專利名稱：一種槲寄生糖蛋白提取物及含有該提取物的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體來說涉及一種槲寄生屬植物糖蛋白提取物，該提取物是分子量為1萬-10萬道爾頓的糖蛋白，它具有較強的抗腫瘤活性；本發(fā)明還涉及該提取物的制備方法和含有該提取物的藥物組合物。
寄生是屬于桑寄生科(Loranthaceae)半寄生在喬木、灌木等不同的植物上，其中有槲寄生屬和桑寄生屬，而槲寄生屬中又包括槲寄生又稱北寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai.)、白果槲寄生(V.album)、扁枝槲寄生(V.articulatum Burm.f.)、棱枝槲寄生(V.diospyrosicolum Hayata)等13種，目前，已有文獻報道歐洲槲寄生(Viscum album L.)即白果槲寄生和朝鮮槲寄生(V.album varcoloratum)即白果槲寄生一種變種的提取物具有抗腫瘤活性。目前德國數(shù)家公司生產(chǎn)以歐洲槲寄生提取物為主要活性成分的制劑產(chǎn)品主要用于抗腫瘤的臨床治療。由于這些產(chǎn)品多為粗制劑，其中含有多種植物成分，除含有主要活性成分歐寄生糖蛋白外，還含有對人體有害的毒肽和小分子蛋白質(zhì)。盡管如此，還沒有文獻報道槲寄生(Viscumcoloratum(Kom.)Nakai.)糖蛋白提取物用于抗腫瘤的治療。本發(fā)明人通過對中國的槲寄生屬進行廣泛的研究，最后從槲寄生(Viscumcoloratum(Kom.)Nakai.)中獲得分子量范圍在1萬-10萬道爾頓的糖蛋白提取物，該提取物比歐寄生糖蛋白提取物具有更高的抗腫瘤活性，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的之一是提供一種抗腫瘤活性更高的槲寄生糖蛋白提取物，該槲寄生提取物是是一種分子量在1萬-10萬道爾頓之間的糖蛋白，其中該提取物中糖的重量百分含量為0.05-0.4％；蛋白質(zhì)的重量百分含量為0.1-0.8％。
本發(fā)明的目的之二是提供獲得槲寄生糖蛋白提取物的方法。
本發(fā)明的目的之三是提供含有槲寄生糖蛋白提取物作為活性成分的藥物組合物。
由于環(huán)境和宿主植物對槲寄生主要活性成分存在較大的影響，所以本發(fā)明在原料的選擇上，首先對槲寄生的不同宿主植物進行研究，對宿主植物進行了嚴格的限定，優(yōu)選榆樹、樺樹、柳樹、楓樹、楊樹、桃樹、槐樹、梨樹、松樹、橡樹。
本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物的分子量范圍為1萬-10萬道爾頓，優(yōu)選分子量范圍為4萬-8萬道爾頓其中該提取物中糖的重量百分含量為0.05-0.4％；蛋白質(zhì)的重量百分含量為0.1-0.8％。
本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物采用以下方法獲得稱取新鮮的槲寄生植物，加入1-4倍重量的重量百分比濃度為0.5-1.5％的氯化鈉溶液，進行均漿，浸泡過夜，過濾殘渣，把上清液離心20-30min、移去沉淀，上清液過濾，加入重量百分比濃度為50-90％的硫酸銨溶液，低溫放置使其沉淀，用重量百分比濃度為0.5-1.5％的氯化鈉溶液溶解，透析、上經(jīng)過0.01-1.25M的鹽酸溶液、碳酸鈉溶液、磷酸鈉溶液其中之一活化的Sepharose 4B或6B柱，用0.01-1M的氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、磷酸緩沖溶液其中之一進行洗脫，接取分子量為1萬-10萬道爾頓或4萬-8萬道爾頓的槲寄生糖蛋白洗脫液。進行透析，直到無氯離子為止，即獲得本發(fā)明所述的槲寄生糖蛋白提取物。
本發(fā)明提取物不含有對人體有害的毒肽和小分子蛋白質(zhì)。該提取物劑量在0.003-0.03mg/kg范圍內(nèi)對荷瘤動物有免疫調(diào)節(jié)作用，劑量在0.03-0.2mg/kg范圍內(nèi)，可體外抑制多種腫瘤細胞的生長，劑量在0.2-2mg/kg范圍內(nèi)，可抑制動物體內(nèi)多種移植腫瘤的生長。
本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物主要用于各種癌癥及免疫抑制性疾病的治療，如肺癌、胃癌、肝癌、子宮癌，尤其對K562、Hela、肺癌細胞具有較強的殺傷性。
本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物與歐寄生糖蛋白提取物在含蛋白質(zhì)的量、含糖量、毒性、凝血活性方面都存在較大的差異，通過實驗我們可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物比歐寄生糖蛋白提取物具有毒性小、抗腫瘤活性更高的特點。
本發(fā)明提取物的特性通過以下具體實驗例進行詳細的說明。
實驗例1糖含量對比實驗含糖量的測定采用相關(guān)文獻記載的硫酸蒽酮法進行測定。其中槲寄生糖蛋白提取物中糖的重量百分含量在0.05-0.4％之間；歐洲槲寄生糖蛋白提取物中糖的重量百分含量在0.4-2％之間。
實驗例2蛋白質(zhì)含量對比實驗蛋白質(zhì)重量百分含量測定采用相關(guān)文獻記載的Folin酚法，槲寄生糖蛋白提取物中蛋白質(zhì)的重量百分含量在0.05-0.4％之間；歐寄生糖蛋白提取物中蛋白質(zhì)的重量百分含量在1.0-2.8％之間。
實驗例3毒性對比實驗體重為17-20g的昆明小鼠，雌雄各半，同一次實驗小鼠體重相差不超過2克，共分為5組，每組6只。將不同劑量的樣品溶入注射用生理鹽水，靜脈注射給藥，觀察三天內(nèi)出現(xiàn)的小鼠死亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲寄生糖蛋白提取物的LD50為28mg/kg，歐寄生糖蛋白提取物的LD50為7mg/kg。
實驗例4凝血活性對比實驗采用微量血凝實驗，儀器為V字形血凝板和顯微鏡。主要方法為取正常人血5ml，以檸檬酸鈉抗凝，用0.015M磷酸鹽稀釋3倍后，4℃下，2000rpm離心10min，洗滌4次，將RBC調(diào)整為2％，懸浮于V字形板上，然后加入不同濃度含樣品的磷酸緩沖溶液，混均，37℃放置2小時，用相同濃度的磷酸緩沖溶液做對照，觀察實驗結(jié)果，本發(fā)明槲寄生糖蛋白的凝血活性為17mg/ml，歐寄生糖蛋白提取物凝血活性為21mg/ml。
實驗例5抗腫瘤活性對比實驗采用小鼠腫瘤實驗比較本發(fā)明的槲寄生糖蛋白提取物和歐寄生提取物的抗腫瘤活性，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明槲寄生糖蛋白提取物的腫瘤抑制率為71.88％；而歐寄生糖蛋白提取物的腫瘤抑制率為53.13％，抑制腫瘤活性有顯著的提高。
方法將小鼠接種Lewis肺癌細胞，接種的第二天開始給藥，以控制組為對照，每天給藥一次，腹腔注射連續(xù)18天后稱瘤重。實驗結(jié)果如下表所示 實驗表明槲寄生糖蛋白提取物和歐寄生糖蛋白提取物都有明顯抑制腫瘤生長的作用，但本發(fā)明提取物的抗腫瘤活性明顯高于歐寄生提取物。
采用常規(guī)的方法將本發(fā)明的槲寄生糖蛋白提取物與藥學(xué)上可接受的載體制成各種劑型如片劑、膠囊劑、注射劑、凍干粉針劑及其它生物制劑。
現(xiàn)通過以下實施例來更詳細的說明本發(fā)明。
實施例1稱取10Kg鮮槲寄生，加入2倍重量的重量百分比濃度為0.9％的氯化鈉溶液進行均漿，浸泡過夜，過濾殘渣，把上清液離心20min、移去沉淀，上清液過濾，加入重量百分比濃度60％的硫酸銨溶液，低溫放置使其沉淀，分離出沉淀，用重量百分比濃度為0.9％的氯化鈉溶液溶解，透析，上經(jīng)過0.02M鹽酸溶液活化的Sepharose 4B柱，用0.03M的氯化鈉溶液進行洗脫，接取分子量為1萬-10萬道爾頓的槲寄生糖蛋白洗脫液。進行透析，直到無氯離子為止，得本發(fā)明所述的糖蛋白提取物600mg。
實施例2稱取20Kg鮮槲寄生，加入3倍重量的重量百分比濃度為0.9％的氯化鈉溶液進行均漿，浸泡過夜，過濾殘渣，把上清液離心30min、移去沉淀，上清液過濾，加入重量百分比濃度為65％的硫酸銨溶液，低溫放置使其沉淀，分離出沉淀，用0.9％的氯化鈉溶液溶解，透析，上經(jīng)過0.01M鹽酸溶液活化的Sepharose6B柱，用0.02M的磷酸緩沖溶液進行洗脫，接取分子量為4萬-8萬道爾頓的槲寄生糖蛋白洗脫液。進行透析，直到無氯離子為止，得本發(fā)明所述的糖蛋白提取物1000mg。
實施例3稱取50Kg鮮槲寄生，加入2倍重量的重量百分比濃度為0.9％的氯化鈉溶液進行均漿，浸泡過夜，過濾殘渣，把上清液離心30min、移去沉淀，上清液過濾，加入重量百分比濃度為70％的硫酸銨溶液，低溫放置使其沉淀，分離出沉淀，用重量百分比濃度為0.9％的氯化鈉溶液溶解，透析，上經(jīng)過0.01M鹽酸溶液活化的Sepharose4B柱，用0.02M的氯化鈉溶液進行洗脫，接取分子量為4-8萬道爾頓的槲寄生糖蛋白洗脫液。進行透析，直到無氯離子為止，得本發(fā)明所述的糖蛋白提取物2500mg。
實施例5向30g實施例1所得的槲寄生糖蛋白提取物中加入藥理允許常用穩(wěn)定劑，用注射用水溶解至1000ml，用常規(guī)方法進行滅菌處理，進行分裝，制成規(guī)格為30mg/ml的注射液。
實施例6向50g實施例2所得的槲寄生糖蛋白提取物中加入藥理允許常用生物制品支撐劑，用注射用水溶解至1000ml，滅菌，分裝，用常規(guī)方法凍干，制成規(guī)格為50mg/ml的凍干制劑。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種具有更高抗腫瘤活性的植物提取物，其特征為該提取物是一種分子量范圍在1萬-10萬道爾頓之間的槲寄生屬植物糖蛋白提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述其特征為上述提取物是一種分子量范圍在1萬-10萬道爾頓之間槲寄生植物糖蛋白提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述其特征為上述提取物是一種分子量范圍在4萬-8萬道爾頓之間的槲寄生糖蛋白提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述其特征為上述提取物中蛋白質(zhì)的重量百分比含量范圍為0.1-0.8％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述其特征為上述提取物中糖的重量百分比含量范圍為0.05-0.4％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述其特征為槲寄生屬植物的宿主植物為榆樹、樺樹、柳樹、楓樹、楊樹、桃樹、槐樹、梨樹、松樹、橡樹。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述其特征為上述提取物可以通過以下方法獲得稱取新鮮的槲寄生植物加入1-4倍重量的重量百分比為0.5-1.5％的氯化鈉溶液進行均漿，浸泡過夜，濾去殘渣，把上清液離心20-30min，移去沉淀，上清液加入重量百分比濃度為50-90％的硫酸銨溶液，低溫放置使其沉淀，分離出沉淀，用重量百分比濃度為0.5-1.5％的氯化鈉溶液溶解沉淀，透析；上經(jīng)過0.01-1.25M鹽酸溶液、碳酸鈉溶液、磷酸鈉溶液其中之一活化的Sepharose4B或6B柱，用0.01-1M氯化鈉溶液、磷酸緩沖溶液、氯化鉀溶液其中之一進行洗脫，接取分子量為1萬-10萬或4萬-8萬道爾頓的糖蛋白提取液，進行透析，直到無氯離子為止，即獲得本發(fā)明所述的糖蛋白提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述其特征為含有上述提取物作為活性成分的藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述其特征為上述藥物提取物或藥物組合物其劑型為注射液、凍干粉針、片劑、膠囊。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述其特征為上述提取物或組合物在制備治療肺癌、胃癌、肝癌、子宮癌及免疫抑制性疾病的藥物組合物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種槲寄生糖蛋白提取物,該提取物是一種分子量范圍在1萬—10萬道爾頓之間的糖蛋白,其中該提取物中蛋白質(zhì)的重量百分含量在0.1—0.8%之間;糖的重量百分含量在0.05—0.4%之間。具有比歐寄生糖蛋白提取物更強的抗腫瘤活性。同時本發(fā)明還提供了制備該提取物的方法和含有該提取物作為活性成分的藥物組合物。
文檔編號C07K1/00GK1299826SQ0010934
公開日2001年6月20日 申請日期2000年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月30日
發(fā)明者劉珂, 孫福璋, 范秀娟 申請人:山東綠葉制藥股份有限公司