)、60-55℃(30秒)，共5輪，后一溫度每輪下降1℃；72℃(2分鐘)；然后95℃(30秒)、55℃(30秒)共35輪；和72℃(2分鐘)。所得的各種PCR DNA產物進行凝膠電泳分析，然后從TAE緩沖液中的0.8％低熔點瓊脂糖凝膠(SeaPlaque，F(xiàn)MC Bioproducts，Rockland，ME)上切下，用PCR凈化試劑盒(Promega)純化。將各DNA片段克隆到TOPO II載體試劑盒(Invitrogen)中。使用旋轉微量制備試劑盒(Qiagen)從細菌細胞中純化DNA，并使用BIG染料(Applied Biosystems)測序。稻米、玉米和大麥的DNA和蛋白質序列分別公開在SEQID NO97-126中。
使用Altschul等人(1997)的BLAST2計算機程序對擴增的單子葉各種序列和擬南芥REVOLUTA中對應的蛋白質區(qū)域進行比較。使用國立衛(wèi)生研究所網頁位置http//www.ncbi.nim.gov/gorf/wblast2.cgi上的BLAST2.0.9版本進行計算機輔助的序列比較。各擴增的序列與擬南芥REVOLUTA蛋白質具有高度的氨基酸序列同一性或相似性(約79-88％的氨基酸同一性和約87-97％的氨基酸相似性)。這些數(shù)據(jù)證明，可使用表9中公開的可編碼與擬南芥蛋白質的相應氨基酸區(qū)域[SEQ IDNO2]具有高，序列同源性的肽區(qū)域的HD-Zip CODEHOP引物，從遠緣關系的各種單子葉植物中分離出基因。
REVOLUTA功能實驗使用上述各種方法分離的植物基因，就可進行Revoluta功能檢測。通過使用表9所列的正向和反向HD-Zip信息組的各種PCR引物組合，將所擴增的各種多核苷酸序列克隆到各種植物轉化載體中，從而進行功能測試以鑒別實際的Revoluta基因。使用先前提出的基因抑制策略中的一個，如通過制備反向重復轉基因或反義轉基因，使假定的Revoluta序列在植物轉化載體中定向。檢測各種再生的轉基因植物，比較各種組織中含有的細胞的數(shù)量與未轉化的植株的對應組織中的細胞數(shù)量。經含有本發(fā)明Revoluta基因的各種抑制性轉基因轉化的植株，在其組織的代表性橫截面區(qū)域內的細胞數(shù)量，具有統(tǒng)計學上的顯著改變?；蛘?，各種植物器官如葉子和芽的大小也與Taylor等人(1995)對擬南芥描述的明顯不同。
或者，通過在PCR中使用例如素或放射性標記的核苷酸，使用表9中列出的各種正向和反向HD-Zip CODEHOP PCR引物來擴增標記的DNA序列。然后用該標記的HD-ZipIII序列經由核酸雜交篩選cDNA或基因組植物克隆庫。然后分離出與標記的PCR所擴增的各種HD-Zip序列正向雜交的克隆物，并通過DNA測序表征的各種DNA插入子，以鑒別HD-ZipIII的編碼和非編碼序列。然后經活體外操作該分離的HD-ZipIII基因的一些區(qū)域，以構建基因抑制性轉基因，然后在轉基因植物中檢測該轉基因，以鑒定具有與REVOLUTA相同的功能即可調節(jié)細胞分裂的功能的各種HD-ZipIII基因。
從蕃茄中鑒別和分離REVOLUTA使用由上述Codehops程序產生的各種引物來鑒定蕃茄REV基因。如上述實施例1所述從50mg幼番茄(Lycopersicam esculantum)葉中分離出基因組DNA。使用實施例3中所述的條件進行PCR，擴增1微升的DNA。使用下列引物稻米A2F，GGAGAGGGTGTACTGCGAGTGYCCNAARCC[SEQ ID NO61]和蕃茄J1R，CAGCAGAATAAGCATCAACATTATAATCNGCCCAYT[SEQ ID NO162]。給產物測序，鑒別出可編碼與Rev-1蛋白質具有84％同一性和94％相似性的蛋白質的基因組克隆(SEQ ID NO163)。該蕃茄Rev蛋白質顯示的編碼區(qū)域和氨基酸序列分別是SEQ ID NO164和SEQ ID NO165。
進一步的分析顯示，在蕃茄REV和其它擬南芥HD-ZipIII族成員之間的氨基酸水平具有明顯的同一性(見表10)。
表10蕃茄REV
然后測試蕃茄REV，結果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
從稻米中鑒別和分離REVOLUTA稻米REV1.
將從基本上如上述分離的稻米(Oryza)葉DNA或從庫中得到的cDNA(Stratagene FL1041b)基本如上述用作PCR的模板。對稻米基因組DNA REV1克隆使用下列引物TG-cDNA，GTRAGTGCCCCATACTTGCT[SEQ ID NO165]；R25AS-J，GCCGTTCACGGCSTCRTTRAANCC[SEQ ID NO166]。為了分出REV1cDNA的5′末端，使用到下列各種引物對克隆載體R225特異性的引物，CGACGACTCCTGGAGTCCGTCAG[SEQ ID NO167]；和在該基因的編碼區(qū)的引物，TGTATCATTTGCCAGCGGAG[SEQ ID NO168]。在SEQ ID NO169(基因組)和SEQ ID NO170(cDNA)中發(fā)現(xiàn)稻米Rev1基因的核酸序列。稻米Rev1的氨基酸序列展示在SEQ ID NO171中。然后測試該稻米Rev1，測試結果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
稻米REV2使用上述稻米cDNA作為實施PCR的模板，在此PCR中使用的寡核苷酸如下稻米A2f[SEQ ID NO71]，GGAGAGGGTGTACTGCGAGTGYCCNAARCC；R10AS-K[SEQ ID NO]，GCAGCAGCATGGAGGCYTTNGCRCA。
基本上如上述進行PCR，以分離出稻米Rev2的cDNA。在SEQ ID NO172上展現(xiàn)了稻米Rev2的核酸序列。在SEQ ID NO173上展現(xiàn)了稻米Rev2的氨基酸序列。然后測試該稻米Rev2，結果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
實施例7玉米中細胞分裂的調節(jié)采用美國專利5712135中公開的各種方法從發(fā)育中的玉米(Zea mays)種子中分離出0.1-1mm的合子的未成熟胚胎。用酶溶液II〔O.3％離析酶(Kinki Yakult，Nishinomiya，Japan)在CPW鹽中的溶液(Powell等人，1985，“植物細胞培養(yǎng)，一種實用的方法”，R.A.Dixon編輯，第3章)和10％甘露醇以及5mM 2-N-嗎啉代-乙磺酸(MES)，pH5.6〕處理新分離得到的胚胎進行1-2分鐘。用該酶溶液培育1-2分鐘后，用N6aph溶液〔N6培養(yǎng)基的常量元素和微量元素(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補充了6mM天冬酰胺、12mM脯氨酸、1mg/l硫胺素-HCl、0.5mg/l煙堿酸、100mg/l酪蛋白水解物、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖和54g/l甘露醇〕小心洗滌該胚胎。
洗滌后，將該胚胎培育在玉米電穿孔緩沖液EPM-NaCl中〔150mM NaCl，5mMCaCl2，10mM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)和0.425M甘露醇，pH7.2〕。每個小杯200μl EPM-NaCl溶液中放入大約100個胚胎。每個小杯中再分別加入約20μg線性化的玉米HD-Zip蛋白質-3質粒DNA。此玉米HD-Zip蛋白質-3質粒(DNA)含有在SEQ ID NO107中展現(xiàn)的整個玉米蛋白質-3多核苷酸序列的反向重復。該反向重復的玉米蛋白質-3轉基因的轉錄過程是在玉米18kD的油質蛋白啟動子的控制下進行(Qu等人，1990，J.Biol.Chem.，2652238-2243)。此外，該玉米HD-Zip蛋白質-3質粒還含有帶抗卡那霉素基因(neo)的嵌合體基因和在CaMV 35S3啟動子(EP 359617)控制下的3′多聚A額外區(qū)域。
與該外植體一起培育1小時后，將小杯轉移到冰浴中。在冰中培育10分鐘后，如下進行電穿孔從900μF的電容器中釋放場強為375V/cm的一個脈沖。該電穿孔裝置如Dekeyser等人(1990，Plant Cell，2591)所述。電穿孔完成后，立即將新配制的液體N6aph底物加到小杯內的外植體中，之后在冰中再培育該外植體10分鐘。
然后，將胚胎轉移到Mah1 VII底物中〔含有常量元素和微量元素和維生素并補充了100mg/l酪蛋白水解物、6mM脯氨酸、0.5g/l MES、1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2％蔗糖并用0.75g/l MgCl2和1.6g/l植物凝膠(Sigma ChemicalCompany，St Louis，Mo.)固化的N6培養(yǎng)基，pH5.8〕，并補充0.2M甘露醇。2-3天后，將胚胎轉移到補充了200mg/l卡那霉素的相同底物中。大約14天后，將胚胎轉移到沒有甘露醇、但補充卡那霉素(200m/l)的Mah1 VII底物中。使胚胎在這種選擇性底物中進一步傳代培養(yǎng)約2個月，傳代培養(yǎng)的時間間隔約為3周。之后小心地分離出誘導的胚胎發(fā)生組織，將其轉移到補充了5mg/l 6-芐基氨基嘌呤或5mg/l玉米素的MS培養(yǎng)基中(Murashige等人，1962，Physicol.Plant，15473-497)。使該胚胎發(fā)生組織維持在此培養(yǎng)基中約14天，接著轉移到沒有激素和含3-6％蔗糖的MS培養(yǎng)基中。將發(fā)育芽轉移到含有1.5％蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，以使其進一步發(fā)育成正常的小植株。將這些小植株轉移到土壤中，并在溫室中種植。
通過對轉化植株中的玉米籽粒的大小和未轉化的對照植株中的玉米籽粒的大小進行比較，測定植物細胞分裂的調節(jié)狀況。具體而言，轉基因植株的谷粒中胚胎由于細胞數(shù)目增加而大小增加。參考Scott等人(1998，Development，1253329-41)和Ingram等人(1999，Plant Mol.Biol.，40343-54)的方法，測定玉米胚胎的大小和發(fā)育狀況，特別要注意細胞的數(shù)目。
實施例8玉米根芽體細胞分裂的調節(jié)情況如美國專利5,780,708所述制備胚胎發(fā)生玉米愈傷組織系。使玉米愈傷組織傳代培養(yǎng)7-12天，再進行微粒轟擊處理。如下培養(yǎng)用于轟擊的玉米愈傷組織。將5塊(每塊濕重約為50mg)愈傷組織以交叉方式放在無菌的60×15mm佩特里培養(yǎng)平皿(Falcon 1007)的中心。在整個轟擊過程中，平皿都保存在蓋有濕紙巾的容器中。
用兩種質粒DNA分子的混合物轉化玉米愈傷組織。pHD-Zip-invp-1含有稻米肌動蛋白啟動子和3′nos聚腺苷酸化附加序列區(qū)域。多核苷酸序列SEQ IDNO103的反向重復可在稻米肌動蛋白啟動子(Wang等人，1992，Mol.Cell.Biol.，123399-3406)和胭脂堿合酶(nos)多聚A序列(Chilton等人，1983)之間插入。pHYGI1是含有潮霉素編碼序列(Gritz等人，1983，Gene，25179-188)和增強轉基因在轉基因植物中的蛋白質表達的玉米AdhIS內含子序列的質粒(美國專利5780708)。
采用完全如Klein等人(1988，Bio/Technology，6559-563)所述的方法，將pHD-Zip-invp-1質粒DNA和pHYGI1包涂到M-10鎢顆粒(Biolistics)，除了(i)使用的DNA的量是所提及的兩倍；(ii)在0℃將DNA沉積到顆粒上；(iii)含有包涂了DNA的鎢顆粒的試管在整個轟擊過程中都被保存在冰中。
所有的試管含有25μl的50mg/ml M-10鎢的水溶液、25μl的2.5M CaCl2和10μl、100mM的硫胺以及總共5μl、1mg/ml的質粒DNA。上述各質粒DNA存在的量是2.5μl。
所有的試管都在冰中培養(yǎng)10分鐘，在室溫下用Eppendorf離心機離心5秒鐘，使這些顆粒沉積，去除25μl上清液。在轟擊過程中將試管保存在冰中。所用的各沖擊用制品的轟擊次數(shù)不超過5次。
從Biolistics Inc.(Ithaca，N.Y.)獲得微粒和終止平皿。如供應廠商所述，它們是無菌的。從Biolistics，Inc.獲得微粒轟擊設備。
將樣品平皿盤放在微粒設備的終止平皿盤的底部下5cm處，該終止平皿位于最接近簡體的狹槽處。將如上面所述制備的愈傷組織平皿放在該樣品平皿盤的中心，并且移走該培養(yǎng)平皿的蓋。在該開放的圓盤上放置由鍍鋅鋼制成的7×7cm方形的剛性絲網目大小為3×3mm，以便在轟擊過程中保留住組織。如Biolistics，Inc.所述用超聲波處理鎢/DNA制品，用移液管將2.5μl懸浮液加到用于各次轟擊的大粒子的頂部。根據(jù)制造商所述操作該儀器。
在所有的樣品轟擊完成后，立即將經pHYGI1和pHD-Zip-invp-1質粒DNA處理的所有平板中的愈傷組織以平板對平板的方式轉移到含有15mg/l潮霉素B的F-培養(yǎng)基上(每個平板10塊愈傷組織)。這些平板稱為第1輪篩選平板。將經T.E.處理的平板得到的愈傷組織轉移到不加潮霉素的F-培養(yǎng)基上。每隔2-3周在非選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)這種組織，將這種組織稱為未選擇性對照愈傷組織。
經過約14天的選擇后，在選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上組織的表現(xiàn)基本上相同。將從經pHYGI1/pHD-Zip-invp-1轟擊的平板和一個經T.E.處理的平板得到的所有愈傷組織，從第1輪篩選平板轉移到含有60mg/l潮霉素的第2輪篩選平板中。第2輪選擇平板各含有10塊愈傷組織，每塊30mg，結果導致平板總數(shù)的增加。
在第2輪選擇平板上培養(yǎng)大約21天后，將所有的材料轉移到含有60mg/l潮霉素的第3輪選擇平板上。轟擊后大約79天，檢查第3輪選擇平板上的愈傷組織的可生存的部分。在經pHYGI1/pHD-Zip-invp-1處理的平板上的壞死組織的背景上切下愈傷組織的可生存部分，將其轉移到沒有潮霉素的的F-培養(yǎng)基中。
在沒有潮霉素的F-培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約20天后，將該轉化的愈傷組織轉移到含有60mg/l潮霉素的F-培養(yǎng)基中。該轉化的愈傷組織在60mg/l潮霉素的存在下在多次傳代培養(yǎng)中均能維持生長。轉化的愈傷組織的確認為了顯示經pHYGI1/pHD-Zip-invp-1處理的愈傷組織獲得了抗潮霉素基因，從能持續(xù)在存在60mg/l潮霉素的條件下生長的愈傷組織和未選擇的對照愈傷組織中分離出基因組DNA，并采用Southern印跡法進行分析。為從愈傷組織中分離出DNA，使2g愈傷組織在液氮中冷凍，將其研磨成細粉末，然后將其轉移到含有6ml抽提緩沖液(7M脲、250mM NaCl、50mM pH為8.0的Tris-HCl、20mM pH為8.0的EDTA、1％肌氨酸)的30ml Oak Ridge試管中。將7ml 1∶1的苯酚∶氯仿加到此混合液中，搖動該試管，并在37℃培養(yǎng)15分鐘。在4℃以8K的速率離心樣品10分鐘。使用miracloth(Calbiochem 475855)將上清液轉移到含有1ml、4.4M乙酸銨(pH5.2)的一次性15ml試管(American Scientific Products，C3920-15A)中。加入6ml異丙醇，搖動該試管，然后在-20℃培養(yǎng)該樣品15分鐘。在Beckman TJ-6離心機中以最大速率離心15分鐘，使該DNA沉積。棄去上清液，將沉積物溶解在500μl TE-10(10mM pH為8.0的Tris-HCl，10mM pH為8.0的EDTA)中在室溫下15分鐘。將樣品轉移到1.5ml的Eppendorf試管中，加入100μl、4.4M、pH5.2的乙酸銨和700μl異丙醇。在-20℃培養(yǎng)此溶液15分鐘，然后以Eppendorf微離心機處理(12,000rpm)5分鐘，使DNA沉積。用70％乙醇洗滌該沉積物，干燥，再懸浮于TE-1(10mM、pH8.0的Tris-HCl和1mM EDTA)中。
使用限制性內切酶消化10μg分離的DNA，然后用從pHD-Zip-invp-1質粒和pHYGI1質粒得到的探針進行Southern Blot雜交分析。在0.8％w/v瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳所用溶液為TAE緩沖液(40mM、pH7.6的Tris-乙酸鹽、1mMEDTA)，電壓為15V，時間為16小時。將凝膠上的NDA條帶轉移到Nytran膜(Schleicher and Schuell)上。根據(jù)制造商的建議進行轉移、雜交和洗滌。從經玉米HD-Zip-invp-1轉基因轉化的具有潮霉素抗性的愈傷組織中抽提得到的DNA樣品都具有特異地與HD-Zip-invp-1雜交探針雜交的DNA片段。在從對照愈傷組織中得到的DNA樣品中則沒有觀察到雜交信號。
植物再生和種子的產生直接將含有60mg/l潮霉素的平板中的轉化的愈傷組織的部分轉移到含有MS基本鹽類(Murashige等人，1962)、補充了0.5mg/l硫胺-HCl、0.75mg/2，4-D、50g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺和2.5g/l Gelrite(Kelco Inc.，San Diego)的RM5培養(yǎng)基(Murashige等人，1962)中。
在RM5培養(yǎng)基中培養(yǎng)約14天后，將大多數(shù)轉化的愈傷組織和未選擇的對照愈傷組織轉移到R5培養(yǎng)基(RM5培養(yǎng)基，除去2，4-D)中。在26℃將平板放在無光處培養(yǎng)約7天，然后將它們轉移到見光處，以見光培養(yǎng)14小時、無光培養(yǎng)10小時的輪換方式在26℃培養(yǎng)約14天。此時，將已形成的小植株轉移到一個含有100mlR5培養(yǎng)基的1夸脫罐(Ball)中。將植株從罐子轉移到蛭石中約7或8天，再移植到土壤中并讓它們生長至成熟。。從轉化的愈傷組織中長出約40株植株，從對照愈傷組織(未轉化的對潮霉素敏感性愈傷組織)中長出約10株。
使用標準的技術，對玉米MBS501近交系(Mike Brayton Seeds)和FR4326近交系(Illinois Foundation Research)進行成熟的轉化植株的人工授粉。在授粉后約45天收獲種子，使其進一步干燥1-2周。
R1子代的分析進行PCR分析，測試R1子代植株中HPT和pHD-Zip-invp-1轉基因序列的存在。為了進行PCR試驗，分別各從植株組織中取得0.1g樣品，在液氮中冷凍保存。然后在40℃在200μl、0.1M的Tris-HCl、0.1M NaCl、20mM EDTA、1％、pH8.5的Sarkosyl中使用120粒度的金剛砂研磨該樣品。接著進行苯酚/氯仿抽提和乙醇與異丙醇沉淀處理，然后將樣品懸浮在T.E.中，通過PCR進行分析(K.B.Mullis，美國專利4,683,202)。
在體積為100μl的50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.4)、3mM MgCl2、100μg/ml明膠、0.25μM的各種適當?shù)囊铩?.2mM的各種脫氧核苷三磷酸鹽(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、2.5單位的Taq DNA聚合酶(Cetus)和10μl的DNA制品的溶液中進行PCR。用礦物油覆蓋該混合物，加熱到94℃3分鐘，然后擴增35輪，每輪55℃1分鐘、72℃1分鐘、94℃1分鐘。然后在55℃培養(yǎng)該混合物2分鐘，在72℃培養(yǎng)5分鐘。使用10μl的PCR產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，并使用溴乙錠染色以使其顯現(xiàn)出來。
對于潮霉素-B磷酸轉移酶(HPT)基因的存在的進行分析，使用到與CaMV 35S啟動子互補的PCR引物和與該HPT編碼序列互補的PCR引物。因而，為了產生適當大小的PCR產物，該HPT模板DNA必須含有鄰接的CaMV 35S啟動子區(qū)域、Adhl內含子和5′蛋白質HPT編碼序列區(qū)域。對于玉米HD-Zip蛋白質-1反向重復轉基因的存在進行分析，使用到與該HD-Zip蛋白質-1反向重復區(qū)域內的序列互補的PCR引物。
與玉米HD-Zip蛋白質-1反向重復轉基因純合的R1子代植株，表現(xiàn)出由內源HD-Zip蛋白質-1功能的轉基因抑制作用引起的植物形態(tài)學表型。野生型HD-Zip蛋白質-1功能的可喪失引起玉米細胞分裂的調節(jié)作用。調節(jié)的細胞分裂表型可產生其葉子較大并含有更多細胞的轉化植株。按Talbert等人(1995，Development，1212723-35)所述測定莖和葉中的細胞數(shù)量。
實施例9稻米種子中細胞分裂的調節(jié)作用對稻米栽培品種日本裸種(Nipponbare)的脫殼的成熟種子經表面滅菌處理，將它們放到2N6固體培養(yǎng)基〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補充了0.5mg/ml煙堿酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、2.0mg/l2，4-D、30g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH為5.8〕上，在27℃的暗處培育。在3-4周內，愈傷組織從胚胎的盾板中長出。將原生愈傷組織的胚胎發(fā)生部分轉移到N67培養(yǎng)基〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補充了0.5mg/l煙堿酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、2.0g/l酪蛋白氨基酸(維生素試驗，Difco)、1.0mg/l 2，4-D、0.5mg/l 6-芐基氨基嘌呤、20g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇和2.0g/l植物凝膠，pH為5.8〕中，以使其繁殖成致密的胚胎發(fā)生愈傷組織。
傳代培養(yǎng)后約3-4周，使用稻米基因組HD-Zip gp-1質粒DNA轉化該胚胎發(fā)生愈傷組織。將愈傷組織切成最大長度約為1.5-2mm的片段。在EPM(5mM CaCl2、10mM HEPES和0.425M甘露醇)中洗滌這些愈傷組織塊兩次，然后在室溫(25℃)下，使這些愈傷組織塊在該緩沖液中質壁分離預處理30分鐘-3小時。然后用EPM-KCl(EPM緩沖液加80mM KCl)洗滌這些愈傷組織片，然后將其轉移到電穿孔處理小杯中。在各個杯中加入150-200mg的愈傷組織片和100-200μl EPM-KCl。每個杯中再加入10-20μg質粒DNA，或為環(huán)狀的pHD-Zip-asgp-1，或為線狀的pHD-Zip-asgp-1都可以。pHD-Zip-asgp-1是含有反義HD-Zip-蛋白質-1轉基因的質粒，它受到稻米肌動蛋白啟動子的轉錄控制(Wang等人，1992)。反義HD-Zip-gp-1轉基因含有從在SEQ ID NO115中展示的稻米基因組DNA(實施例3)克隆得到的多核苷酸序列。pHD-Zip-asgp-1質粒還含有含受CaMZ 35S3啟動子(見歐洲專利出版(“EP”)359617〕控制的bar基因的嵌合型基因。該bar基因(見EP242236)可編碼產生具有對除草劑膦絲菌素抗性的膦絲菌素乙酰轉移酶。這種嵌合型bar轉基因含有膦絲菌素乙酰轉移酶編碼序列和葉綠體靶向運送序列。
在室溫下將該DNA與愈傷組織片一起培育約1小時。然后如實施例4所述進行電穿孔處理。電穿孔后，將沒有酪蛋白氨基酸的N67液體培養(yǎng)基加到愈傷組織片中。然后將這些愈傷組織片放到沒有酪蛋白氨基酸但補充了5、10或20mg/l的膦絲菌素(PPT)的N67固體培養(yǎng)基中，在27℃、16小時見光/8小時無光的輪換條件下在此選擇性培養(yǎng)基上培育約4周。分離發(fā)育的PPT-抗性愈傷組織，使它們在沒有酪蛋白氨基酸但含有5mg/l PPT的新配制N67培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)約2-3周。之后，將經挑選的PPT-抗性愈傷組織轉移到補充了5mg/l PPT的再生培養(yǎng)基N6M25〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975)，補充了0.5mg/l煙酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、288mg/l天冬氨酸、174mg/l精氨酸、7.0mg/l甘氨酸、1.0mg/l O-萘乙酸(NAA)、5.0mg/l激動素、20g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH5.8〕中。在大約1個月內生長出小植株，然后將這些小植株轉移到不含激素的N6培養(yǎng)基〔(Chu等人，1975)補充了0.5mg/l煙酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、1.0g/l酪蛋白氨基酸、20g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH5.8〕中，使它們在此培養(yǎng)基上再生長2-3周，然后將它們轉移到土壤中，并在溫室中培育。
轉化的稻米植株的特征在土壤中培育上述轉化的稻米植株，直到種子形成并成熟。將該轉化植株的后代的種子播種在含有70mg/l潮霉素的400倍Homai水合物(Kumiai Kagaku Inc.)水溶液中，并在25℃在此溶液中培育10天，由此選出對潮霉素具有抗性的植株。播種轉化植株的后代的植株的種子各20粒，并培育約3周。從潮霉素抗性R1代植株收集到葉子，將其與從使用上述方法再生但不含有反義HD-Zip-asgp-1轉基因的稻米植株中收集到的葉子作比較。從pHD-Zip-asgp-1轉化的植株收集到的葉子表現(xiàn)出經過調節(jié)的細胞分裂，表現(xiàn)為稻米葉子的尺寸增加。
采用Southern雜交技術分析轉化和非轉化植株，其中，植株基因組DNA被消化，并使用pRiceHD-Zip-gp-1 DNA探測。雜交數(shù)據(jù)表明，顯示細胞分裂調節(jié)的轉基因植株含有至少一部分pRiceHD-Zip-gp-3質粒DNA的副本被整合到稻米基因組中。
實施例10稻米莖的細胞分裂的調節(jié)作用樣品培養(yǎng)組織的制備制備從日本產稻米(Oryza sativa L.)的變種Koshihikari得到的盾片愈傷組織，將其用于采用Hiei等人(1994；美國專利5,591,616)的方法進行的根癌農桿菌(Agrobacterium tumifaciens)介導的轉化過程中。將稻米的成熟種子浸入70％乙醇中1分鐘，然后浸入1％次氯酸鈉溶液中30分鐘，進行無菌處理。然后將這些種子放到2N6固體培養(yǎng)基〔無機鹽類和N6的維生素(Chu，1978，Proc.Symp.PlantTissue Culture，Science Press Keking，pp.43-50)，1g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l 2，4-D、30g/l蔗糖、2g/l Gelrite〕。培育這些成熟的種子約3周后，從盾片萌發(fā)出生長型愈傷組織。將這種盾片愈傷組織轉移到2N6培養(yǎng)基培育4-7天。將所得的愈傷組織用作“盾片愈傷組織”樣品。
將從盾片萌生的愈傷組織轉移到AA液體培養(yǎng)基〔AA的主要無機鹽類、AA的氨基酸類和AA的維生素類(Toriyama等人，1985，Plant Science，41179-183)、MS次要的鹽類(Murashige等人，1962，Physiol.Plant.，15473-497)、0.5g/l酪蛋白氨基酸、1mg/l 2，4-D、0.2mg/l激動素、0.1mg/l赤霉素和20g/l蔗糖)中，在25℃、無光條件下在此培養(yǎng)基中培育這些細胞，同時以120rpm搖動，以獲得懸浮的培養(yǎng)細胞。每周用新配制的培養(yǎng)基替換原先的培養(yǎng)基。
Ti質粒(雙重載體)使用下述反向重復稻米HD-Zip蛋白質-1轉基因結構替換CaMV 35S啟動子/Gus/nos多聚A轉基因，從而改變pTOK232(Hiei等人，1994)的T-DNA區(qū)域。SEQID NO121公開了在實施例3中獲得的稻米cDNA插入子的DNA序列。在稻米肌動蛋白啟動子區(qū)域和胭脂堿合酶多聚A附加序列之間插入SEQ ID NO121的反向重復序列。這種改變的pTOK232質粒是雙重轉化載體，稱為pTOKivr-HD-Zip-p1。
將具有被刪去T-DNA區(qū)域的Ti質粒的根癌農桿菌(Agrobacterium)LBA4404株用作稻米轉化的宿主細菌。LBA4404菌株具有輔助質粒PAL4404(具有完整的vir區(qū))，可從American Type Culture Collection(ATCC 37349)獲得。采用Ditta等人(1980，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，777347-7351)的三元雜交法將雙重載體pTOKivr-HD-Zip-p1導入LBA4404菌株。
用鉑環(huán)收集培養(yǎng)于含有潮霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的AB培養(yǎng)基(Drlica等人，1974，Proc.Nail.Acad.Sci.USA，713677-3681)上3-10天的pTOKivr-HD-Zip-p1根癌農桿菌株的菌落，將其懸浮在改良的AA培養(yǎng)基(其組分與上述AA培養(yǎng)基相同，但蔗糖和葡萄糖的濃度分別改為0.2M和0.2M，并加入100μM乙酰丁香酮，pH5.2)中。將細胞數(shù)調整到3×109-5×109細胞/毫升，并將該懸浮液用于稻米愈傷組織的接種。
接種條件用無菌水洗滌稻米盾片愈傷組織，然后將它們浸入上述根癌農桿菌的懸浮液中3-10分鐘。還用不含有雙重載體的LBA4404菌株進行培育，其作為陰性對照。在含有濃度與上述相同的乙酰丁香酮、葡萄糖和蔗糖的2N6固體培養(yǎng)基中，在25℃、無光的條件下培育該共培育盾片愈傷組織樣品2-5天。然后用含有250mg/l頭孢噻肟的無菌水洗滌所得到的接種組織，之后繼續(xù)在含有250mg/l頭孢噻肟的前述2N6固體培養(yǎng)基中培育。
轉化的細胞和組織的選擇將已與根癌農桿菌株培育3天的盾片愈傷組織培育在含有250mg/l頭孢噻肟的2N6培養(yǎng)基中約1周。通過在含有50mg/l潮霉素的2N6培養(yǎng)基中培育該培養(yǎng)組織3周，篩選出具有潮霉素抗性的培養(yǎng)組織(初級選擇)。將所獲得的抗性組織進一步培養(yǎng)在含有50mg/l潮霉素的N6-12培養(yǎng)基(N6無機鹽類、N6維生類、2g/l酪蛋白氨基酸、0.2mg/l 2，4-D、0.5mg/l 6BA、5mg/l ABA、30g/l山梨糖醇、20g/l蔗糖和2g/l Gelrite)中約2-3周(次級選擇)，然后將在此培養(yǎng)基上長出的愈傷組織轉移到含有0、20或50mg/l潮霉素的植物再生培養(yǎng)基N5S3中。在與根癌農桿菌共培育后所使用到的所有培養(yǎng)基中都加入250mg/l頭孢噻肟。在25℃、連續(xù)照明(約2000lux)的條件下在N6S3培養(yǎng)基上培育愈傷組織。最后將再生的植株轉移到罐裝的土壤中，使它們在溫室中成長成熟。
將轉化植株的后代的種子播種在含有70mg/l潮霉素的400倍Homai水合物(Kumiai Kagaku Inc.)水溶液中，并在25℃下培育10天，由此選擇出對潮霉素具有抗性的植株。播種20粒轉化植株的后代的各植株的種子，并培育約3周。從轉化了HD-Zip蛋白質-1反向重復轉基因的籽苗和未轉化的對照植株中收集葉子。在轉化植株中因為轉基因誘導了細胞分裂的調節(jié)過程而其葉子中的細胞數(shù)量增加。采用Talbert等人(1995，Development，1212723-35)所述的方法測定葉子中細胞的數(shù)量。
還采用Southern印跡雜交法對轉化和非轉化植株進行分析，將植株的基因組DNA消化，然后用pRiceHD-Zip-p-1 DNA探測。雜交數(shù)據(jù)顯示，具有細胞分裂的調節(jié)的轉基因植株含有整合到稻米基因組pRiceHD-Zip-p-1的一個拷貝的至少一部分。
實施例835S花椰菜花葉病毒啟動子驅動的REVOLUTA基因的有義表達使用引物AAGGTACCAAGTTCGACGGAGAAGGTGA[SEQ ID NO53]和AAGGATCCTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG[SEQ ID NO54]進行PCR，從pHomer102質粒擴增出可編碼大約900bp的35S花椰菜花葉病毒啟動子的DNA片段。對從獨立的PCR反應得到的克隆測序，以證實該PCR擴增作用的精確度。考慮到包括該擴增的35S啟動子的900bp的Kpn1-BamH1片段的分離，在該組PCR引物中包括了Kpn1和BamH1限制性位點。在克隆體NO84中REV基因組序列的5′端中的Kpn1和Bam H1位點插入此Kpn1-BamH1片段，以產生在距35S啟動子轉錄起始點大約70bp的下游處連接的NO REV基因。該REV基因的3′端位于下述REV編碼區(qū)域的下游。
如上面所述，NO84是含有從NO生態(tài)型植株中分離得到的REVOLUTA的基因組DNA序列的一個克隆體。使用引物HDALAAAATGGAGATGGCGGTGGCTAAC[SEQ ID NO33]和HDARTGTCAATCGAATACACAAAAGACCA[SEQ ID NO34]進行長距離PCR，擴增該REV NO84基因，擴增條件基本上如上面所述，但各變性步驟在94℃進行，并且在總共40輪循環(huán)中的第10輪后，每輪延長20秒鐘。
為了將3′聚腺苷酸化信號克隆到該基因的末端，使用下列各種寡核苷酸(5′引物包括NotI位點TTGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAGACTAATTT[SEQID NO51]；3′引物包括ApaI和KpnI位點TTGGGCCCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAC[SEQ ID NO52]進行PCR，擴增起始于鄰近終止密碼子下游的Columbia REV的0.7kb長的3′端。通過測序證明檢驗各克隆體，結果是REV的3′區(qū)域位于載體的NotI和ApaI位點中的NO84REV編碼區(qū)域的下游。使用KpnI從原始載體中克隆出所得到的含有35S啟動子、REV編碼區(qū)域和REV 3′區(qū)域的基因，并將其連接到pCGN1547 T-DNA載體中。
35S-REV基因的轉化用上述結構轉化根癌農桿菌At503株，并采用植物活體轉化程序用該菌株來轉化各種野生型No植株。
鑒定5個獨立轉化系列的生長表型。我們發(fā)現(xiàn)其葉子、莖和種子尺寸有所增加(圖10-12和表11)。不同系列的增長程度不同。在種子增長最大的系列，其種子大小是對照種子的接近2倍。
器官和種子增大的獨立轉基因系列的產生表明，CaMV35S-REV基因在各種植物中的表達導致了生長增加。值得注意的是，各種CaMV35S-REV植株的表型并沒有顯示出rev突變體具有任何異常異常的花、空的軸和扭曲的葉子。因而，REV的有義表達有助于獲得具有有價值特征的各種作物植物。
本文將上述說明書中所提及的所有出版物和專利的內容納入作為參考。雖然已對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行了闡述和描述，但是應該看到，在不偏離本發(fā)明的實質和范圍的情況下，可對本文作出各種改動。
序列表DNA和蛋白質序列擬南芥REVOLUTA SEQ ID NO1基于第2849位的ATG的18個外顯子的起始/末尾位置。
284930813390355236703743382239124004409941874300438344664542469747864860494250485132530653945582566857485834596860516388647765856663681268907045啟動子的起始是+1GGGAACACTTAAAGTATAGTGCAATTGTATTCAAACTGACAAATTAATCATTAATTGTATTAGAAAATGATATATTGTCATCGTGACTAATTTGTCTTTTGAATTCAATTGTAACTACTAACTACTGGTTTTCATTTTTCAGATTATTTCTCGGTTCTTAAAAAGAAGAAAACACATACCTAATATCGTGTGTATCAAAAAGCCATGTGCGAGCAACCATCTTCCTTTGTAAATTTGACCCTTTTGTGTATCATTTATATCGAGTGTTTGTAATTGTTGGTTGATTTTGTGTTATTTGAGAGGCTAGTCATTTACGCAATTTCTAAATTTATCTTTTAGTACGTATCAAGATGTTGGAGCAACTGTGTCCAACATACATGACATGTGAAATTATAATTGTTAAAACAAAAGGACATGTGAAATTACTATCTACTTAAAGAAAAAAACCAGAAAGAAAAAAAGGTATTAAATTTGGAACTAAAAGAAGGTTAAAAAGTTTTTTACAGAAAGTAATTACACTTGCAGATGAAAGAAAAAAGGCAGCATCATGATATGTAAAAAATTGTCGAAGAGGTTTAGTCGTATCACTTTGTTTGACTGATCACTGTCTTCTGATTCATTTTTCAGTTTTTCTTTTTCAAATTGTAGCTCACAACATTAAAGTTATTCACTGCTTTAATCAGATAGTTTAATACTAGTAACTAGCTCATTTAGGCTTTAAACACCTCTTTCTGATTACTAGCCCACTCTTTGGTGGTTCTTACATATCACACCTAACTATACTGTGTATCCTTGAAGTGAAAATCAAATTTACCATTCGTATCTTACTTACATACACTATTATTTTTCCTTTTTTTTTTCACTCAAGGTCCTACTCTTTGATACCATAGCTATAATTTGGAAATAACTATTTACAGTGTATTAATTATACCTAAACAGTTTAATCTGGACTAAATATTTAGATAGATGTTACAAATTTGGTTCGTCTAATAAATGAAGACAAGACATGCTAACAAATAAAACACTACCACAAAGGGATAGTGAGAGAATGTGTTTTGCAACAAGACATAACTTTGATTGCTTGATGTGTTAAAATGATTATGTCAGAGACAGAGAGCGATCATAGGCTTTCTTTATTTCTAATAACGTCGATTTTCTTCTTCTTTTCTGGCGTTCAATAATGTCGAATTTTAATTCTTGATTTTTGCAACTCTAAATATCCTTAACGACATTGAAGCATGGTGCATGTCGATCGTTAATAATAAAGTTGAACAAAAATCTTGTTGAATTAATTACAAGCACAGCTTCAATAGCATAACTTTACGAGACGACCAGATCTTATAGACGAGTTTCGCTTTTACTTTTTTAATGATTAAAACTTTCATCGGAGAACATAAGTCTTCCTCTTAATTAAAATTACTACCCGTGCATAACTTCATTTTTTAAAACATCAATAATTAATATACGATTACAACCCTAAAAATTAGTCACCCTATAGTACATAACAATGATGATAGTTTTTTCTTTTTGGTGTAATGTTAAAATAAAATGTTAGCCATATTAAACGATAGTTCTTTTAACTTAGCCATTGTAAGATATTTCTTACTTTAGTTTTTCCGTAGAAGATATTCATTATGGTATGGATAGTATATACCTTAACTGAGTTTAAATATTGGATCAATACCATCTAATAACACATATCTGATGTTCAATACTTAATAATTTTGCATAAATGTTAAGCGTGACAACTTAAAAAAAAACACATCAACAGAGTAAAAACATATCTGTTAAATAAGAAAAATGTCATTTTTATAACACTTAAAAAAAAATGCATGAAGCGTTTCATAGTTTTTTTTTTTTTCAAAGTAATGTAGGCGTTAGATATTTCTTACAATTTTTTGAAAAATATTTTTTATGTTGTGATTGGCTGATATCAGGTAACTAAAACTTCTTTAAAGAATTGAAGAAAATTTGAAAAGTAAATAGATGGATTCCTATATTGTCATTTCAGAAAAACAGTAGGGACAACTTCGTAAATGATAGCCGTATTATTAAACAAATAAATTTAAATTAGAAAAAAGGAAAAAAACGCACCACTTTTCTTTTTCGCTGATGCACAGCTTGTCGGTTTGCGTGCAAATCCTCTGTTTCACAATTTTTTCTTCTTCTCTTTCTCTCTCTTCCTCTTTTATTCCTCTGTTCCAAAGTTCAGCAGAAGCAAACACACACATCACTTACTATCTCTCTCTCCTTCTTCACTTTCTCACATAACCAAACTCTCTCTTTCTCTCTTTTTTTTGAAGTCTCCTTTGAAACTATAATTGCCCTTTAGTGTTGTTCGTTCAGAGTCTTCAAAACTTTTGCAGCTTCAATTGTACCTGGGTTTCTTCTTCATTGTTCCTAAGGTTTCTGTGTCCTTCAATTCTTCTGATATAATGCTTCTTTAAGAGAGTTGACATCATCACTTTCTTGGGGTACTCTTCTCTGTTTCTCCCCAGAAAATCCAACTCTGTAATTTTGGGTCTTTATTCTGTTTTTCTCTTTGAAGAATCTTTAAAATTCTCAGATCTTCTGAATCTCTCTTCTTTAAAACTTTTTTTAACTTTATTTTTTGTACTCGCTTCTTTGCCTTCATTTTTCTCGTATCCACATGTCGTTGGTCTTTCGCTACAAGCCACGACCGTAGAATCTTCTTTTGTCTGAAAAGAATTACAATTTACGTTTCTCTTACGATACGACGGACTTTCCGAAGAAATTAATTTAAAGAGAAAAGAAGAAGAAGCCAAAGAAGAAGAAGAAGCTAGAAGAAACAGTAAAGTTTGAGACTTTTTTTGAGGGTCGAGCTAAAATGGAGATGGCGGTGGCTAACCACCGTGAGAGAAGCAGTGACAGTATGAATAGACATTTAGATAGTAGCGGTAAGTACGTTAGGTACACAGCTGAGCAAGTCGAGGCTCTTGAGCGTGTCTACGCTGAGTGTCCTAAGCCTAGCTCTCTCCGTCGACAACAATTGATCCGTGAATGTTCCATTTTGGCCAATATTGAGCCTAAGCAGATCAAAGTCTGGTTTCAGAACCGCAGGTATTGCTTCTCTTTAATATGGCCAGGATTAATTTTTAATTAAGGATTTTGAATTTGATTCTATTGGATTTAGTGTGTTATATTCAATGGATATGAAGGACCACTTTTGTTGTTATTTCAAGATTTGATGCTTCAATTCAATTCTCCGACACAATTTCCTGTTTTTACAAAAGGGTTCCTTTGAATCTGTCTGGTAGATTTGGTTATTCAATAGCTTGGTGTAACTGTTCTTGTGACGATATGGTTACTGTCTGATCTGGTGTCTAATCTTAGGAGTATTGTTGATTCGTTTTGTTGTGTGGTTTCAGGTGTCGAGATAAGCAGAGGAAAGAGGCGTCGAGGCTCCAGAGCGTAAACCGGAAGCTCTCTGCGATGAATAAACTGTTGATGGAGGAGAATGATAGGTTGCAGAAGCAGGTTTCTCAGCTTGTCTGCGAAAATGGATATATGAAACAGCAGCTAACTACTGTTGTATGTAACTTAACATTTCCTTTTGTCAAATGTGTTCTTAAAGAATCATTTGTTACTCCTATCAGTTCAACATGTAGCTTGAGTTATAAAGTTACTGACTTGTTGTTTTAACTTCAGGTTAACGATCCAAGCTGTGAATCTGTGGTCACAACTCCTCAGCATTCGCTTAGAGATGCGAATAGTCCTGCTGGGTAAAGTTTCATTTTTGGTTTTGAAGTAACCTTTTTCTAATCTTTTTTCTTTGCCTAATTGCTTGGTTTTGGTCTTAGATTGCTCTCAATCGCAGAGGAGACTTTGGCAGAGTTCCTATCCAAGGCTACAGGAACTGCTGTTGATTGGGTTCAGATGCCTGGGATGAAGGTTATACGCATCTCGTATCATTACTTAAGTGTTATTTTATCTGTTGATATCTATGGCAATATGTGAAATATTGAAATGTTGTGTGTTGTAGCCTGGTCCGGATTCGGTTGGCATCTTTGCCATTTCGCAAAGATGCAATGGAGTGGCAGCTCGAGCCTGTGGTCTTGTTAGCTTAGAACCTATGAAGGTAAGAAAGGGACACTCTTTTCGTTGCTAAAGATACAAGTCATAATGTTTCATTTTCAACCAGTTTGGGTTTTTTGTGTTCTTACAGATTGCAGAGATCCTCAAAGATCGGCCATCTTGGTTCCGTGACTGTAGGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGTTCCCGGCTGGTAATGGTGGCACAATCGAGCTTGTTTATATGCAGGTGAATCCTTTAGCCTCTTCTGGTTTAGTTTTCTATCTCTAACACTTGAAGATGAATGAATAAAGTTGTGACATTTGTTCAGACGTATGCACCAACGACTCTGGCTCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTTTTGTGGTATGCAGCTCTCATAATGTCTAGTGTTTACAGAAAAACTCTGGGATCTTGATGTTTTTCATATGTCTTTAAAAGGTTTGTGAGAGGTCGCTATCTGGCTCTGGAGCTGGGCCTAATGCTGCTTCAGCTTCTCAGTTTGTGAGAGCAGAAATGCTTTCTAGTGGGTATTTAATAAGGCCTTGTGATGGTGGTGGTTCTATTATTCACATTGTCGATCACCTTAATCTTGAGGTACTTAAATCTTCACATGTGGCATTTTGTGTGTGTTTTCAGGAATTTCTAGAAGAATTGATTATAAACATTTGTTCTTGCATTGTAGGCTTGGAGTGTTCCGGATGTGCTTCGACCCCTTTATGAGTCATCCAAAGTCGTTGCACAAAA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2011CCA AAG TCG TTG CAC AAA AAA TGA CCA TTT CCG TGA GTG TAT ACA TAT AATAAC CTT AAG2041 2071CTT TGA TTG ATT CAT ATA ACA TAT CTA ACG GTT GGA GGT GCT TCA TGT TTTAGG CGT TGCrev-2和 rev-4A非生態(tài)型 T2101 2131GGT ATA TCA GGC AAT TAG CCC AAG AGT CTA ATG GTG AAG TAG TGT ATG GATTAG GAA GGC2161 2191AGC CTG CTG TTC TTA GAA CCT TTA GCC AAA GAT TAA GCA GGT ACT TCG ATCTTG AGC TAA2221 2251AAC CTA ATT GTT CTT TGC TCT GTT TGC TCA TTG TCA TTT TTT CTG TTC TTGGTT TTC TTG2281 2311AAG GGG CTT CAA TGA TGC GGT TAA TGG GTT TGG TGA CGA CGG GTG GTC TACGAT GCA TTG2341 2371TGA TGG AGC GGA AGA TAT TAT CGT TGC TAT TAA CTC TAC AAA GCA TTT GAATAA TAT TTC2401 2431TAA TTC TCT TTC GTT CCT TGG AGG CGT GCT CTG TGC CAA GGC TTC AAT GCTTCT CCA AGT2461 2491AAG TTA GTG TGT CCA GTA TTG GTA CTT TGT GTT CTT TTG ACA GTT TTC TATGGC TGA AAT2521 2551TTG TGT TAT CTA TTG TCT TCT GTA GAA TGT TCC TCC TGC GGT TTT GAT CCGGTT CCT TAG2581 2611AGA GCA TCG ATC TGA GTG GGC TGA TTT CAA TGT TGA TGC ATA TTC CGC TGCTAC ACT TAA2641 2671AGC TGG TAG CTT 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CAC TAT CGC GTT TCA ATT CCCTTT TGA AAA3361 3391CAA CTT GCA AGA AAA TGT TGC TGG TAT GGC TTG TCA GTA TGT GAG GAG CGTGAT CTC ATC3421 3451AGT TCA ACG TGT TGC AAT GGC GAT CTC ACC GTC TGG GAT AAG CCC GAG TCTGGG CTC CAA3481 3511ATT GTC CCC AGG ATC TCC TGA AGC TGT TAC TCT TGC TCA GTG GAT CTC TCAAAG TTA CAG3541 3571GTG GGG GTG TAA ATG TTT ACT CTC GTC TCT TTC TTA TAA TCC TCG AAC TTATCG ATG ATG3601 3631CCT TAT GCT GAT ATG TTT GTT TTT CCA GTC ATC ACT TAG GCT CGG AGT TGCTGA CGA TTG3661 3691ATT CAC TTG GAA GCG ACG ACT CGG TAC TAA AAC TTC TAT GGG ATC ACC AAGATG CCA TCC3721 3751TGT GTT GCT CAT TAA AGG TAT GTG TCC TAC ACC AAA CAA AAA GCA GAA TACACC TGT AGT3781 3811TTT AGA CGT ATA ATA TGG TCT GGA TAT GTT GCA GCC ACA GCC AGT GTT CATGTT TGC GAA3841 3871CCA AGC TGG TCT AGA CAT GCT AGA GAC AAC ACT TGT AGC CTT ACA AGA TATAAC ACT CGA3901 3931AAA GAT ATT CGA TGA ATC GGG TCG TAA GGC TAT CTG TTC GGA CTT CGC CAAGCT AAT GCA3961 3991ACA GGT AAA GAA CCA AAA CAA AAA CAT CTG CAG ATA AAT GGT TTT GAT TCATTT GTC TGA4021 4051GAA CTA TCT TTG CGT CTA CAG GGA TTT GCT TGC TTG CCT TCA GGA ATC TGTGTG TCA ACG4081 4111ATG GGA AGA CAT GTG AGT TAT GAA CAA GCT GTT GCT TGG AAA GTG TTT GCTGCA TCT GAA4141 4171GAA AAC AAC AAC AAT CTG CAT TGT CTT GCC TTC TCC TTT GTA AAC TGG TCTTTT GTG擬南芥REVOLUTA蛋白 SEQ ID NO2MEMAVANHRE RSSDSMNRHL DSSGKYVRYT AEQVEALERV YAECPKPSSL RRQQLIRECSILANIEPKQI KVWFQNRRCR DKQRKEASRL QSVNRKLSAM NKLLMEENDR LQKQVSQLVCENGYMKQQLT TVVNDPSCES VVTTPQHSLR DANSPAGLLS IAEETIAEFL SKATGTAVDWVQMPGMKPGP DSVGIFAISQ RCNGVAARAC GLVSIEPMKI AEILKDRPSW FRDCRSLEVFTMFPAGNGGT IELVYMQTYA PTTLAPARDF WTLRYTTSLD NGSFVVCERS LSGSGAGPNAASASQFVRAE MLSSGYLIRP CDGGGSIIHI VDHLNLEAWS VPDVLRPLYE SSKVVAQKMTISALRYIRQL AQESNGEVVY GLGRQPAVLR TFSQRLSRGF NDAVNGFGDD GWSTMHCDGAEDIIVAINST KHLNNISNSL SFLGGVLCAK ASMLLQNVPP AVLIRFLREH RSEWADFNVDAYSAATLKAG SFAYPGMRPT RFTGSQIIMP LGHTIEHEEM LEVVRLEGHS LAQEDAFMSRDVHLLQICTG IDENAVGACS ELIFAPINEM FPDDAPLVPS GFRVIPVDAK TGDVQDILTANHRTLDLTSS LEVGPSPENA SGNSFSSSSS RCILTIAFQF PFENNLQENV AGMACQYVRSVISSVQRVAM AISPSGISPS LGSKLSPGSP EAVTLAQWIS QSYSHHLGSE LLTIDSLGSDDSVLKLLWDH QDAILCCSLK PQPVFMFANQ AGLDMLETTL VALQDITLEK IFDESGRKAICSDFAKLMQQ GFACLPSGIC VSTMGRHVSY EQAVAWKVFA ASEENNNNLH CLAFSEVNWSFV擬南芥rev-3蛋白質 SEQ ID NO6MEMAVANHRE RSSDSMNRHL DSSGKYVRYT AEQVEALERV YAECPKPSSL RRQQLIRECSILANIEPKQI KVWFQNRRCR DKQRKEASRL QSVNRKLSAM NKLLMEENDR LQKQVSQLVCENGYMKQQLT TVVNDPSCES VVTTPQHSLR DANSPAGLLS IAEETLAEFL SKATGTAVDWVQMPGMKPGP DSVGIFAISQ RCNGVAARAC GLVSLEPMKI AETLKDRPSW FRDCRSLEVFTMFPAGNGGT IELVYMQTYA PTTLAPARDF WTLRYTTSLD NGSFVVCERS LSGSGAGPNAASASQFVRAE MLSSGYLIRP CDGGGSIIHI VDHLNLEAWS VPDVLRPLYE SSKVVAQKMTISALRYIRQL AQESNGEVVY GLGRQPAVLR TFSQRLSRGF NDAVNGFGDD GWSTMHCDGAEDIIVAINST KHLNNISNSL SFLGGVLCAK ASMLLQNVPP AVLIRFLREH RSEWADFNVDAYSAATLKAG SFAYPGMRPT RFTGSQIIMP LGHTIEHEEM LEVVRLEGHS LAQEDAFMSRDVHILQICTG IDENAVGACS ELIFAPINEM FPDDAPLVPS GFRVIPVDAK TGDVQDLLTANHRTLDLISS LEVGPSPENA SGNSFSSSSS RCILTIAFQF PFENNLQENV AGMACQYVRSVISSVQRVAM AISPSGISPS LGSKLSPGSP EAVTLAQWIS QSYSHHLGSE 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NO113AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米蛋白質1 SEQ ID NO104SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質2 SEQ ID NO106SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質3 SEQ ID NO108TSSRRQQLLRECPTLANIEPKQIKV玉米質白質7 SEQ ID NO110SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質8 SEQ ID NO112SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質9 SEQ ID NO114SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV稻米基因組克隆稻米基因組1 SEQ ID NO115AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組4 SEQ ID NO117AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組10 SEQ ID NO119AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組蛋白質l SEQ ID NO116SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米基因組蛋白質4 SEQ ID NO118SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米基因組蛋白質10 SEQ ID NO120SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米CDNA克隆稻米cDNA1 SEQ ID NO221TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTGAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAAGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTGTC稻米cDNA4 SEQ ID NO123TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTAAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAGGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTHTC稻米cDNA8 SEQ ID NO125TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTAAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAGGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTGTC稻米cDNA蛋白質1 SED ID NO122SSRRQQLLRECPILANIEPKQIKVWFQNRKCRDKQRKESSRLQAV稻米cDNA蛋白質4 SEQ ID NO124SSRRQQLLRKCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKESSRLQAV稻米cDNA蛋白質8 SEQ ID NO126SSRRQQLLRKCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKESSRLQAV///REV基因產物的主要內部區(qū)域擬南芥REV序列(SEQ.ID NO2的第123-146位氨基酸)GYMKQQLTTVVNDPSCESVVTTPQ(SEQ ID NO130)相應的蕃茄REV序列GYMRQQLQSVTTDVSCESGVTTPQ(SEQ ID NO131)相應的稻米REV1序列AHMRQQLQNTPLANDTSCESNVTTPQ(SEQ ID NO132)相應的稻米REV2序列AYMKQQLQNPXLGNDTSXESNVTTPQ(SEQ ID NO133)擬南芥REV序列(SEQ ID NO2的第234-246位氨基酸)CRSLEVFTMFPAG(SEQ ID NO134)蕃茄REV序列CRNVEVITMFPAG(SEQ ID NO135)稻米REV1序列CRNLEVFTMIPAG(SEQ ID NO136)稻米REV2序列CRSLEVFTMFPAG(SEQ ID NO137)反向重復構建物的引物例子REVIR-1 TTATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAAT (SEQ ID NO138)REVIR-2 TTGCGGCCGCCTGACAAGCCATACCAGCAA(SEQ ID NO139)REVIR-3 TTGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGCAATGG(SEQ ID NO140)REVIR-4 TTGCATGCGCTAGCGTCGTCGCTTCCAAGTGAAT(SEQ ID NO141)REVIR-5 TTGTCGACCCGCGGAGCTTTGCTTATCCGGGAAT(SEQ ID NO142)REVIR-6 TTGATGCGCTAGCCTGACAAGCCATACCAGCAA (SEQ ID NO143)(SEQID NO144)反向重復的例子(SEQ ID NO144)ATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAATGAGACCAACAAGATTCACTGGGAGTCAGATCATAATGCCACTAGGACATACAATTGAACACGAAGAAATGCTAGAAGTTGTTAGACTGGAAGGTCATTCTCTTGCTCAAGAAGATGCATTTATGTCACGGGATGTCCATCTCCTTCAGATTTGTACCGGGATTGACGAGAATGCCGTTGGAGCTTGTTCTGAACTGATATTTGCTCCGATTAATGAGATGTTCCCGGATGATGCTCCACTTGTTCCCTCTGGATTCCGAGTCATACCCGTTGATGCTAAAACGGGAGATGTACAAGATCTGTTAACCGCTAATCACCGTACACTAGACTTAACTTCTAGCCTTGAAGTCGGTCCATCACCTGAGAATGAATCTGGAAACTCTTTTTCTAGCTCAAGCTCGAGATGTATTCTCACTATCGCGTTTCAATTCCCTTTTGAAAACAACTTGCAAGAAAATGTTGCTGGTATGGCTTGCGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGCAATGGCGATCTCACCGTCTGGGATAAGCCCGAGTCTGGGCTCCAAATTGTCCCCAGGATCTCCTGAAGCTGTTACTCTTGCTCAGTGGATCTCTCAAAGTTACAGTCATCACTTAGGCTCGGAGTTGCTGACGATTGATTCACTTGGAAGCGACGACGCTAGCGCATGCCAAGCCATACCAGCAACATTTTCTTGCAAGTTGTTTTCAAAAGGGAATTGAAACGCGATAGTGAGAATACATCTCGAGCTTGAGCTAGAAAAAGAGTTTCCAGAAGCATTCTCAGGTGATGGACCGACTTCAAGGCTAGAAGTTAAGTCTAGTGTACGGTGATTAGCGGTTAACAGATCTTGTACATCTCCCGTTTTAGCATCAACGGGTATGACTCGGAATCCAGAGGGAACAAGTGGAGCATCATCCGGGAACATCTCATTAATCGGAGCAAATATCAGTTCAGAACAAGCTCCAACGGCATTCTCGTCAATCCCGGTACAAATCTGAAGGAGATGGACATCCCGTGACATAAATGCATCTTCTTGAGCAAGAGAATGACCTTCCAGTCTAACAACTTCTAGCATTTCTTCGTGTTCAATTGTATGTCCTAGTGGCATTATGATCTGACTCCCAGTGAATCTTGTTGGTCTCATTCCCGGATAAGCAAAGCTCCGCGG從擬南芥REV獲得的反向重復序列的例子外顯子3-7(SEQ ID NO1的第3670-3743位；等3822-3912位；第4004-4099位；第4187-4300位和第4383-4466位)(SEQID NO145)ATCGATGTTAACGATCCAAGCTGTGAATCTGTGGTCACAACTCCTCAGCATTCGCTTAGAGATGCGAATAGTCCTGCTGGATTGCTCTCAATCGCAGAGGAGACTTTGGCAGAGTTCCTATCCAAGGCTACAGGAACTGCTGTTGATTGGGTTCAGATGCCTGGGATGAAGCCTGGTCCGGATTCGGTTGGCATCTTTGCCATTTCGCAAAGATGCAATGGAGTGGCAGCTCGAGCCTGTGGTCTTGTTAGCTTAGAACCTATGAAGATTGCAGAGATCCTCAAAGATCGGCCATCTTGGTTCCGTGACTGTAGGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGTTCCCGGCTGGTAATGGTGGCACAATCGAGCTTGTTTATATGCAGACGTATGCACCAACGACTCTGGCTCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTTTTGTGCGCGGCCGC連接物(外顯子15)(SEQ ID NO146)GGAGATGTACAAGATCTGTTAACCGCTAATCACCGTACACTAGACTTAACITCTAGCCTTGAAGTCGGTCCATCACCTGAGAATGCTTCTGGAAACTCTTTTTCTAGCTCAAGCTCGAGATGTATTCTCACTATCGCGTTTCAATTCCCTTTTGAAAACAACTTGCAAGAAAATGTTGCTGGTATGGCTTGTCAGTATGTGAGGAGCGTGATCTCATCAGTTCAACGTGTTGCAATGGCGATCTCACCGTCTGGGATAAGCCCGAGTCTGGGCTCCAAATTGTCCCCAGGATCTCCTGAAGCTGTTACTCTTGCTCAGTGGATCTCTCAAAGTTACAGGCTAGCGCATGCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTITTGTGCGCGGCCGC(SEQ ID NO147)CACAAAACTCCCATTGTCGAGGCTCGTTGTGTATCTCAGGGTCCAGAAATCGCGGGCAGGAGCCAGAGTCGTTGGTGCATACGTCTGCATATAAACAAGCTCGATTGTGCCACCATTACCAGCCGGGAACATAGTGAAAACTTCAAGGCTCCTACAGTCACGGAACCAAGATGGCCGATCTTTGAGGATCTCTGCAATCTTCATAGGTTCTAAGCTAACAAGACCACAGGCTCGAGCTGCCACTCCATTGCATCTTTGCGAAATGGCAAAGATGCCAACCGAATCCGGACCAGGCITCATCCCAGGCATCTGAACCCAATCAACAGCAGTTCCTGTAGCCTTGGATAGGAACTCTGCCAAAGTCTCCTCTGCGATTGAGAGCAATCCAGCAGGACTATTCGCATCTCTAAGCGAATGCTGAGGAGTTGTGACCACAGATTCACAGCTTGGATCGTTAACCCGCGG(SEQ ID NO148)實施例III.從蕃茄克隆獲得的構建物(SEQ ID NO148)ATCGATATTGCTGATATCCTCAAAGATCGACCTTCTTGGTTCCGCGACTGCCGGAATGTTGAAGTTATCACAATGTTTCCTGCTGGAAATGGTGGTACAGTTGAGCTTTTGTATACCCAGATATATGCTCCCACAACTCTGGCTCCCGCGCGTGATTTTTGGACGCTGAGATACACAACAACCCTAGACAATGGTAGTCTCGTGGTTTGTGAAAGATCCCTATCTGGTAATGGGCCTGGCCCAAATCCTACTGCTGCTTCCCAGTTTGTAAGAGCTCAAATGCTTCCATCTGGATATCTGATCCGACCGTGTGATGGTGGAGGATC
AATCATACATATTGTTGATCACCTGAATCTTGAGGCATGGAGTGCCCCTGAGATTTTGCGTCCACTCTATGAATCGTCGAAAGTTGTGGCACAGAAAATGACTATTGCAGCACTGCGATATGCAAGGCAACTAGCTCAAGAGACTAGCGGCGAGCGCGGCCGC連接物(SEQ ID NO149)GTAGTATATGGTCTAGGAAGGCAACCTGCTGTTCCTCGAACATTCAGCCAGAGATTATGCAGAGGGTTCAATGATGCCATCAATGGATTCGGTGACGATGGCTGGTCAATGTTAAGTTCAGATGGTGCTGAAGATGTCATAGTTGCTGTCAATTCAAGGAAGAACCTCGCAACCACCTCCATTCCTCTTTCCCCGCTTGGTGGCGTCCTTTGTACCAAAGCATCAATGCTACTCCAGAATGTCCCCCCTGCCGTACTGGTTCGGTTTCTGAGGGAGCACCGTTCAGAATGGGCCGATTATGCTAGCGCATGC(SEQ ID NO150)CTCGCCGCTAGTCTCTTGAGCTAGTTGCCTTGCATATCGCAGTGCTGCAATAGTCATTTTCTGTGCCACAACTTTCGACGATTCATAGAGTGGACGCAAAATCTCAGGGGCACTCCATGCCTCAAGATTCAGGTGATCAACAATATGTATGATTGATCCTCCACCATCACACGGTCGGATCAGATATCCAGATGGAAGCATTTGAGCTCTTACAAACTGGGAAGCAGCAGTAGGATTTGGGCCAGGCCCATTACCAGATAGGGATCTTTCACAAACCACGAGACTACCATTGTCTAGGGTTGTTGTGTATCTCAGCGTCCAAAAATCACGCGCGGGAGCCAGAGTTGTGGGAGCATATATCTGGGTATACAAAAGCTCAACTGTACCACCATTTCCAGCAGGAAACATTGTGATAACTTCAACATTCCGGCAGTCGCGGAACCAAGAAGGTCGATCTTTGAGGATATCAGCAATCCGCGG稻米REV1的IR的例子(SEQ ID NO151)(SEQ ID NO151)ATCGATtggttcatgagaatgcccacatgcgacagcagctgcagaatactccgctggcaaatgatacaagctgtgaatcaaatgtgactacccctcaaaaccctttaagggatgcaagtaacccctctgggctcctttcaattgcagaggagaccttgacagagttcctctcaaaggctactggtacagctattgattgggtccagatgcctgggatgaagcctggtccggattcggttggtattgtggccatttcacatggttgcccgtggtgttgctgccgtgcctgtggtttggtgaacctagaaccaacaaaagtggtagagatattgaaagatcgtccatcttggttccgtgattgtcgaaacctggaagtctttacaatgattccagcaggaaatggaggaacggttgaacttgtctacacacagttgtatgctccaacaactttagttcctgcaCGCGGCCGC連接物(SEQ ID NO152)atgctagggagtagcagtgatggaggtggctatgataaggtttccgggatggactccggtaaatatgtgcgctacacgcctgagcaggtggaggcgcttgagcgggtgtacgccgattgccccaagccaacctcctcccgcaggcagcaattgctgcgtgagtgccccatacttgctaacattgagcccaagcagatcaaGCTAGCGCATGC(SEQ ID NO153)tgcaggaactaaagttgttggagcatacaactgtgtgtagacaagttcaaccgttcctccatttcctgctggaatcattgtaaagacttccaggtttcgacaatcacggaaccaagatggacgatctttcaatatctctaccacttttgttggttctaggttcaccaaaccacaggcacggcagcaacaccacgggcaaccatgtgaaatggccacaataccaaccgaatccggaccaggcttcatcccaggcatctggacccaatcaatagctgtaccagtagcctttgagaggaactctgtcaaggtctcctctgcaattgaaaggagcccagaggggttacttgcatcccttaaagggttttgaggggtagtcacatttgattcacagcttgtatcatttgccagcggagtattctgcagctgctgtcgcatgtgggcattctcatgaaccaCCGCGG稻米REV2的例子(SEQ ID NO154)ATCGATgaatcaaatg tgaccactcc tcagaaccct ctgagagatg caagtaacccgtctggactc cttacaattg cggaggagac cctgacagag ttcctctcca aggctacagggactgctgtt gattgggtgc caatgcctgg gatgaagcct ggtccggatt cgtttggtattgtggccgtt tcacatggtt gccgtggtgt tgctgcccgt gcctgtggtt tggtgaatctagaaccaaca aagatcgtgg agatcttaaa agaccgccca tcttggttcc gtgattgtcgaagtcttgaa gtcttcacaa tgtttccagc tggaaatggt ggcacgatcg aacttgtttacatgcagatg tatgctccta ctactttggt tcctgcacga gatttttgga cacttagatacacaactaca atggatgatg gcagccttgt ggtctgtgagCGCGGCCGC連接物(SEQ ID NO155)ccgcacagca atttgtaaga gctgagatgc ttcctagcggctatctagtg cgcccatgcg agggtggtgg ctccgtcgtg catattgtgg accatctggatcttgaggct tggagtgttc cagaagtgct tcggccactc tacgagtcat ctagggtagttgctcagaaa atgactgctg cagcGCTAGCGCATGC(SEQ ID NO156)ctcacagaccacaaggctgccatcatccattgtagttgtgtatctaagtgtccaaaaatctcgtgcaggaaccaaagtagtaggagcatacatctgcatgtaaacaagttcgatcgtgccaccatttccagctggaaacattgtgaagacttcaagacttcgacaatcacggaaccaagatgggcggtcttttaagatctccacgatctttgttggttctagattcaccaaaccacaggcacgggcagcaacaccacggcaaccatgtgaaacggccacaataccaaacgaatccggaccaggcttcatcccaggcattggcacccaatcaacagcagtccctgtagccttggagaggaactctgtcagggtctcctccgcaattgtaaggagtccagacgggttacttgcatctctcagagggttctgaggagtggtcacatttgattcCCGCGG稻米REV1(SEQ ID NO157)atg ctagggagta gcagtgatgg aggtggctat gataaggttt ccgggatggactccggtaaatatgtgcgct acacgcctga gcaggtggag gcgcttgagc gggtgtacgc cgattgccccaagccaacct cctcccgcag gcagcaattg ctgcgtgagt gccccatact tgctaacattgagcccaagc agatcaaggt ctggttccag aacagaaggt gccgggataa gcagcggaaggagtcttcac ggcttcaggc 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NO173)DCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKFASRLQAXNRKLTAMNKLXMEENERLQKQXSQLVHENAYMKQQLQNPXLGNDTSXESNVTTPQNPLRDASNPSGLLTIAEETLTEFLSKATGTAVDWVPMPGMKPGPDSFGIVAVSHGCRGVAARACGLVNLEPTKIVEILKDRPSWFRDCRSLEVFTMFPAGNGGTIELVYMQMYAPTTLVPARDFWTLRYTTTMEDGSLVVCERSLSGSGGGPSTASAQQFVRAEMLPSGYLVRPCEGGGSIVHIVDHLDLEAWSVPEVLRPLYESSRVVAQKMTTAXVRHIRQIAQETSGEVVYALGRQPAVLRTFSQRLSRGFNDAISGFNDDGWSVMGGDGIEDVIIACNAK嵌合型蛋白質(SEQ ID NO174)(RICEREV1/AT REV)(稻米REV/AT REV)maaavamlgsssdgggydkvsgmdsgkyvrytpeqvealervyadcpkptssrrqqllrecpilaniepkqikvwfqnrrcrdkqrkessrlqavrrkltamnkllmeenerlqkqvsqlvhenahmrqqlqntplandtscesnvttpqnplrdasnpsgllsiaeetlteflskatgtaidwvqmpgmkpgpdsvgivaishgcpwcccracglvnleptkvveilkdrpswfrdcrnlevftmipagnggtvelvytqlyapttlvpardfwtlrytttmedgslvvcerslsgsgggpsaasaqqyvraemlpsgylvrpcegggsivhivdhldleawsvpevlrplyessrvvaqkmttaalrhirqiaqetsgevvyalgrqPavlrtfsqrlsrgfndaisgfnddgwsimggdgvedv/VAINSTKHLNNISNSLSFLGGVLCAKASMLLQNVPPAVLIRFLREHRSEWADFNVDAYSAATLKAGSFAYPGMRPTRFTGSQIIMPLGHTIEHEEMLEVVRLEGHSLAQEDAFMSRDVHLLQICTGIDENAVGACSELIFAPINEMFPDDAPLVPSGFRVIPVDAKTGDVQDLLTANHRTLDLTSSLEVGPSPENASGNSFSSSSSRCILTIAFQFPFENNLQENVAGMACQYVRSVISSVQRVAMAISPSGISPSLGSKLSPGSPEAVTLAQWISQSYSHHLGSELLTIDSLGSDDSVLKLLWDHQDAILCCSLKPQPVFMFANQAGLDMLETTLVALQDITLEKIFDESGRKAICSDFAKLMQQGFACLPSGICVSTMGRHVSYEQAVAWKVFAASEENNNNLHCLAFSFVNWSFVREV中心-1(SEQ ID NO175)GGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGREV中心-2(SEQ ID NO176)AGGCTGCCTTCCTAATCCATREV3′-1(SEQ ID NO177)TGAGGAGCGTGATCTCATCAGREV3′-2(SEQ ID 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權利要求
1.一種分離的DNA分子，它含有編碼由至少約有70％與SEQ ID NO2相同的氨基酸組成的蛋白質的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述編碼的蛋白質具有REV的生物學活性。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述編碼的蛋白質賦予REV表型。
4.如權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述編碼的蛋白質含有至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸相同的氨基酸序列。
5.如權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述編碼的蛋白質含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO159、SEQ ID NO160、SEQ ID NO164、SEQ ID NO171和SEQ IDNO173的氨基酸序列。
6.如權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述多核苷酸序列選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQID NO169、SEQ ID NO170和SEQ ID NO172。
7.一種分離的DNA分子，它含有編碼由至少約有80％與SEQ ID NO2相同的氨基酸組成的蛋白質的多核苷酸。
8.一種分離的DNA分子，它含有與選自SEQ ID NO1的第3670-3743、3822-3912、4004-4099、4187-4300、4383-4466、4542-4697、4786-4860、4942-5048、5132-5306、5396-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6388、6477-6585、6663-6812和6890-7045個核苷酸至少約有80％相同的多核苷酸序列。
9.一種分離的DNA分子，它含有與選自SEQ ID NO187、SEQ ID NO188、SEQ ID NO189、SEQ ID NO190、SEQ ID NO191、SEQ ID NO192、SEQ IDNO193、SEQ ID NO194、SEQ ID NO195和SEQ ID NO196的多核苷酸至少約有80％相同的的多核苷酸。
10.一種分離的DNA分子，它含有編碼由與SEQ ID NO130、SEQ IDNO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO134、SEQ ID NO135、SEQID NO136和SEQ ID NO137至少約有95％相同的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸序列。
11.一種分離的蛋白質，它含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的氨基酸序列。
12.一種分離的蛋白質，它含有至少約有70％與SEQ ID NO2相同的氨基酸序列。
13.如權利要求12所述的蛋白質，其特征在于，它具有與SEQ ID NO2相同的生物學功能。
14.一種載體，它含有復制子和多核苷酸，該多核苷酸含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
15.一種載體，它含有復制子和多核苷酸，該多核苷酸含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質的序列。
16.如權利要求15所述的載體，其特征在于，所述蛋白質由具有SEQ ID NO2的生物學活性的多核苷酸序列編碼。
17.如權利要求15所述的載體，其特征在于，所述蛋白質至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸相同。
18.如權利要求15所述的載體，其特征在于，所述載體還含有與所述多核苷酸異源的啟動子區(qū)域，并且它在植物細胞中具有操作性。
19.如權利要求15所述的載體，其特征在于，所述啟動子區(qū)域可操作性地連接于所述多核苷酸。
20.如權利要求18所述的載體，其特征在于，所述啟動子區(qū)域以組織和/或器官特異性的方式具有活躍的轉錄作用。
21.一種轉化的植物細胞，它含有編碼REVOLUTA蛋白質的轉基因。
22.如權利要求21所述的轉化的植物細胞，其特征在于，所述轉基因含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
23.如權利要求21所述的轉化的植物細胞，其特征在于，所述轉基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質的多核苷酸。
24.如權利要求21所述的轉化的植物細胞，其特征在于，由所述多核苷酸編碼的蛋白質具有SEQ ID NO2的生物學活性。
25.如權利要求24所述的轉化的植物細胞，其特征在于，所述蛋白質至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸相同。
26.一種含有REVOLUTA轉基因的轉基因植物，它含有與未轉化的植物相比其分裂被調節(jié)的細胞。
27.如權利要求26所述的轉基因植物，其特征在于，所述轉基因含有選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ IDNO11的核酸序列。
28.如權利要求26所述的轉基因植物，其特征在于，所述轉基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質的多核苷酸。
29.如權利要求26所述的轉基因植物，其特征在于，由所述多核苷酸序列編碼的蛋白質具有SEQ ID NO2的生物學活性。
30.如權利要求29所述的轉基因植物，其特征在于，所述蛋白質至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸相同。
31.一種調節(jié)植物細胞分裂的方法，它包括將REVOLUTA轉基因導入植物細胞中。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉基因含有選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
33.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質的多核苷酸。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，由所述多核苷酸序列編碼的蛋白質具有SEQ ID NO2的生物學活性。
35.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述蛋白質至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個氨基酸相同。
36.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉基因包含REVOLUTA基因的多核苷酸序列的反向重復序列。
37.如權利要求3 1所述的方法，其特征在于，所述轉基因包含REVOLUTA基因的多核苷酸序列的反義取向序列。
38.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉基因含有REVOLUTA基因的多核苷酸序列的有義取向序列。
39.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉基因是含有從REVOLUTA基因獲得的多核苷酸序列的核糖酶。
40.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述REVOLUTA轉基因在植物細胞中表達，并且該植物細胞與未轉化的植物細胞相比具有調節(jié)的細胞分裂。
41.一種分離REVOLUTA的方法，它包括a)使用正向和反向寡核苷酸引物擴增植物多核苷酸序列，所述引物編碼至少約有70％與SEQ ID NO2的對應氨基酸序列相同的氨基酸序列；b)將所述擴增的植物多核苷酸雜交到重組植物DNA克隆庫中；c)從雜交到所述DNA擴增的植物多核苷酸的重組DNA克隆中分離出DNA分子；d)將含有所述擴增的植物多核苷酸或所述DNA分子的載體轉化到植物細胞中；e)比較轉化植物細胞與未轉化植物細胞，確定轉化植物中的細胞分裂被調節(jié)。
42.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述分離的DNA編碼至少約有70％與SEQ ID NO2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
43.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述分離的DNA在所述轉化的植物中表達為選自有義基因、反義基因、反向重復基因和核糖酶基因的轉基因。
44.如權利要求41所述的方法，其特征在于，通過將所述分離的DNA操作性連接到鄰近異源啟動子序列的位置而使其表達。
45.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述轉化的植物至少有一個器官的細胞數(shù)量比相應的未轉化的植物的器官的細胞數(shù)量多。
46.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述轉化的植物至少有一個器官的細胞數(shù)量比相應的未轉化的植物的器官的細胞數(shù)量少。
47.一種含有嵌合型植物基因的植物，它具有i)在該植物細胞中起作用的啟動子序列；ii)導致編碼調節(jié)植物生長的融合多肽的RNA的產生的編碼序列；iii)編碼多腺苷酸化信號的3′端非翻譯區(qū)域，該多腺苷酸化信號在植物細胞中引起多腺苷酸化核苷酸加到該RNA的3′端；其中，該啟動子與該編碼序列是異源的，并且該啟動子習慣于引起足夠的融合多肽的表達，以調節(jié)轉化了所述基因的植物的生長。
48.一種分離的多核苷酸序列，它含有選自SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQ ID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ IDNO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123和SEQ ID NO125的核酸序列。
49.一種載體，它含有權利要求48所述的多核苷酸。
50.一種使用權利要求49所述的載體轉化的植物。
全文摘要
本發(fā)明提供調節(jié)植物細胞分裂的組合物和方法。具體而言,本發(fā)明提供編碼REVOLUTA的多核苷酸。此外,本發(fā)明也提供了REVOLUTA載體和轉化的植物,其中,相對于未轉化植株的對照種群,轉化植株的細胞分裂被REVOLUTA轉基因的表達所調節(jié)。本發(fā)明還提供從高等植物中分離和鑒別REVOLUTA的方法。
文檔編號C07K14/415GK1423520SQ00818298
公開日2003年6月11日 申請日期2000年11月10日 優(yōu)先權日1999年11月10日
發(fā)明者安·斯雷德, 琳達·麥迪森, 盧卡·科麥 申請人:安·斯雷德, 琳達·麥迪森, 盧卡·科麥