本發(fā)明涉及微生物菌肥制備方法領(lǐng)域，具體涉及一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法。
背景技術(shù)：
牡丹是我國(guó)一種著名的觀賞類的花卉，其花朵碩大，雍容華貴，深受人們的喜愛。牡丹生長(zhǎng)在中性或微堿性土壤中，不耐酸，不耐黏重土壤。牡丹喜肥，尤其是氮磷鉀等元素較為齊全的肥料，目前常用的肥料為無機(jī)的復(fù)合肥或畜禽糞便等有機(jī)肥。牡丹為肉質(zhì)根，施用無機(jī)的復(fù)合肥必須施在距主根較遠(yuǎn)的地方，如果施肥距主根太近，容易引起牡丹根部失水，進(jìn)而影響礦質(zhì)元素的吸收，長(zhǎng)期使用無機(jī)復(fù)合肥容易造成土壤的板結(jié)和地下水資源的污染；施用有機(jī)肥必須經(jīng)過漚制腐熟，未經(jīng)腐熟的有機(jī)肥會(huì)發(fā)酵釋放出有機(jī)酸，進(jìn)而引起牡丹根的腐爛。另外，牡丹在生長(zhǎng)過程中，容易受到不良環(huán)境條件的影響和病原微生物的侵染，牡丹的葉、枝條和根莖部均可成為病原微生物危害的部位，目前采用的解決辦法通常是施加化學(xué)農(nóng)藥或剪除病害枝葉等，但是長(zhǎng)時(shí)間大量施用化學(xué)農(nóng)藥易使病原微生物產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)造成環(huán)境污染和生態(tài)平衡破壞。牡丹作為觀賞花卉，施用化學(xué)農(nóng)藥還會(huì)威脅游客的健康。
隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，其副產(chǎn)物及廢棄物也越來越越多，它們大量堆積發(fā)酵，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，釋放出的腐臭氣味和有害物質(zhì)對(duì)人們的生活造成不良影響，如果能作為底物，用來生產(chǎn)生物肥料也是一種好的解決方法。
本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HS5B5，2012年5月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：CGMCC No.6088(見申請(qǐng)?zhí)枮?01410163640.4的發(fā)明專利申請(qǐng)說明書)?？莶菅挎邨U菌HS5B5通過生物拮抗作用對(duì)牡丹枝孢霉為病原真菌的牡丹褐斑病有抑制效果，對(duì)其他常見真菌病害也有一定抑制效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法，通過該方法制備的復(fù)合微生物菌肥不僅可以為牡丹生長(zhǎng)提供各種營(yíng)養(yǎng)成分，而且能夠抑制牡丹病原微生物的生長(zhǎng)，為牡丹根部提供微生物保護(hù)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：
步驟一、取熱帶假絲酵母進(jìn)行活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到含熱帶假絲酵母的混合物A；按質(zhì)量比1：4取紅薯渣和水果廢棄物，粉碎至1.5cm以下，以紅薯渣和水果廢棄物總質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入1％的尿素，攪拌均勻得到混合物B；將混合物A接種到混合物B中，接種量為混合物B質(zhì)量的1％，室溫?cái)嚢璋l(fā)酵4-5天，制得發(fā)酵物Ⅰ；
步驟二、按質(zhì)量比1：1：2-3：2-3取雞糞、牛糞、沼氣池渣和粉碎至1cm以下的小麥秸稈，混合均勻得到混合物C，以混合物C的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入5％的生石灰，暴露于空氣中，自然放置3-5天，制得發(fā)酵物Ⅱ；
步驟三、將步驟二制得的發(fā)酵物Ⅱ加入到步驟一制得的發(fā)酵物Ⅰ中，其中發(fā)酵物Ⅱ與發(fā)酵物Ⅰ質(zhì)量比為3：1，混勻后得到混合物D；在混合物D中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白地霉、巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，且各菌株的接種量均為混合物D質(zhì)量的1％，于30℃條件下攪拌發(fā)酵4-6天，制得發(fā)酵物Ⅲ；
步驟四、以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉，接種量為3％-5％，當(dāng)根內(nèi)球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有根內(nèi)球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E1；以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁摩西球囊霉，接種量為3％-5％，當(dāng)摩西球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E2；將混合物E1和混合物E2按質(zhì)量比1：1混合均勻獲得混合物E；
步驟五、按質(zhì)量比100：90：2：1取發(fā)酵物Ⅲ、混合物E、魚粉和硫酸鋅，將混合物E、魚粉和硫酸鋅加入到發(fā)酵物Ⅲ中，混勻后制得半固體狀的混合物F；
步驟六、取枯草芽孢桿菌HS5B5，在種子培養(yǎng)基中活化，活化后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，當(dāng)枯草芽孢桿菌HS5B5生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)，得到含有枯草芽孢桿菌HS5B5的混合物G；
步驟七、將步驟五制得的混合物F與步驟六制得的混合物G按質(zhì)量比3-5：1混合，攪拌均勻即制得牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥。
進(jìn)一步地，步驟一所述的水果廢棄物為蘋果落果、蘋果腐果、蘋果鮮渣、菠蘿渣中的任意一種或任意混合物。
進(jìn)一步地，步驟一所述的水果廢棄物為蘋果鮮渣和蘋果落果的混合物，且蘋果鮮渣和蘋果落果的質(zhì)量比為1：3。
進(jìn)一步地，步驟一所述紅薯渣和水果廢棄物粉碎至0.8cm以下。
進(jìn)一步地，步驟二所述雞糞、牛糞、沼氣池渣和小麥秸稈的質(zhì)量比為1：1：2：3。
進(jìn)一步地，步驟四擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉所用的擴(kuò)繁基質(zhì)由河沙和土按質(zhì)量比1：1混合后滅菌制得。
進(jìn)一步地，步驟六所述的種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
進(jìn)一步地，步驟六所述的枯草芽孢桿菌HS5B5的活化溫度為30℃，活化時(shí)長(zhǎng)為11小時(shí)。
進(jìn)一步地，步驟六所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·2H2O 1.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0。
進(jìn)一步地，步驟六所述的枯草芽孢桿菌HS5B5在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件為：30℃通氣發(fā)酵25小時(shí)。
有益效果：
本發(fā)明中的各種原料和微生物在相關(guān)工藝的處理下，使所制備出的牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥中的各種成分相互協(xié)同，最終達(dá)到促進(jìn)牡丹生長(zhǎng)、延長(zhǎng)花期、防治牡丹病害的目的；
通過本發(fā)明制備的牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥經(jīng)灌根進(jìn)入土壤，菌肥中的各種微生物與土壤微生物之間形成微妙的動(dòng)態(tài)平衡，使菌肥中各種有機(jī)物在各微生物之間轉(zhuǎn)化和利用，最終釋放出牡丹可以直接吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)到土壤中，進(jìn)而被牡丹吸收利用。根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉在土壤生長(zhǎng)繁殖過程中，大部分菌絲在牡丹根際周圍蔓延并與牡丹根系共生，增大了牡丹根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，有利于牡丹對(duì)磷等礦質(zhì)元素的吸收，同時(shí)根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉與枯草芽孢桿菌HS5B5相互協(xié)同，共同抵御病原微生物對(duì)牡丹的侵襲；添加的硫酸鋅，可以顯著提高牡丹的自身抗逆性和多種病害的抵抗能力，加速葉綠素的形成，枝繁葉茂，促進(jìn)牡丹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；
本發(fā)明所用原料紅薯渣、蘋果鮮渣、蘋果落果、雞糞、牛糞、沼氣池渣、小麥秸稈均為廉價(jià)易得的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物、廢棄物或生活垃圾，經(jīng)本發(fā)明提供的方法處理后，不僅可以緩解環(huán)境污染的壓力，而且制得的菌肥能夠滿足牡丹對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求，同時(shí)對(duì)改善土壤通透性、增強(qiáng)土壤肥力有良好的效果，還可以促進(jìn)牡丹根系生長(zhǎng)，延長(zhǎng)花期，抑制牡丹病原微生物的生長(zhǎng)，為牡丹根部提供微生物保護(hù)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：
步驟一、取熱帶假絲酵母在麥芽汁培養(yǎng)基(每1000ml水中加入麥芽膏粉130g，氯霉素0.1g；調(diào)節(jié)pH至6.0)中進(jìn)行活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到混合物A，混合物A中含有麥芽汁培養(yǎng)基與生長(zhǎng)繁殖迅速的熱帶假絲酵母菌體及其代謝產(chǎn)物；生長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的熱帶假絲酵母接入新培養(yǎng)基中，能夠使熱帶假絲酵母更快的適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，縮短延遲期，從而縮短發(fā)酵時(shí)間；
按質(zhì)量比1：4取紅薯渣和水果廢棄物，粉碎至1.5cm以下，以紅薯渣和水果廢棄物總質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入1％的尿素，攪拌均勻得到混合物B；混合物B實(shí)質(zhì)上是以紅薯渣和水果廢棄物為原料制備的一種可以用來繁殖熱帶假絲酵母菌體的培養(yǎng)基，不僅解決了農(nóng)業(yè)廢棄物(即紅薯渣和水果廢棄物)堆積腐敗、污染環(huán)境的問題，緩解了環(huán)境壓力，而且紅薯渣和水果廢棄物還為熱帶假絲酵母生長(zhǎng)繁殖提供可利用的碳源、氮源、無機(jī)鹽、水等各種營(yíng)養(yǎng)成分，加入1％的尿素使碳氮比達(dá)到最佳狀態(tài)，有利于熱帶假絲酵母菌體生長(zhǎng)繁殖；紅薯渣和水果廢棄物粉碎至1.5cm以下，在攪拌發(fā)酵時(shí)，能夠讓熱帶假絲酵母與混合物B充分接觸，有利于熱帶假絲酵母生長(zhǎng)；
將混合物A接種到混合物B中，接種量為混合物B質(zhì)量的1％，室溫?cái)嚢璋l(fā)酵4-5天，制得發(fā)酵物Ⅰ；采用所述接種量于室溫條件下攪拌發(fā)酵，發(fā)酵4-5天后，熱帶假絲酵母將紅薯渣和水果廢棄物中的大部分大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解為容易利用的小分子化合物，在生長(zhǎng)過程中會(huì)合成大量菌體蛋白，熱帶假絲酵母生長(zhǎng)周期結(jié)束后，其菌體蛋白又可以被后續(xù)白地霉、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌以及土壤微生物利用；熱帶假絲酵母在生長(zhǎng)繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生大量水和二氧化碳，以及果渣中未被分解的大量的有機(jī)酸類物質(zhì)，因此得到的發(fā)酵物Ⅰ是一種偏酸性的半固態(tài)的混合物；
步驟二、按質(zhì)量比1：1：2-3：2-3取雞糞、牛糞、沼氣池渣和粉碎至1cm以下的小麥秸稈，混合均勻得到混合物C，雞糞、牛糞和沼氣池渣均可用作植物的有機(jī)肥，其本身含有大量的有機(jī)質(zhì)，若三者分別單獨(dú)使用，則會(huì)造成大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，利用率低，而且含有大量病原菌孢子和寄生蟲卵，異味大，使用不當(dāng)還容易引起燒苗現(xiàn)象；雞糞、牛糞和沼氣池渣中均含有大量不同種類的微生物，包括好氧微生物、厭氧微生物以及兼性厭氧型微生物，雞糞、牛糞和沼氣池渣三者混合，使混合物C中微生物種類和代謝產(chǎn)物更加豐富，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在各種微生物之間的轉(zhuǎn)化、利用并釋放到土壤中，有利于牡丹對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用；在混合物C中加入適當(dāng)比例粉碎至1cm以下的小麥秸稈，可以使混合物C保持一定的通氣性，能夠使土壤疏松透氣，滿足牡丹肉質(zhì)根的生長(zhǎng)需要，同時(shí)滿足好氧微生物和兼性厭氧型微生物對(duì)氧氣的需求；以混合物C的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入5％的生石灰，暴露于空氣中，自然放置3-5天，制得發(fā)酵物Ⅱ，生石灰遇到雞糞、牛糞和沼氣池渣中的水，得到堿性的熟石灰，并伴隨大量的熱量形成高溫，高溫以及熟石灰的堿性不僅能殺死混合物C中的大部分病原菌和寄生蟲卵，還能使小麥秸稈進(jìn)一步分解、離析和降解，自然發(fā)酵3-5天后，混合物C中的大部分病原菌和寄生蟲卵被殺死，各種原料之間的混合也更加均勻，原料中的大分子物質(zhì)在微生物的作用下，轉(zhuǎn)化為更多可以被牡丹直接吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；
步驟三、將步驟二制得的發(fā)酵物Ⅱ加入到步驟一制得的發(fā)酵物Ⅰ中，發(fā)酵物Ⅱ的堿性可以與發(fā)酵物Ⅰ的酸性中和，其中發(fā)酵物Ⅱ與發(fā)酵物Ⅰ質(zhì)量比為3：1，使混勻后得到的混合物D的pH值適合后續(xù)微生物發(fā)酵的要求，最終得到的牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥不損傷牡丹的肉質(zhì)根；在混合物D中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白地霉、巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，且各菌株的接種量均為混合物D質(zhì)量的1％，30℃攪拌發(fā)酵4-6天，制得發(fā)酵物Ⅲ；經(jīng)過步驟二中生石灰的作用，小麥秸稈初步離析和降解后，其中的纖維素和木質(zhì)素等大分子物質(zhì)經(jīng)過白地霉和巨大芽孢桿菌進(jìn)一步分解，產(chǎn)生糊精、寡糖和單糖，可以為發(fā)酵菌株和土壤微生物利用；膠凍樣芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過程中可以釋放出難溶性鉀鹽中的鉀元素以及其它中微量元素，利于牡丹對(duì)這些元素的吸收利用，對(duì)延長(zhǎng)牡丹花期有積極作用，膠凍樣芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸等物質(zhì)可以被牡丹直接吸收利用，促進(jìn)牡丹的生長(zhǎng)；
步驟四、以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉，接種量為3％-5％，當(dāng)根內(nèi)球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，此時(shí)菌根真菌已經(jīng)大量侵染到植物根系，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有根內(nèi)球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E1；以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁摩西球囊霉，接種量為3％-5％，當(dāng)摩西球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，此時(shí)菌根真菌已經(jīng)大量侵染到植物根系，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E2；將混合物E1和混合物E2按質(zhì)量比1：1混合均勻獲得混合物E；根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉在土壤生長(zhǎng)繁殖過程中，大部分菌絲在牡丹根際周圍蔓延并與牡丹根系共生，增大了牡丹根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，有利于牡丹對(duì)磷等礦質(zhì)元素的吸收，同時(shí)根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉與枯草芽孢桿菌HS5B5相互協(xié)同，共同抵御土壤中病原微生物對(duì)牡丹的侵襲；
步驟五、按質(zhì)量比100：90：2：1取發(fā)酵物Ⅲ、混合物E、魚粉和硫酸鋅，將混合物E、魚粉和硫酸鋅加入到發(fā)酵物Ⅲ中，混勻后制得半固體狀的混合物F；魚粉中蛋白質(zhì)含量比較高，降解后產(chǎn)生大量的小肽和氨基酸，牡丹吸收后可以增強(qiáng)牡丹的代謝功能，提高光合作用，延長(zhǎng)花期，促進(jìn)牡丹根系的生長(zhǎng)，改善土壤微生態(tài)環(huán)境；硫酸鋅可以顯著提高牡丹的自身抗逆性和抵御多種病害的能力，加速葉綠素的形成，枝繁葉茂，促進(jìn)牡丹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；
步驟六、取枯草芽孢桿菌HS5B5，在種子培養(yǎng)基中活化，活化后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，當(dāng)枯草芽孢桿菌HS5B5生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)，得到含有枯草芽孢桿菌HS5B5的混合物G，此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中的養(yǎng)分消耗殆盡，混合物G中主要含有大量的菌體(﹥108CFU/ml)、芽孢和次生代謝產(chǎn)物；枯草芽孢桿菌HS5B5對(duì)牡丹多種病害的病原微生物有顯著的拮抗抑菌作用，可以與根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉相互協(xié)同增強(qiáng)牡丹根系抗病能力；同時(shí)，在使用最終得到的復(fù)合微生物菌肥的過程中，也對(duì)牡丹的地上部分噴施枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑，這樣處理后對(duì)牡丹根、莖、葉形成全方位保護(hù)，比單純使用菌肥灌根的抗病效果更加明顯；
步驟七、將步驟五制得的混合物F與步驟六制得的混合物G按質(zhì)量比3-5：1混合，攪拌均勻即制得牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥。
進(jìn)一步地，步驟一所述的水果廢棄物為蘋果落果、蘋果腐果、蘋果鮮渣、菠蘿渣中的任意一種或任意混合物，蘋果落果、蘋果腐果、蘋果鮮渣和菠蘿渣中均含有大量酸性有機(jī)物質(zhì)，其酸性和有益微生物菌群可以抑制牡丹病原微生物的繁殖，改善土地鹽堿化程度，顯著提高肥力。
進(jìn)一步地，步驟一所述的水果廢棄物為蘋果鮮渣和蘋果落果的混合物，蘋果鮮渣和蘋果落果的質(zhì)量比為1：3；紅薯渣、蘋果鮮渣和蘋果落果中的果膠、蛋白質(zhì)和纖維素經(jīng)菌肥中的微生物降解可以得到氨基酸、多肽和脂肪酸等物質(zhì)，有利于牡丹吸收促進(jìn)牡丹生長(zhǎng)，提高牡丹抗逆性。
進(jìn)一步地，步驟一所述紅薯渣和水果廢棄物粉碎至0.8cm以下，有利于縮短發(fā)酵時(shí)間。
進(jìn)一步地，步驟二所述雞糞、牛糞、沼氣池渣和小麥秸稈的質(zhì)量比為1：1：2：3。
進(jìn)一步地，步驟四擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉所用的擴(kuò)繁基質(zhì)由河沙和土按質(zhì)量比1：1混合后滅菌制得。
進(jìn)一步地，步驟六所述的種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；步驟六所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·2H2O 1.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0；所述的枯草芽孢桿菌HS5B5的活化溫度為30℃，活化時(shí)長(zhǎng)為11小時(shí)；步驟六所述的枯草芽孢桿菌HS5B5在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的條件為：30℃通氣發(fā)酵25小時(shí)。
通過本發(fā)明提供的方法制備的牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥在對(duì)牡丹灌根的同時(shí)，用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹莖葉，可使牡丹植株健壯，增強(qiáng)抗病能力，提高牡丹花朵品質(zhì)，延長(zhǎng)花期，增加觀賞效果。
實(shí)施例：
以下實(shí)施例所用的熱帶假絲酵母、白地霉、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌、根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉均購(gòu)自山東深海生物科技股份有限公司，各菌種保藏地址及保藏號(hào)分別為：熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC 2.2735。白地霉(Geotrichum candidum)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏菌號(hào)為CGMCC 2.1132。巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏菌號(hào)為CGMCC 1.2416。膠凍樣類芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為ACCC 10012。根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)和摩西球囊霉(Glomus mosseae)為歐洲菌種保藏中心注冊(cè)保藏，保藏號(hào)分別為BEG 141和BEG 167。
實(shí)施例1
一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：
步驟一、取熱帶假絲酵母在麥芽汁培養(yǎng)基(每1000ml水中加入麥芽膏粉130g，氯霉素0.1g；調(diào)節(jié)pH至6.0)中進(jìn)行活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到含熱帶假絲酵母的混合物A；按質(zhì)量比1：1：3取紅薯渣、蘋果鮮渣和蘋果落果，粉碎至0.8cm以下，以紅薯渣、蘋果鮮渣和蘋果落果總質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入1％的尿素，攪拌均勻得到混合物B；將混合物A接種到混合物B中，接種量為混合物B質(zhì)量的1％，室溫?cái)嚢璋l(fā)酵5天，制得發(fā)酵物Ⅰ；
步驟二、按質(zhì)量比1：1：2：3取雞糞、牛糞、沼氣池渣和粉碎至1cm以下的小麥秸稈，混合均勻得到混合物C，以混合物C的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入5％的生石灰，暴露于空氣中自然放置5天，制得發(fā)酵物Ⅱ；
步驟三、將步驟二制得的發(fā)酵物Ⅱ加入到步驟一制得的發(fā)酵物Ⅰ中，其中發(fā)酵物Ⅱ與發(fā)酵物Ⅰ質(zhì)量比為3：1，混勻后得到混合物D；在混合物D中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白地霉、巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，且各菌株的接種量均為混合物D質(zhì)量的1％，于30℃條件下攪拌發(fā)酵6天，制得發(fā)酵物Ⅲ；
步驟四、以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉，接種量為5％，當(dāng)根內(nèi)球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有根內(nèi)球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E1；以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁摩西球囊霉，接種量為5％，當(dāng)摩西球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E2；將混合物E1和混合物E2按質(zhì)量比1：1混合均勻獲得混合物E；擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉所用的擴(kuò)繁基質(zhì)均為由河沙和土按質(zhì)量比1：1混合后滅菌制得；
步驟五、按質(zhì)量比100：90：2：1取發(fā)酵物Ⅲ、混合物E、魚粉和硫酸鋅，將混合物E、魚粉和硫酸鋅加入到發(fā)酵物Ⅲ中，混勻后制得半固體狀的混合物F；
步驟六、取枯草芽孢桿菌HS5B5，在種子培養(yǎng)基中30℃活化11小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃通氣發(fā)酵25小時(shí)，使枯草芽孢桿菌HS5B5生長(zhǎng)至穩(wěn)定期，制得含有枯草芽孢桿菌HS5B5的混合物G；
所述的種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1 5.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·2H2O 1.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0；
步驟七、將步驟五制得的混合物F與步驟六制得的混合物G按質(zhì)量比5：1混合，攪拌均勻即制得牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥。
實(shí)施例2
一種牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥的制備方法，包括以下步驟：
步驟一、取熱帶假絲酵母在麥芽汁培養(yǎng)基(每1000ml水中加入麥芽膏粉130g，氯霉素0.1g；調(diào)節(jié)pH至6.0)中進(jìn)行活化，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到含熱帶假絲酵母的混合物A；按質(zhì)量比1：1：3取紅薯渣、蘋果鮮渣和蘋果落果，粉碎至0.8cm以下，以紅薯渣、蘋果鮮渣和蘋果落果總質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入1％的尿素，攪拌均勻得到混合物B；將混合物A接種到混合物B中，接種量為混合物B質(zhì)量的1％，室溫?cái)嚢璋l(fā)酵4天，制得發(fā)酵物Ⅰ；
步驟二、按質(zhì)量比1：1：2：3取雞糞、牛糞、沼氣池渣和粉碎至1cm以下的小麥秸稈，混合均勻得到混合物C，以混合物C的質(zhì)量為基準(zhǔn)，加入5％的生石灰，暴露于空氣中自然放置3天，制得發(fā)酵物Ⅱ；
步驟三、將步驟二制得的發(fā)酵物Ⅱ加入到步驟一制得的發(fā)酵物Ⅰ中，其中發(fā)酵物Ⅱ與發(fā)酵物Ⅰ質(zhì)量比為3：1，混勻后得到混合物D；在混合物D中接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白地霉、巨大芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，且各菌株的接種量均為混合物D質(zhì)量的1％，于30℃條件下攪拌發(fā)酵4天，制得發(fā)酵物Ⅲ；
步驟四、以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉，接種量為3％，當(dāng)根內(nèi)球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有根內(nèi)球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E1；以苜蓿為宿主植物，在擴(kuò)繁基質(zhì)中擴(kuò)繁摩西球囊霉，接種量為3％，當(dāng)摩西球囊霉孢子達(dá)到每克土中含30個(gè)以上時(shí)，打碎苜蓿根和擴(kuò)繁基質(zhì)，獲得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根內(nèi)外菌絲和侵染根段的混合物E2；將混合物E1和混合物E2按質(zhì)量比1：1混合均勻獲得混合物E；擴(kuò)繁根內(nèi)球囊霉和摩西球囊霉所用的擴(kuò)繁基質(zhì)均為由河沙和土按質(zhì)量比1：1混合后滅菌制得；
步驟五、按質(zhì)量比100：90：2：1取發(fā)酵物Ⅲ、混合物E、魚粉和硫酸鋅，將混合物E、魚粉和硫酸鋅加入到發(fā)酵物Ⅲ中，混勻后制得半固體狀的混合物F；
步驟六、取枯草芽孢桿菌HS5B5，在種子培養(yǎng)基中30℃活化11小時(shí)，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中：30℃通氣發(fā)酵25小時(shí)，使枯草芽孢桿菌HS5B5生長(zhǎng)至對(duì)穩(wěn)定期，制得含有枯草芽孢桿菌HS5B5的混合物G；
所述的種子培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1 5.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以每加入1000ml水為參照，其組分及其添加量分別為：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·2H2O 1.0g，水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0；
步驟七、將步驟五制得的混合物F與步驟六制得的混合物G按質(zhì)量比3：1混合，攪拌均勻即制得牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥。
試驗(yàn)：
以通過實(shí)施例1提供的方法制備的牡丹灌根用復(fù)合微生物菌肥(以下簡(jiǎn)稱牡丹專用菌肥)以及在制備過程中制得的中間產(chǎn)物進(jìn)行試驗(yàn)。
試驗(yàn)一、在牡丹花期前一個(gè)月，選取洛陽國(guó)際牡丹園牡丹栽培區(qū)長(zhǎng)勢(shì)相同的牡丹400株，隨機(jī)分為①、②、③、④、⑤、⑥、⑦和⑧八組，每組50株，各組分別處理如下：
①用牡丹專用菌肥灌根，同時(shí)用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹枝葉；
②用牡丹專用菌肥灌根，同時(shí)用水噴灑牡丹枝葉；
③用發(fā)酵物Ⅲ灌根，同時(shí)用水噴灑牡丹枝葉；
④用混合物D灌根，同時(shí)用水噴灑牡丹枝葉；
⑤用水灌根，同時(shí)用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹枝葉；
⑥用水灌根，同時(shí)用水噴灑牡丹枝葉；
⑦用普通微生物菌肥灌根，同時(shí)用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹枝葉；
⑧用普通微生物菌肥灌根，同時(shí)用水噴灑牡丹枝葉；
上述處理中灌根用的牡丹專用菌肥、發(fā)酵物Ⅲ、混合物D和普通微生物菌肥均按80g/株使用，用水稀釋成1000ml進(jìn)行灌根；⑤和⑥中，每株牡丹施用1000ml水灌根；
上述處理中噴灑牡丹枝葉用的枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑為實(shí)施例1制備過程中的混合物G，按10g/株使用，用水稀釋成500ml均勻噴灑枝葉；②、③、④、⑥和⑧中，每株牡丹施用500ml水噴灑枝葉。
每15天重復(fù)處理一次，30天后觀察并記錄花期、新枝長(zhǎng)度、成花率、花徑、單花質(zhì)量和感染真菌病害株數(shù)(所述真菌病害主要指牡丹褐斑病等常見牡丹真菌病害，以下所述的真菌病害與此相同)，結(jié)果如表1所示：
表1各種處理對(duì)牡丹開花的影響
表1中，牡丹是觀賞類花卉，整株牡丹花期時(shí)間越長(zhǎng)，則帶來的收益越高；新枝長(zhǎng)代表當(dāng)年開花枝條的長(zhǎng)勢(shì)，枝條較長(zhǎng)，花朵直立，則葉里藏花的情況得到改善，可以增加觀花效果；成花率反映花蕾營(yíng)養(yǎng)發(fā)育情況；花徑和單花質(zhì)量均反映花朵大小，花朵越大，則觀賞效果較好；a、b、c和d均表示不同數(shù)據(jù)間差異的顯著性，相同字母間差異不顯著，不同字母間差異顯著。
結(jié)果表明：①組平均整個(gè)花期為8.21天，新枝最長(zhǎng)，花冠碩大，成花率100％表示植株上部所有新枝均能成花，說明植株?duì)I養(yǎng)狀況較好，無花蕾敗育情況。同時(shí)只有1株牡丹感染真菌病害；②組與①組差異不明顯，但是有8株牡丹感染真菌病害，說明用牡丹專用菌肥灌根能夠?qū)δ档じ啃纬杀Ｗo(hù)，在一定程度上對(duì)牡丹真菌病害的起到防治作用，如果同時(shí)用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹枝葉，則能夠?qū)δ档ぶ?、葉以及根、莖形成全方位保護(hù)，能更好的抑制真菌病原菌，對(duì)牡丹真菌病害的防治效果也更好；③組和②組相比，花期縮短將近1天，成花率、花徑和單花質(zhì)量都比①組顯著降低，感染病害植株數(shù)也較多，說明混合物E中的叢枝菌根混合物以及魚粉、硫酸鋅能夠增加和豐富營(yíng)養(yǎng)的吸收，促進(jìn)光合作用，延長(zhǎng)花期，提高牡丹的抗逆性，并減少病害的發(fā)生；④組施用混合物D，其各項(xiàng)指標(biāo)均比③組略差，分析表明，混合物D中含有一定量的不易被牡丹吸收利用的氮素、碳水化合物、蛋白質(zhì)和少量的生化黃腐酸；⑤組施用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑(即混合物G)噴灑枝葉，可以一定程度上預(yù)防牡丹真菌病害的發(fā)生，但同時(shí)僅用水進(jìn)行灌根，和①組相比，各項(xiàng)指標(biāo)明顯降低，牡丹缺少了大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低了植株的抗逆性。①與⑦或②與⑧相比，平均花期延長(zhǎng)了20％以上，成花率和花的品質(zhì)也大幅增加，說明牡丹專用菌肥對(duì)提高牡丹品質(zhì)、延長(zhǎng)牡丹花期比普通微生物菌肥效果更好。綜合以上分析，通過實(shí)施例1制備的牡丹專用菌肥施用后，能夠提高牡丹的抗逆性以及花的品質(zhì)，延長(zhǎng)花期，促進(jìn)牡丹開花，增加開花數(shù)量?；旌衔颎即枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑枝葉后，也能夠明顯降低牡丹感染真菌病害的機(jī)率，因其是液體狀態(tài)的特性，可以在實(shí)際應(yīng)用噴灑與灌根配合施用。
試驗(yàn)二、在牡丹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，選取洛陽國(guó)際牡丹園牡丹栽培區(qū)長(zhǎng)勢(shì)相同的牡丹400株，隨機(jī)分為八組，具體分組及各組處理均與試驗(yàn)一相同。
每15天重復(fù)處理一次，45天后記錄牡丹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表2所示：
表2各種處理對(duì)牡丹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響
表2中，SPAD表示葉綠度，反映了葉片葉綠素含量高低，與凈光合速率一起體現(xiàn)植株的光合同化能力；氣孔導(dǎo)度增大，可以減輕氣孔限制，促進(jìn)光合作用的增加，但也不可避免的增加了蒸騰失水；水分利用效率增加，說明氣孔導(dǎo)度增加則蒸騰作用增強(qiáng)，但促進(jìn)光合作用的效應(yīng)更為明顯；a、b、c和d均表示不同數(shù)據(jù)間差異的顯著性，相同字母間差異不顯著，不同字母間差異顯著。
結(jié)果顯示：①組牡丹長(zhǎng)勢(shì)最好，也只有2株牡丹感染真菌病害；②組與①組差異不明顯，但是有7株牡丹感染真菌病害，進(jìn)一步說明用牡丹專用菌肥灌根的同時(shí)，用枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑噴灑牡丹枝葉能夠更好的拮抗真菌病原菌，對(duì)牡丹真菌病害的防治效果也更好；③組和②組相比，光合速率明顯降低，說明缺少了叢枝菌根以及魚粉、硫酸鋅，不僅使根際吸收面積減少，而且缺乏氨基酸和鋅素，導(dǎo)致光合作用和植株抗逆性降低，牡丹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的各項(xiàng)指標(biāo)有了顯著性降低；④組施用混合物D，其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的各項(xiàng)指標(biāo)比③組差，進(jìn)一步說明混合物D中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不如③組容易被牡丹吸收利用；⑤組施用混合物G噴灑枝葉，可以一定程度上預(yù)防牡丹真菌病害的發(fā)生，但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，降低了植株的抗逆性。①與⑦或②與⑧相比，葉綠素含量高，光合作用增強(qiáng)，說明植株更為健壯，抗病能力增強(qiáng)。綜合以上分析，牡丹專用菌肥能夠提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)牡丹的光合作用和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高植株的抗逆性，有效預(yù)防牡丹真菌病害的發(fā)生。
綜上所述，②、③、④和⑥四組相比，②組處理的牡丹葉綠素含量最高，光合速率最強(qiáng)，平均花期最長(zhǎng)，感病株數(shù)也最少，說明通過實(shí)施例1提供的方法制備的菌肥能夠促進(jìn)牡丹根系生長(zhǎng)、延長(zhǎng)花期，對(duì)牡丹真菌病害也有一定的防治效果；①、②和⑤三組相比，①組牡丹長(zhǎng)勢(shì)最好，平均花期最長(zhǎng)，新枝最長(zhǎng)，花冠碩大，成花率100％(表示植株上部所有新枝均能成花)，僅有一兩株牡丹感染病害，說明菌肥配合枯草芽孢桿菌HS5B5菌劑使用對(duì)牡丹防止真菌病害的效果更好；①與⑦或②與⑧相比，說明通過實(shí)施例1制備的牡丹專用菌肥比普通微生物菌肥更具針對(duì)性，對(duì)牡丹的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和延長(zhǎng)花期具有良好的效果。