專利名稱：可釋放的鍵和含有該鍵的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種化合物，該化合物含有可斷裂地連接到含胺配體上的親水性聚合物如聚乙二醇，在優(yōu)選實施方案中該含胺配體可以是含胺脂質、藥物或蛋白質。在溫和的硫解條件下該化合物能夠離解，再生成其初始形式的含胺配體。
背景技術：
親水性聚合物，如聚乙二醇(PEG)，已用于修飾各種底物如多肽、藥物和脂質體，以降低底物的免疫原性和/或改善其血液循環(huán)壽命。
例如，蛋白質腸胃外給藥可以是致免疫的，并可能具有短藥理學半衰期。而且蛋白質是較不溶于水的。所以，要使蛋白質在病人體內達到治療有效量的血液水平是困難的。將PEG綴合到蛋白質上被認為是克服這些困難的一種途徑。Davis等在美國專利4,179,337中公開了將PEG綴合到蛋白質如酶和胰島素以形成具有較低免疫原性但仍保持相當程度的生理活性的PEG-蛋白質綴合物。Veronese等(Applied Biochem.和Biotech，11141-152(1985))公開了用氯甲酸苯酯活化聚乙二醇以修飾核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人在美國專利號4,766,106和4,917,888中公開了通過聚合物綴合而增溶蛋白質。PEG和其它聚合物綴合到重組蛋白質上以降低免疫原性和增大半衰期(Nitecki等人，美國專利號4,902,502；Enzon，Inc.，PCT/US90/02133)。Garman(美國專利號4,935,465)描述了用水溶性聚合物修飾的蛋白質，該聚合物通過一種可逆鍵合基團結合到該蛋白質上。
但是，至今所述的PEG-蛋白質綴合物受損于許多缺陷。例如，用PEG修飾蛋白質經常鈍化蛋白質從而使所得綴合物具有不良的生物活性。在現(xiàn)有技術中一般期望具有穩(wěn)定結合到該蛋白質上的PEG以保持PEG提供的有益性能。某些蛋白質-PEG綴合物的另一問題在于分解該綴合物時可能會產生不良的產物。
PEG還被描述用于改善脂質體的血液循環(huán)壽命(美國專利號5,103,556)。這里的PEG共價結合到該脂質的極性頭基團上以掩蔽或屏蔽脂質體免受識別和通過網狀內皮系統(tǒng)被除去。還描述了具有可釋放的PEG鏈的脂質體，其中PEG鏈在受到適宜的刺激如pH的變化時從該脂質體中釋放出來(PCT/US97/18813)。但是，從該脂質體中釋放出PEG鏈受損于該缺陷，即分解產物是化學修飾的并可能具有不可預知的潛在的體內負作用。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種化合物，其中一配體共價而可逆地連接到親水性聚合物上。在斷裂該鍵時再生其天然形式的配體。
在另一方面，本發(fā)明包括具有以下一般結構的化合物 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括含胺配體；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位。
在一個實施方案中，R5為H而R2選自CH3、C2H5和C3H8。在另一實施方案中，R2和R5為烷基。
在另一實施方案中，含胺配體R4選自多肽、含胺藥物和含胺脂質。在一個實施方案中，含胺配體R4為含胺脂質，該脂質包括單烴尾或雙烴尾。在一個優(yōu)選的實施方案中，該脂質為具有雙烴尾的磷脂。
在另一實施方案中，該親水性聚合物R1可選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、它們的共聚物，以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該親水性聚合物R1為聚乙二醇。
在另一個實施方案中，當R1為聚乙二醇時，R5為H而R2為CH3或C2H5。
在另一實施方案中，該含胺配體R4為多肽。在另一實施方案中，該多肽可以是重組多肽。示范性的和優(yōu)選的多肽包括細胞因子如干擾素、白介素、生長因子和酶。
在另一方面，本發(fā)明包括一種組合物，它包含可通過與具有以下一般結構式的化合物的反應而得到的綴合物 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括離去基團；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位。該組合物還包括藥學上可接受的載體如鹽水、緩沖劑等等。
在這方面的另一實施方案中，R2選自CH3，C2H5和C3H8。
在另一實施方案中，R3為O(C＝O)R4而R4為含羥基或含氧的離去基團。在另一實施方案中，該離去基團源于選自氯化物、對硝基苯酚、鄰硝基苯酚、N-羥基-四氫鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基戊二酰亞胺、N-羥基降冰片烯-2，3-二羧基亞胺、1-羥基苯并三唑、3-羥基吡啶、4-羥基吡啶、2-羥基吡啶、1-羥基-6-三氟甲基苯并三唑、咪唑、三唑、N-甲基-咪唑、五氟苯酚、三氟苯酚和三氯苯酚的化合物。
在另一實施方案中，所要求的化合物與代替R4的含胺配體反應形成包括該含胺配體的綴合物。例如該含胺配體可以是磷脂。
在一個優(yōu)選的實施方案中，該親水性聚合物R1為聚乙二醇，R5為H而R2為CH3或C2H5。
在該實施方案的另一方面，含有該綴合物的組合物包括脂質體。該脂質體可以進一步包括截留治療劑。
在另一實施方案中，該含胺配體包括多肽。
在另一方面，本發(fā)明包括含有脂質體的脂質體組合物，該脂質體包括親水性聚合物鏈的表面包被，其中至少一部分親水性聚合物鏈具有一般結構 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括含胺配體；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位。該脂質體與具有通過脂族二硫鍵連接到脂質體上的親水性聚合物鏈的脂質體相比，具有更長的血液循環(huán)壽命。
在另一實施方案中，該脂質體進一步包括截留治療劑。
在另一方面，本發(fā)明包括一種改善具有可釋放親水性聚合物鏈的表面包被脂質體的血液循環(huán)壽命的方法。該方法包括制備具有約1％-約20％的具有以下通式結構的化合物的脂質體 其中R1、R2、R3和R5如以上所述，R4包括含胺脂質。
在這方面的一個優(yōu)選的實施方案中，R5為H而R2選自CH3、C2H5和C3H8。
在另一實施方案中，該含胺脂質包括磷脂而R1為聚乙二醇。
在這方面，該脂質體可以進一步包括截留治療劑。
結合附圖閱讀以下本發(fā)明的詳細描述將更為全面地理解本發(fā)明的這些和其它目的及特征。
附圖的簡要說明

圖1A顯示了本發(fā)明的一個實施方案，其中二硫代芐基(DTB)連接甲氧基-聚乙二醇(mPEG)部分和含胺配體；圖1B顯示了圖1A的化合物硫解斷裂后的產物；圖2說明了合成mPEG-DTB-胺-脂質的合成反應方案，其中該胺-配體為脂質二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)；圖3說明了對二硫代芐基尿烷(DTB)-連接的mPEG-DSPE綴合物的硫解斷裂機理；圖4A-4B顯示了根據本發(fā)明制備mPEG-DTB-DSPE化合物的合成反應方案，其中DTB鍵被烷基位阻；圖5顯示了根據本發(fā)明制備mPEG-DTB-配體化合物的另一合成反應方案；圖6A為合成mPEG-DTB-脂質的合成反應方案，它通過硫解斷裂產生陽離子脂質；圖6B顯示了圖6A的化合物硫解斷裂后的產物；圖7A顯示了鄰mPEG-DTB-DSPE和對mPEG-DTB-DSPE綴合物在溶液中斷裂以單獨在緩沖劑中(鄰綴合物(*)、對綴合物(+))和在150μM的半胱氨酸的存在下(鄰綴合物(空心圓)、對綴合物(空心正方形))產生膠束的速率；圖7B顯示了圖7A所述的膠束mPEG-DTB-DSPE綴合物和在脂質體中形成并在150μM的半胱氨酸的存在下溫育的鄰mPEG-DTB-DSPE(實心圓)和對mPEG-DTB-DSPE(實心正方形)綴合物的斷裂速率；圖8A-8B顯示了在指示濃度的半胱氨酸的存在下溫育的含有DOPE鄰mPEG-DTB-DSPE(圖8A)或DOPE對mPEG-DTB-DSPE(圖8B)的脂質體上釋放的截留熒光團的含量百分率；圖9A顯示了含有DOPE和對mPEG-DTB-DSPE的脂質體的歸一化的截留熒光團釋放百分率對時間的函數。截留熒光團的釋放百分率是相對于不存在半胱氨酸時溫育的脂質體上熒光團的釋放百分率而歸一化的。顯示了在存在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)，1500μM(實心圓)，3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的情況下溫育的脂質體的釋放率；圖9B顯示了含有DOPE和對mPEG-MeDTB-DSPE的脂質體的歸一化的截留熒光團釋放百分率對時間的函數。截留熒光團的釋放百分率是相對于不存在半胱氨酸時溫育的脂質體上熒光團的釋放百分率而歸一化的。顯示了在存在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)，1500μM(實心圓)，3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的情況下溫育的脂質體的釋放率；圖9C顯示了含有DOPE和圖6A的mPEG-meDTB-二硬脂酰-甘油化合物的脂質體的歸一化的截留熒光團釋放百分率對時間的函數。截留熒光團的釋放百分率是相對于在不存在半胱氨酸時溫育的脂質體上熒光團的釋放百分率而歸一化的。顯示了在存在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)，1500μM(實心圓)，3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的情況下溫育的脂質體上斷裂出化合物時染料的釋放率；圖10顯示了在注射含有PHPC∶膽固醇∶mPEG-DTB-DSPE(55∶40∶5摩爾比率)的脂質體的不同時間后的小鼠身上所取血樣中脂質體的數量，以每分鐘計數/ml含有截留In111的脂質體表示。一組動物在時間零(實心正方形)接受200μL注射的200mM半胱氨酸。對照組在時間零(空心圓)時注射鹽水；圖11A顯示了根據本發(fā)明的另一實施方案合成mPEG-DTB-蛋白質化合物的合成反應方案；圖11B顯示了圖11A的化合物硫解斷裂后的分解產物；圖12為與mPEG-MeDTB-氯甲酸硝基苯基酯反應15分鐘(泳道1)或1小時(泳道2)形成mPEG-MeDTB-溶菌酶綴合物的溶菌酶、天然溶菌酶(泳道3)、與mPEG-氯甲酸硝基苯基酯反應1小時的溶菌酶(泳道4)、分子量標志(泳道5)和用2％β-巰基乙醇在70℃下處理10分鐘的泳道1-4的試樣(泳道6-9)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)曲線的示意圖；圖13顯示了mPEG-DTB-p-硝基酰苯胺綴合物硫解斷裂后的分解產物；圖14A顯示了mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺(封閉的菱形)和在體外用5mM半胱氨酸溫育2分鐘(封閉的正方形)、5分鐘(x符號)、10分鐘(空心正方形)、20分鐘(三角形)、40分鐘(空心菱形)和80分鐘(封閉的圓)后的吸光度對波長的函數，單位nm；圖14B顯示了在體外在5mM半胱氨酸(封閉的圓)、1mM半胱氨酸(封閉的正方形)和0.15mM半胱氨酸(封閉的菱形)的存在下溫育的mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺綴合物上釋放的對硝基酰苯胺數量(單位mole/L)對時間(單位分鐘)的函數。
發(fā)明詳述I.定義這里所用的“多肽”指氨基酸聚合物，而不指氨基酸聚合物的具體長度。因此，如術語肽、寡肽、蛋白質和酶包括在多肽的定義范圍內。該術語還包括多肽的表達后修飾如糖基化、乙?；?、磷酸化等等。
“含胺”意指任何這樣的化合物，它們具有通過由烷基或芳基取代一或兩個氫原子得到通式結構RNH2(伯胺)和R2NH(仲胺)而得自氨的部分，其中R為任何烴基。
這里的“親水性聚合物”指具有水溶性部分的聚合物，該水溶性部分賦予該聚合物在室溫下一定程度的水溶性。親水性聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯基甲基醚，聚甲基噁唑啉，聚乙基噁唑啉，聚羥基丙基噁唑啉，聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基-丙烯酰胺，聚羥基丙基甲基丙烯酸酯，聚羥基乙基丙烯酸酯，羥甲基纖維素，羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、上述聚合物的共聚物以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物。在美國專利號5,395,619和5,631,018中描述了這些聚合物中的許多的性質和反應。
“包括反應官能團的聚合物”或“包括用于連接的鍵的聚合物”指已在用于與另一種化合物反應形成共價鍵的末端部分被修飾(通常但不是必需的)的聚合物。官能化聚合物以具有這樣的一個反應官能團部分的反應方案可由本領域技術人員容易地確定和/或已在例如美國專利號5,613,018或由Zalipsky等人在例如Eur.Polymer.J.，19(12)1177-1183(1983)；Bioconj.Chem.，4(4)296-299(1993)所描述。
“重組多肽”中的“重組”意指通過實驗操作將氨基酸結合到期望的序列上。
這里所用的“烷基”意指來源于烷烴，通過從任何碳原子除去氫原子得到的基團“CnH2n+1”。由不分枝的烷烴的末端碳原子上除去氫原子而得到的基團形成了正常烷基(正烷基)的亞組H[CH2]n?；鶊FRCH2-、R2CH-(R不為H)和R3C-(R不為H)分別為伯、仲和叔烷基。
“芳基”指具有單環(huán)(如苯)或兩個稠合環(huán)(如萘基)的取代或未取代的一價芳族基。該術語包括雜芳基，它們是在環(huán)上具有一或多個氮、氧或硫原子的芳環(huán)基，如呋喃基、吡咯、吡啶基和吲哚。“取代”指該芳基上的一或多個環(huán)氫被鹵化物如氟、氯或溴取代；被含一或兩個碳原子的低級烷基取代；被硝基、氨基、甲氨基、二甲氨基、甲氧基、鹵甲氧基、鹵甲基或鹵乙基取代。
“脂族二硫化物”鍵指R′-S-S-R″形式的鍵，其中R′和R″為可被進一步取代的直鏈或支鏈烷基鏈。
這里采用以下的縮寫PEG，聚(乙二醇)；mPEG，甲氧基-PEG；DTB，二硫代芐基；MeDTB，甲基-二硫代芐基；EtDTB，乙基-二硫代芐基；DSPE，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；DOPE，二油酰磷脂酰乙醇胺；PHPC，部分氫化的磷脂酰膽堿；MALDI-TOFMS，基體輔助激光解吸/電離時間飛行質譜。
II.本發(fā)明化合物在一方面，本發(fā)明包括下式的化合物 其中R1包括一種親水性聚合物，該親水性聚合物含有適宜將該聚合物共價結合到二硫代芐基部分的官能團。R2和R5獨立地選自H、烷基或芳基，并可見它可變化以配合二硫化物的斷裂速率。例如，為了獲得更快的斷裂速率，R2和R5為氫。通過為R2和R5之一或兩者選擇烷基或芳基對二硫化物進行位阻而獲得較慢的斷裂速率。R3包括與R4連接的連接部分，它包括含胺配體。在優(yōu)選的實施方案中，該連接部分為O(C＝O)、S(C＝O)或O(C＝O)。該含胺配體R4可以是伯或仲胺并可以選自任何數量的底物，包括但不限于脂質、藥物、多肽、病毒、生物材料的表面和氨基糖苷。在優(yōu)選的實施方案中，R4為含伯或仲胺的脂質、藥物或多肽。在本發(fā)明的化合物中，基團CH2-R3的取向可以是鄰或對位。
圖1A顯示了本發(fā)明的示范化合物的結構，其中R1為親水性聚合物甲氧基-聚乙二醇、mPEG＝CH3O(CH2CH2O)n，其中n為約10-約2300，其對應的分子量為約440道爾頓-約100,000道爾頓。該聚合物的分子量在一定程度上取決于R3的選擇。在R3為用于脂質體的含胺脂質的實施方案中，優(yōu)選的PEG分子量范圍為約750-約10,000道爾頓，更優(yōu)選為約2,000-約5,000道爾頓。該實施方案中的mPEG包括尿烷連接部分。在R3為含胺多肽的實施方案中，優(yōu)選的PEG分子量范圍為約2,000-約40,000道爾頓，更優(yōu)選為約2,000-約20,000道爾頓?？梢岳斫?，R1可選自各種親水性聚合物，而示范性的聚合物如上述。還可以理解，對某些配體如多肽，聚合物的分子量可取決于結合到該配體上的聚合物鏈的數量，其中在結合的聚合物鏈數量較小時通常選擇更大分子量的聚合物。
繼續(xù)參照圖1a，在該示范性化合物中的R2和R5為H，但是R2和R5之一或二者還可以是直鏈或支鏈烷基或芳基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R5為H而R2為烷基，以下給出一些實施例。在圖1A所示的化合物中，R3取通式O(C＝O)-(NH2-配體)，其中該NH2-配體可以是任何含胺多肽、藥物或脂質，以下給出各實施方案的特定實施例。R3還可以是式O(C＝S)-(NH2-配體)或S(C＝O)-(NH2-配體)。
圖1B顯示了圖1A的mPEG-DTB-(NH2-配體)化合物的硫解斷裂的機理。氨基甲酸鄰或對二硫代芐基酯部分在溫和的硫解條件下如在半胱氨酸或其它天然還原劑的存在下可斷裂。在斷裂時，含胺配體再生其天然的未修飾的形式。以下所述的支持本發(fā)明的研究表明天然的體內生理學條件足以引發(fā)和實現(xiàn)DTB鍵的斷裂?？紤]該還原劑還可給藥至足以斷裂和分解該化合物的人工誘發(fā)硫解條件。
如上述，R3的一般形式為連接部分，如結合到含胺配體上的O(C＝O)、S(C＝O)或O(C＝S)。在優(yōu)選的實施方案中，該含胺配體包括含胺多肽、藥物或脂質?，F(xiàn)在將描述這些實施方案的實施例A.含胺脂質在一個實施方案中，該含胺配體為含胺脂質。這里所指的脂質意指具有至少一個含有至少約8個碳原子的?；?，更優(yōu)選含約8-24個碳原子的酰基鏈的不溶于水的分子。優(yōu)選的脂質為具有含胺極性頭基團和酰基鏈的脂質。示范性的脂質為具有單?；?如硬脂酰胺)或兩個酰基鏈的磷脂。優(yōu)選的具有含胺頭基團的磷脂包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸。該脂質尾部可以具有約12-約24個碳原子，并可以是完全飽和或不飽和的。一種優(yōu)選的脂質為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，但是本領域技術人員將考慮落在該說明書范圍內的大量脂質。還考慮該脂質可天然地包含胺基或可以衍生為包括胺基。其它不具?；膊康闹|部分如膽固醇胺也是合適的。
聚合物-DTB-脂質化合物的合成如圖2的圖示。通過2-(甲氧基羰基二硫代)乙烷胺與mPEG-氯甲酸酯的反應而制得具有甲氧基羰基二硫代烷基末端基團的mPEG衍生物(MW 2000和5000道爾頓)，該mPEG-氯甲酸酯已通過光氣化干燥的mPEG-OH溶液(Zalipsky，S.，等人，Biotechnol.Appl.Biochem.15100-114(1992).)制得。根據公開的方法(Brois，S.J.，等人，J.Amer.Chem.Soc.927629-7631(1970)；Koneko，T.，等人，Bioconjugate Chem.2133-141(1991))，通過2-氨基乙硫醇鹽酸鹽與等量的甲氧基羰基硫化氯的反應得到前一化合物。巰基芐基醇的對和鄰位異構體(Grice，R.，等人，J.Chem.Soc.1947-1954(1963))都干凈地與所得的PEG-連接的?；蚧锱己?，得到含有二硫代芐基醇末端基團的mPEG?；钚蕴妓猁}的引入與采用未衍生的mPEG-OH一樣進行，得到對硝基苯基碳酸酯。在乙醇胺中加入DSPE形成期望的mPEG-DTB-DSPE產物。通過硅膠色譜制備和純化鄰和對DTB-脂質化合物，用NMR和MALDI-FOFMS進行表征，其具體情況由實施例1給出。
圖3顯示了mPEG-DTB-DSPE綴合物的硫解斷裂機理。在斷裂時，磷脂酰乙醇胺脂質再生其天然、未修飾的形式。
圖4A-4B顯示了用于合成具有與二硫鍵(例如更受阻的二硫鍵)相鄰的烷基的mPEG-DTB-DSPE綴合物的反應方案。如在實施例2A中更為全面的描述，二氯甲烷中的mPEG-OH在三乙胺(TEA)的存在下與氯甲酸對硝基苯基酯反應形成mPEG-碳酸硝基苯基酯。氨基醇如在二甲基甲酰胺(DMF)中的1-氨基-2-丙醇或1-氨基-2-丁醇在TEA的存在下與mPEG-碳酸硝基苯基酯反應形成連接到PEG上的仲醇。然后將該仲醇轉化為期望的如圖4A所示的以在實施例2A中所述的mPEG-DTB-DSPE化合物。
在該反應方案中，mPEG-甲基-二硫代苯基-氯甲酸硝基苯基酯與DSPE反應形成期望的化合物。在該mPEG-甲基-二硫代苯基-氯甲酸硝基苯基酯化合物中的氯甲酸硝基苯基酯部分作為離去基團在與選擇的脂質反應時產生期望的產物。本發(fā)明在另一方面構想了一種組合物，它包括通過與化合物如mPEG-甲基-二硫芐基-R3的反應而產生的化合物其中R3代表通過連接部分連接到苯環(huán)上的離去基團。該離去基團在與含胺配體如DSPE、多肽或含胺藥物反應時被取代。該離去基團的選擇根據配體中胺的反應性，并優(yōu)選來自各種具有含羥基或含氧的離去基團的酸性醇。它們包括氯化物、對硝基苯酚、鄰硝基苯酚、N-羥基-四氫鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基-戊二酰亞胺、N-羥基降冰片烯-2，3-二羧基亞胺、1-羥基苯并三唑、3-羥基吡啶、4-羥基吡啶、2-羥基吡啶、1-羥基-6-三氟甲基苯并三唑、咪唑、三唑、N-甲基-咪唑、五氟苯酚、三氟苯酚和三氯苯酚。
實施例2B描述了mPEG-EtDTB-脂質綴合物的制備，其中的二硫鍵被乙基部分位阻。
圖5顯示了根據本發(fā)明制備mPEG-DTB-配體化合物的另一合成反應方案。該反應過程的細節(jié)在實施例3A-3B中給出。簡言之，冷1-氨基-2-丙醇與硫酸反應形成硫酸2-氨基-1-甲基乙基氫酯。該產物在含水乙醇中與二硫化碳和氫氧化鈉反應形成5-甲基噻唑烷-2-硫酮。往該5-甲基噻唑烷-2-硫酮中加入鹽酸水溶液并加熱。在回流一周后，結晶并回收產物1-巰基(甲基)乙基氯化銨。產物與甲氧基羰基硫化氯反應得到2-(甲氧基羰基二硫代)乙烷胺。采用上述圖2的方法進行的2-(甲氧基羰基二硫代)乙烷胺與mPEG-氯甲酸酯的反應獲得期望mPEG-DTB-硝基苯基化合物，該化合物適于與選擇的含胺配體反應形成本發(fā)明的化合物。
實施例3B描述了合成mPEG-(乙基)DTB硝基苯基的反應。
圖6A顯示了根據本發(fā)明的制備另一種mPEG-DTB-脂質化合物的反應方案。該反應的細節(jié)由實施例4提供。將脂質1，2-二硬脂酰-sn-甘油活化以與按圖4A或圖5所述制備的mPEG-DTB-硝基苯基反應。所得的mPEG-DTB-脂質與上述化合物不同之處在于缺乏磷酸酯頭基團。圖6A的mPEG-DTB-脂質在斷裂前為中性。如在圖6B中所示，在硫解還原該二硫鍵時，該化合物分解形成陽離子脂質。帶正電的脂質在體內提供靜電相互作用并同樣有助于在體內的靶向。
在上述的反應方案中，所要求的化合物的R5為H。但是，在另一實施方案中，R5為烷基或芳基部分。例如，在該方法中，R2和R5都為CH3部分，α，β-未飽和的?；?R’R”C＝CHCOCl，其中R’為例如CH3而R”為CH3，但可考慮任何烷基或芳基)與胺結尾的PEG反應得到對應的N-PEG-取代的α，β-未飽和的酰胺。該化合物與硫羥乙酸反應，通過將綴合物加到C＝C鍵上而得到對應的N-PEG-取代的β-(乙酰硫基)酰胺。將該乙酰硫基(-SCOCH3)水解成硫羥基(-SH)，然后與甲基(氯亞磺酰)甲酸酯(CISCOOCH3)反應，產生甲氧基羰基二硫基(-SSCOOCH3)；然后將該中間產物與對巰基芐基醇反應得到N-PEG-取代的β-(二硫代芐基醇)酰胺(具有結構PEG-NH-CO-CH2CR’R”-SS-p-苯基-CH2OH)。然后將該芐基醇部分與氯甲酸硝基苯基酯反應得到上述的碳酸硝基苯基酯離去基團。
1.mPEG-DTB-DSPE化合物的體外斷裂通過在緩沖的水溶液(pH7.2)中制備化合物的膠束溶液來研究鄰mPEG-DTB-DSPE和對mPEG-DTB-DSPE(按實施例1所述制備)的體外斷裂。如實施例5所述，在存在和不存在150μM半胱氨酸下通過HPLC分析該化合物的消失來監(jiān)測該化合物的硫解斷裂。結果如在圖7A中所示，其中鄰和對位化合物在不存在半胱氨酸(分別為*符號和+符號)下沒有顯示出斷裂并在這些條件下在不存在半胱氨酸時表現(xiàn)穩(wěn)定。圖7A中顯示了鄰和對位化合物在存在150μM半胱氨酸下的斷裂，分別由空心圓和空心正方形表示。該鄰位化合物表現(xiàn)出比對位對應物稍快的分解速率(T1/2≈12分鐘對≈18分鐘)。
2.含有mPEG-DTB-脂質化合物的脂質體組合物a.體外表征在一個實施方案中，將mPEG-DTB-脂質化合物制成脂質體。脂質體為封閉的脂質囊，用于各種治療目的，特別是通過脂質體的系統(tǒng)給藥而攜帶治療劑至靶區(qū)域或細胞。具體而言。具有親水性聚合物鏈如聚乙二醇(PEG)的表面包被的脂質體為期望的藥物載體，因為這些脂質體與缺少該聚合物包被的脂質體相比延長了血液循環(huán)壽命。該聚合物包被中的聚合物鏈屏蔽了脂質體并形成該脂質體的水溶劑化聚合物鏈周圍的“剛性刷”。因此，該聚合物用作血液蛋白質的屏障，防止蛋白質的結合和脂質體的識別而被巨噬細胞和其它網狀內皮系統(tǒng)細胞攝取和除去。
具有聚合物鏈的表面包被的脂質體一般通過在脂質混合物中包含約1-約20摩爾百分率的由該聚合物衍生的脂質而制得。聚合物衍生的脂質的實際數量可以更高或更低，取決于該聚合物的分子量。在本發(fā)明中，通過往其它脂質體脂質雙層組分中加入約1-約20摩爾百分率的聚合物-DTB-脂質綴合物而制備脂質體。如在以下的研究中所示，本發(fā)明的含有聚合物-DTB-脂質綴合物的脂質體比含有聚合物-脂質綴合物，且其中的聚合物和脂質通過可斷裂的脂肪族二硫鍵結合的脂質體具有更長的血液循環(huán)壽命。
在支持本發(fā)明的研究中，如在實施例6中所述制備包括成囊脂質部分氫化的磷脂酰膽堿和膽固醇以及鄰mPEG-DTB-DSPE或對mPEG-DTB-DSPE化合物的脂質體。在存在和不存在處于含水緩沖劑的150μM半胱氨酸下監(jiān)測半胱氨酸介導的mPEG-DTB-DSPE化合物的斷裂。結果如圖7B所示，它包括圖7A的數據以進行比較。在圖7B中，不存在半胱氨酸(分別為*符號和+符號)下，膠束形式鄰和對位化合物沒有顯示斷裂，它表明該綴合物在不存在硫醇時的穩(wěn)定性?？招膱A和空心正方形分別對應于上面圖7A所討論的在存在半胱氨酸下膠束形式的鄰和對位化合物。實心圓和實心正方形分別對應于在半胱氨酸的存在下的脂質體形式的鄰和對位化合物。
圖7B中的數據表明鄰和對位化合物在被摻到脂質體中時稍微更耐受硫解斷裂。硫解反應產物的TLC(硅膠G，氯仿/甲醇/水90∶18∶2)(Dittmer，J.C.，等人，J.lipid Res.5126-127(1964))檢查表明DSPE是唯一的脂質組分而另一點對應于含硫醇、不含脂質的mPEG衍生物。
在支持本發(fā)明的另一研究中，由脂質二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)制得脂質體并制得鄰mPEG-DTB-DSPE或對mPEG-DTB-DSPE化合物。DOPE為六角形相脂質，它單獨不形成脂質囊。但是，當DOPE與少量摩爾百分率的mPEG-DTB-DSPE化合物結合時將形成脂質體。mPEG-DTB-DSPE化合物的斷裂引發(fā)脂質體的分解和脂質體-截留含量的釋放。因此，這種脂質體的含量釋放特征為可斷裂的含PEG的脂質體提供了一種方便的定量評價。
如實施例7A所述采用截留熒光團、對二甲苯-雙-溴化吡啶鎓和8-羥基芘三磺酸三鈉制得含有DOPE和鄰或對mPEG-DTB-DSPE化合物的脂質體。如實施例7B所述監(jiān)測在各種濃度的半胱氨酸的存在下溫育的脂質體上的熒光團的釋放。
含有鄰位化合物的脂質體的結果如圖8A所示，其中顯示了在15μM(實心菱形)、150μM(實心反轉的三角形)、300μM(實心三角形)和1.5mM(實心圓)濃度的半胱氨酸的存在下溫育的脂質體上的截留熒光團的含量釋放百分率。圖8B為含有對位化合物的脂質體的類似的圖形，其中在15μM(實心菱形)、300μM(實心三角形)、1μM(實心正方形)和1.5mM(實心圓)濃度的半胱氨酸中溫育該脂質體。
圖8A-8B顯示了鄰和對位化合物在被摻到脂質體內時都斷裂，它可由速度取決于半胱氨酸濃度的截留染料的釋放來證明。用含有不可斷裂的mPEG-DSPE的脂質體的對照研究沒有產生含量釋放(這里沒有顯示結果)。這些結果還表明鄰位綴合物某種程度上更易于硫解斷裂，例如，300μM的半胱氨酸在20分鐘內釋放出絕大部分含量的DOPE脂質體。在同一條件下，只有部分具有對mPEG-DTB-DSPE的脂質體分解。類似地，在150μM的半胱氨酸下溫育20分鐘后，含有鄰位化合物的脂質體釋放出半數的截留含量，而含有對位化合物的脂質體只有約10％的含量釋放。鄰位和對位化合物的半衰期在半胱氨酸水平為150μM時都小于20分鐘(見圖7B中的數據)。這表明半數以上的最初三摩爾百分率的mPEG-DTB-脂質必須斷裂以從脂質體上觀測含量釋放。
mPEG-DTB-DSPE/DOPE脂質體在15μM的半胱氨酸中的分解、人和嚙齒動物身上的平均血漿濃度(Lash，L.H.，等人，Arch.Biochem.Biophys.240583-592(1985))在這些實驗的時間范圍內(60分鐘)最小。這表明mPEG-DTB-脂質化合物在血漿中應具有足夠長的壽命以使PEG移植囊在體內的系統(tǒng)分布或在特定的部位被動地或通過配體介導的靶向蓄積。半胱氨酸濃度的局部或短期增大可由其靜脈內的或動脈內給藥有效地實現(xiàn)。圖8A-8B所示的結果還表明延長與天然血漿半胱氨酸濃度(≈15μM)的接觸將足以分解大部分的這些化合物。在體內實驗中研究這些建議，并如下所示。
在另一支持本發(fā)明的研究中，制備含有DOPE和三種不同mPEG-DTB-脂質化合物的脂質體。該脂質體如實施例7所述制備并包括和截留熒光團。三種mPEG-DTB-脂質化合物為圖1A中所示的mPEG-DTB-DSPE、圖4B中所示的mPEG-MeDTB-DSPE，其中R為CH3，和圖6A中所示的mPEG-MeDTB-二硬脂酰甘油。該脂質體含有97摩爾百分率的DOPE和3摩爾百分率的一種mPEG-DTB-脂質化合物。在各種半胱氨酸濃度下通過監(jiān)測截留熒光團的釋放作為時間的函數而測定由半胱氨酸介導的該化合物的斷裂速率。結果如在圖9A-9C中所示，其中截留熒光團的釋放百分率相對于在單獨在緩沖劑中溫育的脂質體的釋放速率進行歸一化。
圖9A顯示了含有DOPE和對mPEG-DTB-DSPE(圖1A的化合物)的脂質體的截留熒光團的釋放百分率作為時間的函數。顯示了含有該綴合物并在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)、1500μM(實心圓)、3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的存在下溫育的脂質體上的釋放率。
圖9B顯示了含有DOPE和對mPEG-MeDTB-DSPE(圖4B的化合物)的脂質體的截留熒光團的釋放百分率作為時間的函數。顯示了在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)、1500μM(實心圓)、3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的存在下溫育的脂質體上熒光團的釋放率。
圖9C為采用DOPE和mPEG-MeDTB-二硬脂酰甘油(圖6A的化合物)制成的脂質體的類似的圖形。顯示了在15μM(實心正方形)、75μM(空心三角形)、150μM(X符號)、300μM(空心圓)、1500μM(實心圓)、3000μM(+符號)和15000μM(空心菱形)濃度的半胱氨酸的存在下溫育的脂質體上染料的釋放率。
圖9A-9C表明mPEG-MeDTB-脂質斷裂的速率取決于半胱氨酸濃度，由截留熒光的釋放表明在15-75μM的半胱氨酸濃度下的斷裂速度緩慢。對比圖9A和圖9B中的數據，表明mPEG-MeDTB-DSPE化合物(圖9B)的斷裂比mPEG-DTB-DSPE化合物(圖9A)約慢10倍。因此，可以根據DTB鍵中的R部分(見圖2)調節(jié)斷裂的速率。
b.體內表征在小鼠身上測定如在實施例8所述制備并包括本發(fā)明的聚合物-DTB-脂質綴合物的脂質體的血液循環(huán)壽命。將In111截留在脂質體內并通過靜脈內注射給予該脂質體。一組受試動物額外接受注射半胱氨酸，對照組動物額外接受注射鹽水。在各時間處取血樣并分析脂質體的存在，這種存在由In111的存在來證明。
圖10顯示了結果，其中顯示了每分鐘In111的計數(CPM)作為作為注射脂質體和鹽水(空心圓)或200mM半胱氨酸(實心正方形)后的時間的函數?？梢?，mPEG-DTB-DSPE在暴露于天然生理條件下發(fā)生斷裂，這由在給予脂質體后用鹽水處理的小鼠的組中的斷裂來證明。對小鼠給予外源性還原劑、半胱氨酸有效地增大在約2-約8小時的時間范圍內mPEG-DTB-脂質化合物的斷裂速率。
重要的是，本發(fā)明聚合物-DTB-脂質化合物的斷裂導致再生初始的未修飾形式的脂質。這是期望的，因為非天然的、修飾的脂質可能具有不期望的體內作用。同時該化合物在不存在還原劑的情況下儲存時穩(wěn)定。
在這里沒有顯示的其它研究中，對比了含有mPEG-DTB-脂質的脂質體和含有聚合物-脂質綴合物的脂質體的血液循環(huán)壽命，在含有聚合物-脂質綴合物的脂質體中，聚合物和脂質通過可斷裂的脂肪族二硫鍵結合。脂肪族二硫鍵容易在體內斷裂，而具有通過脂肪族二硫化物移植到其表面的聚合物鏈的脂質體的血液循環(huán)壽命一般不具有在含穩(wěn)定連接的聚合物鏈的脂質體上觀察到的延長的血液循環(huán)壽命。本發(fā)明的二硫醇芐基鍵，尤其是更受阻的DTB鍵在體內更穩(wěn)定且與具有通過脂肪族二硫鍵結合的聚合物鏈的脂質體相比獲得了更長的血液循環(huán)壽命。
B.含胺多肽在另一實施方案中，本發(fā)明包括圖1A所述的化合物，其中該含胺配體為多肽。圖11A顯示了表明制備聚合物-DTB-多肽的合成反應方案，其中mPEG作為示范性的聚合物。一般而言，根據上述圖2、4A和5中所述的合成途徑之一制備mPEG-DTB-離去基團化合物。該離去基團可以是碳酸硝基苯基酯或上述其它之任一種。該mPEG-DTB-碳酸硝基苯基酯化合物通過尿烷鍵偶聯(lián)到多肽中的胺部分。與化合物中的二硫化物鄰近的R基團可以是H、CH3、C2H5等等，并可根據所期望的二硫化物斷裂速率來選擇。
圖11B顯示了在化合物的半胱氨酸介導的斷裂時的分解產物?？梢娞烊坏鞍踪|(沒有修飾其蛋白質胺基)在斷裂時發(fā)生再生。
聚合物鏈如PEG與多肽的連接經常減小多肽的酶或其它生物活性，例如受體結合。但是，多肽的聚合物修飾增加了多肽的血液循環(huán)壽命。在本發(fā)明中，給予受試者聚合物修飾的多肽。由于聚合物修飾的多肽循環(huán)，接觸生理還原條件如血液半胱氨酸和其它體內硫醇引發(fā)了多肽上聚合物鏈的斷裂。在聚合物鏈從多肽上釋放時，逐漸地恢復多肽的生物學活性。通過這種方式，多肽最初具有足夠的用于生物分布的血液循環(huán)壽命，并在聚合物鏈斷裂時在一定期間內恢復其全部生物活性。
在一個支持本發(fā)明的研究中，溶菌酶用作模型多肽，并通過與上述類似的合成途徑制備了mPEG-MeDTB-溶菌酶綴合物。在0.1M硼酸鹽中，在pH9和2∶1的碳酸硝基苯基酯與溶菌酶的氨基的比率下溫育該溶菌酶。在反應15分鐘和3小時后，由SDS-PAGE表征試樣。通過在相同的條件下溶菌酶與mPEG-碳酸硝基苯基酯綴合物反應60分鐘制備對比化合物，它將形成穩(wěn)定的mPEG-溶菌酶綴合物。
圖12顯示了SDS-PAGE凝膠的示意圖。泳道1對應于在溶菌酶與mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯反應15分鐘后形成的化合物，而泳道2對應于在同樣的化合物反應1小時后形成的化合物。泳道3代表天然溶菌酶而泳道4對應于與mPEG-碳酸硝基苯基酯反應1小時的溶菌酶。從上向下泳道5中分子量標記如下
比較泳道1和泳道2表明，更長的反應時間導致化合物分子量的增大，并與在更長的溫育時間內綴合到多肽上的其它mPEG鏈一致。
SDS-PAGE曲線的泳道6-9對應于在70℃下用2％β-巰基乙醇處理10分鐘后的泳道1-4中的試樣。mPEG-MeDTB-溶菌酶綴合物在與還原劑接觸后分解再生天然溶菌酶，這可由在14.4kDa處的泳道6和7中的帶證明。與此相對照，在用還原劑溫育時并不影響穩(wěn)定的mPEG-溶菌酯化合物，這可由泳道9和泳道4曲線上的一致性證明。
從SDS-PAGE曲線還是清楚可見的是，mPEG-MeDTB與蛋白質的共價結合形成含有各種mPEG-蛋白質比率的綴合物的混合物。該比率取決于反應時間和條件。它可由觀察泳道1和2上的帶而清楚可見，其中泳道1表示由約1-6個PEG鏈衍生的溶菌酶。在泳道2中，更長的反應時間獲得具有更高mPEG-蛋白質比率的mPEG-MeDTB-溶菌酶綴合物。所有可斷裂的綴合物易于斷裂再生天然蛋白質，這可由泳道6和7上的帶表明。
考慮使用上述的任何親水性聚合物。該聚合物分子量的選擇取決于多肽、多肽上反應性胺的數量和期望的該聚合物修飾的化合物的大小。
考慮使用的多肽是非限制性的并可以是天然或重組產生的多肽。優(yōu)選小的人重組多肽，并優(yōu)選范圍為10-30KDa的多肽。示范性的多肽包括細胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)、白介素和干擾素、紅細胞生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、酶等等。還考慮病毒多肽，其中將該病毒的表面修飾為包括一或多種通過DTB可逆鍵連接的聚合物鏈。修飾含有用于細胞轉染的基因的病毒將延長病毒的循環(huán)時間并減小它的免疫原性，借此改善外源性基因的遞送。
C.含胺藥物在本發(fā)明的另一實施方案中，考慮聚合物-DTB-含胺藥物形式的化合物。該化合物的結構如上所述，尤其是根據圖1A所述，其中該圖中的含胺配體為含胺藥物。用PEG修飾治療藥物有效地改善藥物的血液循環(huán)壽命并減少任何免疫原性。
根據上述任一反應方案制備聚合物-DTB-含胺藥物，其中為特定的藥物提供必要的修飾。大量的治療藥物具有反應性胺部分，如絲裂霉素C、博萊霉素、阿霉素和環(huán)丙氟哌酸，且本發(fā)明無限制性地考慮這些藥物中任一種。還可考慮本發(fā)明還用于含有醇或羧基部分的藥物。在該藥物含有適于反應的羥基或羧基部分的情況下，該聚合物-DTB部分可以通過尿烷、酯、醚、硫醚或硫酯鍵連接到藥物上。在所有這些實施方案中，該聚合物-DTB-藥物化合物在體內給藥后硫解分解而再生天然的活性形式的含胺藥物，在修飾后和給藥前的化合物的治療活性不是必需的。因此，在給藥和從藥物上斷裂DTB-聚合物之后用DTB-聚合物修飾該藥物導致治療活性的減小或喪失的情況下，再次得到該藥物的活性。
在支持本發(fā)明的研究中，如圖13所示，藥物硝基酰苯胺與mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯反應形成mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺化合物。該化合物在與還原劑接觸時分解產生圖中所示的產物，其中該藥物對硝基酰苯胺再生未修飾的狀態(tài)。
在體外在含有5mM半胱氨酸的緩沖劑中溫育該mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺化合物，并在圖14A中顯示了在各時間處提取的試樣的吸光度。在圖中可見在以下時間點處測得的試樣時間零(封閉的菱形)、2分鐘(封閉的正方形)、5分鐘(x符號)、10分鐘(空心正方形)、20分鐘(三角形)、40分鐘(空心菱形)和80分鐘(封閉的圓)。UV光譜的變化作為在半胱氨酸中溫育時間的函數是明顯的，它顯示了半胱氨酸介導的mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺化合物上對硝基酰苯胺的釋放。
圖14B顯示了在5mM半胱氨酸(封閉的圓)、1mM半胱氨酸(封閉的正方形)和0.15mM半胱氨酸(封閉的菱形)的存在下溫育的mPEG-MeDTB-對硝基酰苯胺綴合物上釋放的對硝基酰苯胺的數量，單位mole/L。綴合物上的藥物釋放速率取決于存在的還原劑的濃度。
根據前述可以看出如何滿足本發(fā)明的各種目的和特征。本發(fā)明的化合物包括通過芐基尿烷鍵的鄰或對位二硫化物而可逆地結合到親水性聚合物上的含胺配體。該鍵在接受溫和硫解條件時斷裂再生初始的未修飾形式的含胺配體?？梢酝ㄟ^該鍵中二硫化物的立體位阻和/或通過體內的硫解條件的控制來控制斷裂的速率。在二硫代芐基鍵斷裂前提供具有增大的血液循環(huán)壽命、改善的穩(wěn)定性和降低的免疫原性的化合物。
III.實施例以下的實施例進一步例舉了這里所述發(fā)明，并不意圖以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
材料所有的材料商購自合適的銷售商，如Aldrich公司。
實施例1合成mPEG-DTB-DSPE將mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯(300mg，0.12mmol，1.29eq)溶于CHCl3(3ml)。往PEG-溶液中加入DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5eq)，并在50℃(油浴溫度)下攪拌。15分鐘后，TLC表明反應沒有完全。然后每10分鐘后加入兩部分的TEA(10μl，和20μl)和若干部分mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯(50mg，30mg，10mg)，直至反應完全。蒸發(fā)溶劑。將反應混合物溶于MeOH，并加入1g C8二氧化硅。再次蒸發(fā)溶劑。將含有C8二氧化硅的產物加到柱頂部，并用以下溶劑洗脫MeOH∶H2O梯度(壓力)、MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml(起始物質洗脫)；MeOH∶H2O＝75∶25＝40ml；MeOH∶H2O＝80∶20，80ml(洗脫產物)；MeOH∶H2O＝85∶15，40ml；MeOH∶H2O＝90∶10，40ml；MeOH＝40ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml。合并含純產物的部分并蒸發(fā)得到無色濃液體產物。向其加入叔丁醇(5ml)，凍干并在P2O5上真空干燥得到產物，為白色蓬松固體(252mg，89％產率)。
鄰和對DTB-DSPE化合物通過硅膠色譜法(甲醇梯度0-10％在氯仿中，≈70％分離產率)純化，并由NMR和MALDI-TOFMS確定其結構。(對位綴合物的1H NMR(d6-DMSO，360MHz)δ0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，脂質的CH2，56H)，1.57(m，CH2CH2CO2，4H)，2.50(2xt，CH2CO2，4H)，2.82(t，CH2S，2H)，3.32(s，OCH3，3H)，3.51(m，PEG，≈180H)，4.07(t，PEG-CH2OCONH，2H)，4.11 & 4.28(2 x dd甘油的CH2CH，2H)，4.98(s，芐基-CH2，2H)，5.09(m，脂質的CHCH2)，7.35 & 7.53(2 x d，芳基，4H)ppm。該鄰位綴合物的不同僅在于芐基和芳基信號在5.11(s，CH2，2H)，和7.31(d，1H)，7.39(m，2H)7.75(d，1H)ppm處。
MALDI-TOFMS產生以相同的44Da間隔分隔的離子的分布，對應于環(huán)氧乙烷重復單元?；衔锏钠骄肿恿繉τ趯ξ缓袜徫划悩嬻w而言分別為3127和3139Da(理論分子量≈3100Da)。
反應方案如圖2中所示。
實施例2合成mPEG-DTB-DSPEA.mPEG-MeDTB-DSPE
該反應方案如圖4A-4B所示。用甲苯(總體積為270ml，250ml通過Dean-Stark法蒸餾出)共沸干燥mPEG(5K)-OH(40g，8mmol)。將二氯甲烷(100ml)加到mPEG-OH中。在4℃下(冰水)將氯甲酸對硝基苯基酯(2.42g，12mmol，1.5eq)和TEA(3.3ml，24mmol，3eq)加到PEG溶液，同時小心防止?jié)駳狻Ｐ纬蓽\黃色TEA鹽酸鹽。15分鐘后移去冷卻浴，在室溫下將反應混合物攪拌過夜。TLC表明(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)反應完全。蒸發(fā)溶劑。將殘留物溶于乙酸乙酯(50℃)。濾去TEA鹽酸鹽并用溫熱乙酸乙酯洗滌。蒸發(fā)溶劑并用異丙醇重結晶產物(三次)。產量38.2g(92％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ3.55(s，PEG，450H)；4.37(t，PEG-CH2，2H)；7.55(d，C6H5，2H)；8.31(d，C6H5，2H)。
將1-氨基-2-丙醇(1.1ml，14.52mmol，3eq)和TEA(2.02ml，14.52mmol，3eq)加到在DMF(60ml)和CH2Cl2(40ml)中的mPEG(5K)-碳酸硝基苯基酯(25g，4.84mmol)。它是一種黃色清澈溶液。室溫下攪拌反應混合物30分鐘。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑(二氯甲烷)。往DMF(60ml)中的產物混合物中加入異丙醇(250ml)。產物立即沉淀，然后用iPrOH重結晶(三次)。產量22.12g(90％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.98(d，CH3CH(OH)CH2，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.03(t，PEG-CH2，2H)；4.50(d，CH3CHOH，1H)；7.0(t，mPEG-OCONH)。
用甲苯(45ml)共沸干燥mPEG(5K)-尿烷-2-甲基丙醇(22.12g，4.34mmol)。往其加入二氯甲烷(60ml)。0℃下將甲烷磺酰氯(604.6μl，7.81mmol，1.8eq)和TEA(3.93ml，28.21mmol，6.5eq)加到mPEG-溶液，同時保持攪拌并小心防濕氣。30分鐘后移去冷卻浴并在室溫下攪拌反應混合物16小時。蒸發(fā)溶劑。加入乙酸乙酯除去TEA鹽。產物用異丙醇重結晶(三次)。產量20.27g(90％)。1HNMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.27(d，CH3CHOSO2CH3，3H)；3.162(s，CH3O2SOCH，3H)；3.50(s，PEG，180H)；4.07(t，PEG-CH2，2H)；4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.43(t，mPEG-OCONH)。
將mPEG(5K)-尿烷-2甲基-甲烷砜(10.27g，1.98mmol)與甲苯(每次20ml)共沸干燥。0℃下將氫化鈉(377mg，9.4mmol，4.75eq)加到無水甲苯(60ml)中(在冰水中)。5分鐘后，三苯基甲烷硫醇(3.92g，14.6mmol，7.15eq)加到該溶液。10分鐘后，將mPEG-尿烷-2-甲基-甲烷砜(10.27gm，1.98mmol)加到反應混合物。它成為黃色溶液。45分鐘后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)表明反應完全。往該反應混合物中加入乙酸(445.57μl，7.42mmol，3.75eq)以中和過量的氫化鈉。該溶液變稠和發(fā)白。蒸發(fā)溶劑并用乙酸乙酯(30ml)和異丙醇(70ml)重結晶固體。反應混合物沒有完全溶解而被濾出。然后用異丙醇/叔丁醇(100ml/20ml)重結晶產物混合物。產量8.87g(84％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.74(d，CH3CHSC(C6H5)3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.0(t，PEG-CH2，2H)，4.64(q，CH3CHOH，1H)；7.49(t，mPEG-OCONH)；7.20-7.41(m，SC(C6H5)3，15H)。
0℃下將mPEG(5K)-尿烷-2甲基-三苯基甲烷硫醇(8.87g，1.65mmol)溶于TFA/CH2Cl2(10ml/10ml)。劇烈攪拌下將甲氧基羰基硫化氯(185.5μl，1.99mmol，1.2eq)加到該溶液。室溫下攪拌反應混合物15分鐘。TLC(CHCl3∶MeOH＝90∶10)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑。用異丙醇∶叔丁醇(80ml∶20ml)重結晶產物混合物兩次。往該產物中加入叔丁醇(5ml)，然后凍干并在P2O5上真空干燥得到產物，為白色蓬松固體(8.32g，97％產率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSCOOCH3，3H)；3.42(s，PEG，180H)；3.84(s，CH3OCOSSCH，3H)；4.05(t，mPEG-CH2，2H)；7.38(t，mPEG-OCONH，1H)。
將mPEG(5K)-尿烷乙基(甲基)二硫代羰基甲醇鹽(8.32g，1.6mmol)溶于干甲醇(20ml)和氯仿(2.5ml)。往該PEG-溶液中加入在干甲醇(2ml)中的巰基芐基醇溶液(592mg，4mmol，2.5eq)。室溫下攪拌反應混合物18小時。蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml重結晶產物混合物(3次)。NMR表明形成16％的產物。因此在0℃(冰水)下將另一部分在MeOH(2ml)中的巰基芐基醇(322mg，2.18mmol，1.8eq)滴加到在MeOH/CHCl3(24ml/1ml)中的產物混合物。完成加入(10分鐘)后，除去冰浴，并在室溫下攪拌反應混合物24小時。TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑，然后用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml重結晶產物混合物。產量7.25g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.56(d，CH3CHSSC6H5CH2OH，3H)；3.29(CH3O-PEG，3H)；3.50(s，PEG，450H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.46(d，HOCH2C6H5，2H)；5.16(t，HOCH2C6H5，1H)；7.30(d，C6H5，2H)；7.40(br t，mPEG-OCONH，1H)；7.50(d，C6H5，2H)。
將mPEG(5K)-尿烷-乙基(甲基)-二硫代芐基醇(6.75g，1.27mmol)溶于CHCl3(30ml)。0℃(冰水)往其加入氯甲酸對硝基苯基酯(513mg，2.54mmol，2eq)。5分鐘后加入三乙胺(531μl，3.81mmol，3eq)。30分鐘后除去冰浴，室溫下攪拌反應混合物過夜。蒸發(fā)溶劑。將產物混合物溶于乙酸乙酯。濾出TEA鹽，然后蒸發(fā)溶劑。隨著用乙酸乙酯/異丙醇，30ml/100ml重結晶該產物混合物(三次)。產量6.55g(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ1.17(d，CH3CHSSC6H5，3H)；3.24(CH3O-PEG，3H)；3.40(s，PEG，180H)；4.03(br t，mPEG-CH2，2H)；5.28(S，C6H5CH2OCO，2H)；7.45-8.35(m，C6H5)2，8H)。
將mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯(766mg，0.14mmol，1.29eq)溶于CHCl3(5ml)。將DSPE(70mg，0.093mol)和TEA(58.5μl，0.42mmol，4.5eq)加到PEG-溶液，并在50℃(油浴溫度)下攪拌。20分鐘后，TLC表明反應未完全。加入更多的mPEG-MeDTB-碳酸硝基苯基酯(共計1239mg，0.23mmol，2.47eq)和1-羥基苯并三唑(HOBt)(25mg，0.19mmol，2eq)。20分鐘后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，有鉬和茚三酮)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑。將產物混合物溶于溫(42℃)乙酸乙酯。它是混濁的溶液(TEA鹽沉淀)。過濾該溶液并蒸發(fā)溶劑。往產物混合物中加入MeOH和2g的C8二氧化硅。再次蒸發(fā)溶劑。將含有C8二氧化硅的產物加到柱頂，并用以下溶劑洗脫MeOH∶H2O梯度(壓力)，MeOH∶H2O 30∶70，100ml；MeOH H2O 50∶50，100ml；MeOH H2O 70∶30，250ml(起始物質洗脫)；MeOH H2O 75∶25＝40ml；MeOH H2O 80∶20，200ml(洗脫產物)；MeOH＝100ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，100ml；CHCl3∶MeOH H2O＝75∶36∶6，100ml。合并含有純凈產物的部分并蒸發(fā)得到無色濃稠液體產物。向其加入叔丁醇(5ml)、凍干然后在P2O5上真空干燥得到白色蓬松固體產物(467mg，83％產率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.83(d，2(CH3)，3H)；1.16(d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.21(s，28(CH2，56H)；1.47(brm，CH2CH2CO，4H)；2.23(2 x t，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.05(反式d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.24(順式d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.97(s，C6H5CH2OCO-DSPE，2H)；5.03(brs，(PO4CH2CH，1H)；7.32(d，C6H5，2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.52(br s，mPEG-OCONH，1H)。MALDI-TOFMS產生以相同44Da間隔分隔的鐘狀離子的分布，對應于環(huán)氧乙烷重復單元。該綴合物和mPEG-硫醇(大部分斷裂的二硫化物)的平均分子量為6376和5368Da(理論分子量6053和5305道爾頓)。
B.mPEG-乙基DTB-DSPEmPEG-尿烷乙基(乙基)二硫代羰基甲醇鹽(2g，0.90mmol)溶于干甲醇(8ml)。溶液開始時混濁，但5分鐘后變?yōu)槌吻迦芤骸€基芐基醇(265.2mg，1.79mmol，2eq)加到該PEG-溶液。室溫下攪拌該反應混合物30小時。將乙醚(70ml)加到該反應溶液以沉淀出產物，在4℃下保持過夜。過濾該白色固體并用乙酸乙酯/乙醚，30ml/70ml重結晶。產量1.96g，(94％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.86(d，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，3H)；1.42(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；1.64(p，CH3CH2CHSSC6H5CH2OH，1H)；3.51(s，PEG，180H)；4.03(t，mPEG-CH2，2H)；4.47(d，HOCH2C6H5，2H)；5.20(t，HOCH2C6H5，1H)；7.31(d，C6H5，2H)；7.42(br t，mPEG-OCONH，1H)；7.49(d，C6H5，2H)。
在50℃(油浴溫度)下將N-羥基-s-降冰片烯-2，3-二羧酸亞胺(HONB)(48mg，0.269mmol)加到CHCl3(3ml)中的DSPE(55mg，0.073mmol)。3-4分鐘后，它變?yōu)槌吻迦芤?。然后加入mPEG-EtDTB-氯甲酸硝基苯基酯(334mg，0.134mmol)，隨后加入三乙胺(TEA，45μl，0.329mmol)。20分鐘后，TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2)表明反應完全(鉬和茚三酮噴霧)。蒸發(fā)溶劑。將產物混合物溶于甲醇，與C8二氧化硅(1g)混合，并通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑。將固體殘留物加到C8-柱頂，然后用以下溶劑洗脫MeOH∶H2O梯度(壓力)，MeOH∶H2O＝30∶70，60ml；MeOH∶H2O＝50∶50，60ml；MeOH∶H2O＝70∶30，140ml；MeOH∶H2O＝75∶25＝140ml(起始物質洗脫)；MeOH-H2O＝80∶20，80ml；MeOH∶H2O＝90∶10，140ml(洗脫產物)；MeOH＝40ml；CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml。合并含有純產物的部分并蒸發(fā)得到無色濃稠液體產物。加入叔丁醇(5ml)、凍干、然后在P2O5上真空干燥得到白色蓬松固體產物(175mg，78％產率)。1HNMR(DMSO-d6，360MHz)δ0.85(d，2(CH3)，6H；d，CH3CHSSC6H5，3H)；1.22(s，28(CH2)，56H)；1.49(br m，CH2CH2CO，4H)；2.24(2 x t，CH2CH2CO，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(br t，mPEG-CH2，2H)；4.08(反式d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.27(順式d，PO4CH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO-DSPE，2H)；5.06(br s，(PO4CH2CH，1H)；7.34(d，C6H5，2H)；7.53(d，C6H5，2H)；7.55(br s，mPEG-OCONH，1H)。
實施例3合成mPEG-DTB-氯甲酸硝基苯基酯A.合成1-(巰基甲基)乙基氯化銨的方法1. 2-氨基-1-甲基乙基硫酸氫酯。在冰浴中劇烈攪拌1-氨基-2-丙醇(22.53g，0.3mol)。在1小時內非常緩慢地加入硫酸(16.10ml，0.3mol)。在燒瓶中形成濃蒸汽和非常稠的溶液。在完成加入后，在170℃～180℃下與室內真空連接進行減壓加熱。在加熱時，反應物變淺褐色。在除去所有的水后(大約1小時)，冷卻至室溫。在冷卻時形成褐色、玻璃狀固體，它在用甲醇研制時可結晶。在60℃的水(50ml)中溶解它。加入足量的溫甲醇而制得80％甲醇溶液。在冷卻時，形成晶體，然后過濾晶體并在P2O5上干燥。產量17.17g(37％)。1HNMR(D6-DMSO)δ1.16(d，CH3，3H)；δ2.78(dd，NH3-CH2，1H)；δ2.97(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.41(m，CH-OSO3，1H)；δ7.69(s，H3N，3H)。熔點248°-250℃(lit250℃)2. 5-甲基噻唑烷-2-硫酮。在250ml圓底燒瓶內在50％含水乙醇(40ml)中攪拌2-氨基-1-甲基乙基硫酸氫酯(23.03g，148mmol)和二硫化碳(10.71ml，178mmol，1.2eq.)。向其非常緩慢地滴加入在50％含水乙醇(50ml)中的氫氧化鈉(13.06g，327mmol，2.2eq.)。在加入氫氧化鈉時，將所有的起始物質溶解，溶液變橙色?；亓鞣磻?85℃)40分鐘，此后溶液變?yōu)榱咙S色并形成濃稠沉淀。蒸發(fā)乙醇，然后加熱該含水溶液，隨后通過布氏漏斗過濾除去所有水溶性雜質。將殘留的結晶溶于溫乙醇，然后加入溫水直至溶液含80％的水。將混合物冷卻，然后離心，得到長針狀晶體。產量14.64g(75％)。1H NMR(D6-DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ3.50(m，R3CH，1H)；δ3.95(dd，N-CH2，1H)；δ4.05(m，N-CH2，1H)；δ10.05(s，NH，1H)。熔點92.5-93.5(lit94-95)。
3. 1-(巰基甲基)乙基氯化銨。將5-甲基噻唑烷-2-硫酮(6.5g，49mmol)置于250ml圓底燒瓶。加入含水鹽酸溶液(40ml，18％在H2O中)并在油浴中加熱該燒瓶。將反應物回流(120℃)一周。在整周內三次加入1ml濃鹽酸。采用以乙酸乙酯作為洗脫劑的TLC監(jiān)測反應。采用UV、茚三酮和碘蒸汽可視檢驗。在幾乎整周的時間反應物為不均勻的混合物，其中油狀起始物質比水濃。一周后油狀起始物質消失，雖然在TLC仍可見。不再加熱反應物并將其冷卻至室溫，然后冷凍至結晶起始物質。過濾結晶的起始物質。蒸發(fā)濾液并在P2O5和NaOH上干燥除去所有的水和HCl。用兩部分的二乙醚(每次50ml)洗滌粗產物以除去所有的起始物質。再次在P2O5上干燥。產量2.83g(45％)。1H NMR(D6DMSO)δ1.33(d，CH3，3H)；δ2.92(m，N-CH2，2H)；δ3.12(m，SH，1H)；δ3.18(m，R3-CH，1H)；δ8.23(bs，NH3，3H)。熔點80-82℃(lit92-94)。
反應方案如圖5所示。
B.合成mPEG-乙基-DTB-氯甲酸硝基苯基酯1. 2-氨基-1-乙基乙基硫酸氫酯。在100ml的圓底燒瓶中在冰浴內劇烈攪拌1-氨基-2-丁醇(15ml，158mmol)。在1小時內非常緩慢地加入硫酸(8.43ml，158mmol)。在該燒瓶中形成濃蒸汽和非常稠的溶液。在添加完成后，在170和180℃之間在連接室內真空的減壓下加熱反應物。在加熱時反應物變淺褐色。除去所有的水后(大約1小時)，將其冷卻至室溫。在冷卻時形成褐色、玻璃狀固體。將其溶于熱水(50ml)，然后將其冷凍放置過夜。在冷卻時，形成結晶然后過濾并在P2O5上干燥。產量9.98g(37％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.87(t，CH3，3H)；δ1.51(q，CH3-CH2，2H)；δ2.82(dd，NH3-CH2，1H)；δ3.00(dd，NH3-CH2，1H)；δ4.21(m，CH-OSO3，1H)；δ7.70(s，H3N，3H)。
2. 5-乙基噻唑烷-2-硫酮。在100ml圓底燒瓶內在50％含水乙醇(15ml)中攪拌2-氨基-1-乙基-乙基硫酸氫酯(9.98g，59mmol)和二硫化碳(4.26ml，71mmol，1.2eq.)。向其非常緩慢地滴加在50％含水乙醇(20ml)中的氫氧化鈉(5.20g，130mmol，2.2eq.)。在加入氫氧化鈉時，將所有的起始物質溶解，溶液變橙色。將反應物回流(85℃)40分鐘，隨后溶液變?yōu)榱咙S并形成濃稠沉淀。蒸發(fā)乙醇，然后加熱含水溶液，隨后通過布氏漏斗過濾除去所有水溶性雜質。將殘留晶體溶于溫乙醇，然后加入溫水直至溶液含80％水。將混合物冷卻然后離心，得到針狀晶體。產量7.28g(86％)。1H NMR(D6-DMSO)δ0.88(t，CH3，3H)；δ1.66(in，CH3-CH2，2H)；δ3.58(m，R3CH，1H)；δ3.93(m，N-CH2，2H)；δ10.06(s，NH，1H)。熔點76-78°(lit76.6-76.9)。
3. 1-(巰基乙基)乙基氯化銨。將5-乙基噻唑烷-2-硫酮(7.24g，50mmol)置于250ml圓底燒瓶。加入含水鹽酸溶液(45ml，18％在H2O中)并在油浴中加熱燒瓶。在加熱時，起始物質熔化，形成不均勻的混合物。將反應物回流(120℃)一周。在整周內四次加入1ml濃鹽酸。采用以乙酸乙酯作為洗脫劑的TLC監(jiān)測反應。采用UV、茚三酮和碘蒸汽可視檢驗。在整周的時間反應物為不均勻的混合物，其中油狀起始物質比水濃。不再加熱反應物并將其冷卻至室溫，然后冷凍至結晶起始物質。過濾結晶的起始物質。蒸發(fā)濾液并在P2O5和NaOH上干燥除去所有的水和HCl。用兩部分的二乙醚(每次50ml)洗滌粗產物以除去所有的起始物質。再次在P2O5上干燥。產量3.66g(52％).1H NMR(D6-DMSO)該反應方案如圖5所示。
實施例4合成mPEG-DTB-脂質將1，2-二硬脂酰-sn-甘油(500mg，0.8mmol)與苯共沸干燥(3次)。將氯甲酸對硝基苯基酯(242mg，1.2mmol，1.5eq)、二甲基氨基吡啶(DMAP)(10mg，0.08mmol，0.1eq)和TEA(334.5μl，2.4mmol，3eq)加到在CHCl3(5ml)中的1，2-二硬脂酰甘油。室溫下將反應混合物攪拌2h。TLC(甲苯∶乙酸乙酯＝7∶3)表明反應完全。然后用10％檸檬酸提取產物混合物以除去二甲基氨基吡啶(DMAP)，用乙腈(3ml，4次)洗滌以除去過量的氯甲酸對硝基苯基酯。在P2O5上真空干燥純產物。產量557mg(88％).％)。1H NMR(CHCl3，360MHz)δ0.88(t，end CH3，6H)；1.25(s，28xCH2，56H)；1.58(m，CH2CH2CO，4H)；2.34(2xt，CH2CO，4H)；4.22(反式d，CH2OCOC17H35，1H)；4.35(m，OCOOCH2CH，2H)；4.51(順式d，CH2OCOC17H35，1H)；5.37(m，OCOOCH2CH，1H)；7.39(d，C6H5，2H)；8.28(d，C6H5，2H)。
將乙二胺(42μl，0.63mmol，5倍過量)和吡啶(200μl)加到CHCl3(1ml)。將2-二硬脂酰-sn-碳酸對硝基苯基酯(100mg，0.13mmol)溶于CHCl3(1ml)并在0℃(冰水)下用巴斯德移液管滴加到乙二胺溶液并持續(xù)過夜(16小時)。TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O 90∶18∶2，和CHCl3∶MeOH＝90∶10)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑除去吡啶。然后將產物混合物溶于CHCl3，裝載到柱上(Aldrich，硅膠，60°A，200-400目)，并用以下溶劑洗脫CHCl3∶CH3COCH3，和CHCl3∶MeOH梯度，CHCl3∶CH3COCH3＝90∶10，60ml(upper spot eluted)；CHCl3∶NeOH＝90∶10，60ml(洗脫產物)。合并含有純產物的部分并蒸發(fā)。加入叔丁醇并在P2O5上真空干燥。產量64mg(75％)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δ.83(t，終點CH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.51(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2xt，CH2CO，4H)；2.83(m，H2NCH2CH2NH，2H)；3.21(m，H2NCH2CH2NH，2H)；4.10-4.14(m & 順式d，COOCH2CHCH2，4H)；5.17(m，OCOOCH2CH，1H)；7.78(m，H2NCH2CH2NH，2H)。
將mPEG-MeDTB-氯甲酸硝基苯基酯(400mg，0.162mmol，2.2eq)溶于CHCl3in(2ml)。將1，2-硬脂?；?sn-亞乙胺(51mg，0.075mmol)和TEA(37μl，0.264mmol，3.52eq)加到溶液。然后在45℃下將反應混合物攪拌20分鐘。TLC(CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶2，和CHCl3∶MeOH＝90∶10)表明反應完全。蒸發(fā)溶劑。將產物混合物溶于甲醇。加入2g的C8二氧化硅然后蒸發(fā)溶劑。將含有產物混合物的C8二氧化硅加到C8柱頂((Supelco，Supel clean.Lot no.SP0824)，用以下溶劑洗脫MeOH∶H2O梯度(壓力)、MeOH∶H2O＝60∶40，40ml、MeOH∶H2O＝70∶30，80ml(起始物質洗脫)、MeOH∶H2O＝80∶20，40ml、MeOH∶H2O＝90∶10＝20ml、CHCl3∶MeOH∶H2O＝5∶80∶15，20ml、CHCl3∶MeOH∶H2O＝90∶18∶10，40ml(產物洗脫)。合并含有純產物的部分并蒸發(fā)得到無色濃稠液體產物。加入叔丁醇(5ml)并凍干溶液，然后在P2O5上真空干燥得到白色固體產物(200mg，89％產率)。1H NMR(DMSO-d6，360MHz)δδ.83(t，endCH3，6H)；1.22(s，28xCH2，56H)；1.48(m，CH2CH2CO，4H)；2.25(2 x t，CH2CO，4H)；3.10(m，HNCH2CH2NH，4H)；3.50(s，PEG，180H)；4.04(t，mPEG-CH2，2H)；4.09(反式d，COOCH2CHCH2，1H)；4.25(順式d，COOCH2CHCH2，1H)；4.98(s，C6H5CH2OCO，2H)；5.23(m，COOCH2CHCH2，1H)；7.18(m，NHCH2CH2NH，2H)；7.33(d，C6H5，2H)；7.38(m，mPEG-OCONH，1H)；7.52(d，C6H5，2H)。
該反應方案如圖6A所示。
實施例5體外斷裂mPEG-DTB-DSPE化合物將鄰mPEG-DTB-DSPE和對mPEG-DTB-DSPE(如實施例1所述制備)在存在和不存在150μM半胱氨酸下加到緩沖的含水溶液(pH7.2)。HPLC(Phenomenex C8 Prodigy，4.6×50mm柱，在277nm處檢測，流動相甲醇/水95∶5和0.1％三氟乙酸，流速1mL/min)監(jiān)測到綴合物消失。結果如圖7A所示，其中鄰綴合物由空心圓表示而對綴合物由空心正方形表示。
實施例6體外斷裂脂質體中的鄰和對mPEG-DTB-DSPE化合物A.脂質體制備將部分氫化的脂質磷脂酰膽堿(PHPC)、膽固醇和鄰或對mPEG-DTB-DSPE(如實施例1所述制備，mPEG MW＝1980道爾頓)以95∶5∶3的摩爾比率分別溶于適宜的有機溶劑，一般為1∶1或1∶3比率的氯仿/甲醇。通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑形成干燥的脂質薄膜。用含水緩沖劑水合該薄膜，通過擠壓到120nm平均直徑的大小形成脂質體。
B.體外表征在37℃、pH7.2、含有5mM EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水中，在150μM半胱氨酸的存在下溫育脂質體。HPLC(Phenomenex C8Prodigy，4.6×50mm柱，在277nm處檢測，流動相甲醇/水95∶5和0.1％三氟乙酸，流速1mL/min)監(jiān)測到綴合物消失。結果如圖7B所示，其中含有鄰綴合物的脂質體由實心圓表示而含對綴合物的脂質體由實心正方形表示?？招膱A和空心正方形對應于膠束形式的鄰mPEG-DTB-DSPE和對mPEG-DTB-DSPE(如以上在實施例5所討論，圖7A)。
實施例7體外斷裂脂質體中的鄰和對mPEG-DTB-DSPE化合物A.脂質體制備將脂質二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和鄰或對mPEG-DTB-DSPE(如實施例1所述制備，mPEG Mw＝1980道爾頓)以97∶3的摩爾比率溶于氯仿/甲醇1∶1。通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑形成干燥的脂質薄膜。用含有各30mM的每種熒光團對二甲苯-雙-溴化吡啶鎓和8-羥基芘三磺酸三鈉的含水溶液水合該脂質薄膜。用含水緩沖劑水合該薄膜，通過擠壓到100nm平均直徑的大小形成脂質體。
B.體外表征在37℃、pH7.2的HEPES緩沖劑中，在15μM、150μM、300μM和1.5mM濃度的半胱氨酸的存在下溫育脂質體。測定染料的釋放百分率作為高于預溫育的試樣(零釋放)的試樣熒光(λem＝512nm，λem＝413nm-pH-獨立性等消光點)的增長，將這些試樣歸一化為在用0.2％的Triton X-100溶解預溫育的試樣后得到的熒光增長(100％釋放)(Kirpotin，D.等人，F(xiàn)EBS Letters，388115-118(1996))。各種半胱氨酸濃度下的含鄰位化合物脂質體的結果如圖8A所示，含對位化合物的脂質體的結果如圖8B所示。
實施例8體內表征含有mPEG-DTB-DSPE化合物的脂質體A.脂質體制備將部分氫化的脂質磷脂酰膽堿(PHPC)、膽固醇和對mPEG-DTB-DSPE(如實施例1所述制備，mPEG MW＝1980道爾頓)以55∶40∶5的摩爾百分比率分別溶于有機溶劑。通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑形成干燥的脂質薄膜。用含有二亞乙基三胺五乙酸(EDTA)的含水緩沖劑水合該薄膜形成脂質體。將脂質體小型化至平均直徑為120nm，然后除去未截留的EDTA并往外部介質中加入In111。將脂質體溫育充足的時間以使In111穿過脂質雙層和與EDTA螯合。
B.體內給藥將小鼠分成兩個研究小組。將上述的脂質體組合物注射進所有的受試動物。一組受試動物還在脂質體注射后的1、3和5小時接受200μL注射的200mM半胱氨酸。另一受試組在相同的時間點接受注射鹽水。通過監(jiān)測血樣中的In111來測定血液中脂質體的含量。結果如圖10所示。
雖然已描述了本發(fā)明的特定實施方案，但對本領域技術人員來說顯然可以在不背離本發(fā)明的情況下進行各種改變和修正。
權利要求
1.具有以下一般結構的化合物 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括含胺配體；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位。
2.權利要求1的化合物，其中R5為H而R2選自CH3、C2H5和C3H8。
3.根據權利要求1或2的化合物，其中該含胺配體R4選自多肽、含胺藥物和含胺脂質。
4.根據權利要求1或2的化合物，其中該含胺配體R4為包括單烴尾或雙烴尾的含胺脂質。
5.權利要求4的化合物，其中該含胺脂質為具有雙烴尾的磷脂。
6.根據權利要求1、3、4或5任一項的化合物，其中R2和R5為烷基。
7.根據前述權利要求任一項的化合物，其中R1選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、它們的共聚物，以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷。
8.根據權利要求1-6任一項的化合物，其中R1為聚乙二醇。
9.權利要求8的化合物，其中R5為H而R2為CH3或C2H5。
10.含有前述權利要求任一項的化合物的脂質體。
11.根據權利要求1、2、7、8或9任一項的化合物，其中該含胺配體R4為多肽。
12.權利要求11的化合物，其中該多肽為重組多肽。
13.權利要求11的化合物，其中該多肽為細胞因子。
14.權利要求11的化合物，其中該多肽選自干擾素、白介素、生長因子和酶。
15.一種組合物，它含有可通過與具有以下結構通式的化合物的反應而得到的綴合物 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括離去基團；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位；和藥學上可接受的載體。
16.權利要求15的組合物，其中R2選自CH3、C2H5和C3H8。
17.權利要求15的組合物，其中R3為O(C＝O)R4而R4為含羥基或含氧的離去基團。
18.權利要求15的組合物，其中該離去基團來源于選自以下的化合物氯化物、對硝基苯酚、鄰硝基苯酚、N-羥基-四氫鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基戊二酰亞胺、N-羥基降冰片烯-2，3-二羧基亞胺、1-羥基苯并三唑、3-羥基吡啶、4-羥基吡啶、2-羥基吡啶、1-羥基-6-三氟甲基苯并三唑、咪唑、三唑、N-甲基-咪唑、五氟苯酚、三氟苯酚和三氯苯酚。
19.權利要求15的組合物，其中該化合物與代替R4的含胺配體反應形成包括該含胺配體的綴合物。
20.權利要求19的組合物，其中該含胺配體包括磷脂。
21.權利要求19的組合物，其中該含胺配體包括多肽。
22.根據權利要求20或21的組合物，其中R1選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、它們的共聚物，以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷。
23.根據權利要求20或21的組合物，其中R1包括聚乙二醇。
24.根據權利要求23的組合物，其中R2為CH3或C2H5。
25.權利要求20的組合物，其中含有該綴合物的組合物包括脂質體。
26.權利要求25的組合物，其中該脂質體進一步包括截留治療劑。
27.權利要求21的組合物，其中該多肽包括重組多肽。
28.權利要求21的組合物，其中該多肽包括細胞因子。
29.權利要求21的組合物，其中該多肽選自干擾素、白介素、生長因子和酶。
30.一種脂質體組合物，包括含有親水性聚合物鏈的表面包被的脂質體，其中至少一部分的親水性聚合物鏈具有以下一般結構 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括含胺配體；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位，其中，該脂質體與具有通過脂族二硫鍵連接到脂質體上的親水性聚合物鏈的脂質體相比，具有更長的血液循環(huán)壽命。
31.權利要求30的組合物，其中R5為H而R2選自CH3，C2H5和C3H8。
32.根據權利要求30或31的組合物，其中該含胺脂質包括磷脂。
33.根據權利要求30-32任一項的組合物，其中其中R1選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、它們的共聚物，以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷。
34.根據權利要求30-32任一項的組合物，其中R1包括聚乙二醇。
35.根據權利要求30-34任一項的組合物，其中該脂質體進一步包括截留治療劑。
36.一種改善具有可釋放親水性聚合物鏈的表面包被的脂質體的血液循環(huán)壽命的方法，包括制備含約1％-約20％的具有以下一般結構的化合物的脂質體 其中R1為含有用于連接到二硫代芐基部分的鍵的親水性聚合物；R2選自H、烷基和芳基；R3選自O(C＝O)R4、S(C＝O)R4和O(C＝S)R4；R4包括含胺脂質；而R5選自H、烷基和芳基；其中CH2-R3的取向選自鄰位和對位。
37.權利要求36的方法，其中R5為H而R2選自CH3、C2H5和C3H8。
38.根據權利要求36或37的方法，其中該含胺脂質包括磷脂。
39.根據權利要求36-38任一項的方法，其中R1選自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基噁唑啉、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基-丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺、它們的共聚物，以及聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷。
40.根據權利要求36-38任一項的方法，其中R1包括聚乙二醇。
41.根據權利要求36-40任一項的方法，其中該脂質體進一步包括截留治療劑。
全文摘要
描述了一種含有通過二硫代芐基鍵共價但可逆地連接到含胺配體上的親水性聚合物的化合物。
文檔編號C07D239/47GK1355713SQ00807707
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月21日 優(yōu)先權日1999年4月23日
發(fā)明者S·扎里普斯基 申請人:阿爾薩公司