miRNA檢測芯片、其制作方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種miRNA檢測芯片，其包括基底、設在基底上的鉻膜、設在鉻膜上的金膜、在金膜上的以自組裝方式引入的12-巰基十二烷酸自組裝單層以及與自組裝單層結合的RNA探針。該miRNA檢測芯片中的特異性RNA序列可以與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜交形成雜交序列，當待測miRNA逆轉錄形成的cDNA能與該特異性RNA序列雜交時，再使用RNase H酶解RNA-cDNA雜交體中特異性RNA序列，同時釋放的cDNA可以反復與芯片表面的特異性RNA序列結合，再水解，直到芯片表面的RAN探針完全被水解，從而形成了一種基于非PCR的放大檢測效應，操作簡便，可以實現(xiàn)miRNA的高通量快速檢測。此外，本發(fā)明還是涉及一種miRNA檢測芯片的制作方法和應用。
【專利說明】m i RNA檢測芯片、其制作方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化檢測領域，尤其是涉及一種miRNA檢測芯片、其制作方法及應用。

【背景技術】
[0002] microRNA(微小RNA，又稱miRNA)是機體內(nèi)源性表達的單鏈小分子RNA，位于基 因組非編碼區(qū)，具有高度保守型、時序性和組織特異性。miRNA可通過與靶mRNA的不完全 匹配結合阻止蛋白質表達。單一的miRNA可以調控成千上萬的靶基因。研究表明，miRNA 可由病毒產(chǎn)生，例如流感病毒在宿主細胞復制中表達了 8種特異性miRNA(miRNA-1254， miRNA-1272, miRNA-17-5p， miRNA-17-3p， miRNA-106B， miRNA-106B， miRNA-124-a 和 miRNA-124)。研究還表明血清大多數(shù)miRNA都由囊泡包裹，對RNA酶抵抗防止了核酸酶的 降解，相對較為穩(wěn)定，室溫可穩(wěn)定4h，反復凍融兩次均不受影響，重現(xiàn)性和一致性比較好，非 常適合作臨床血清標志物，為疾病的早期診斷提供新思路。
[0003] 在基因組研究中，基因芯片技術平臺為解讀基因功能、快速鑒定提供了有效的手 段支持，廣泛應用于基因表達分析、病毒和細菌的鑒定、醫(yī)療診斷等領域。然而傳統(tǒng)的基因 芯片技術往往需要熒光、放射性、酶等標記或者需要PCR實現(xiàn)信號的擴增，操作過于繁瑣， 容易產(chǎn)生污染而且成本較高，難以適應大規(guī)模的基因的分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要提供一種操作簡便且可實現(xiàn)高通量檢測的miRNA檢測芯片、其制 作方法及應用。
[0005] -種miRNA檢測芯片，包括基底、設在所述基底上的鉻膜、設在所述鉻膜上的金 膜、在所述金膜上的以自組裝方式引入的12-巰基十二烷酸自組裝單層以及與所述自組裝 單層結合的RNA探針；所述自組裝單層通過巰基固定在所述金膜表面上；所述RNA探針含 有用于檢測待測miRNA的特異性序列，所述特異性序列可與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜 交；所述RAN探針的一端與自組裝單層之間通過酰胺鍵連接。
[0006] 在其中一個實施例中，所述鉻膜的厚度為1?2nm。
[0007] 在其中一個實施例中，所述金膜的厚度為50nm。
[0008] 在其中一個實施例中，所述RNA探針的另一端連接有生物素。
[0009] 在其中一個實施例中，所述RNA探針在所述特異性序列的兩端分別設有20個與所 述特異性序列直接連接的胸腺啼陡。
[0010] 在其中一個實施例中，所述特異性序列為呼吸道病毒的保守序列。
[0011] 在其中一個實施例中，所述RNA探針的序列為序列表中的SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3中的至少一種。
[0012] 一種含有上述任一實施例所述的miRNA檢測芯片的miRNA檢測試劑盒。
[0013] 一種miRNA檢測芯片的制作方法，包括如下步驟：
[0014] 構建用于檢測待測miRNA的特異性序列，并在所述特異性序列的一端進行氨基修 飾，所述特異性序列可與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜交；
[0015] 在潔凈的基底表面蒸鍍一層鉻膜，再在所述鉻膜表面蒸鍍一層金膜，將含有所述 鉻膜及所述金膜的基底清洗干凈后置于濃度為IOmmoVL的12-巰基十二烷酸乙醇溶液中， 室溫過夜孵育，使12-巰基十二烷酸通過巰基自組裝于所述金膜的表面，取出后洗凈，并用 氮氣吹干，得到修飾有羧基的芯片；
[0016] 將所述修飾有羧基的芯片置于1-乙基_3 (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺與N-羥基 丁二酰亞胺的混合溶液中對所述金膜表面的羧基進行活化處理，將所述特異性序列點樣至 所述芯片表面，所述特異性序列一端的氨基與所述羧基反應形成酰胺鍵而將所述特異性序 列固定在所述芯片表面，即得到所述miRNA檢測芯片。
[0017] 一種miRNA的檢測方法，包括如下步驟：
[0018] 提取待測miRNA，并以提取的所述miRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成互補 的cDNA樣本；
[0019] 將上述任一實施例所述的miRNA檢測芯片或者按照上述方法制作的miRNA檢測芯 片置于表面等離子共振成像儀的反應池中，以濃度為10mM、pH為7. 4的磷酸緩沖液作為流 動相，流速設定為2 μ L/s，待成像儀的基線穩(wěn)定后，通入濃度為10 μ g/mL的鏈霉親和素溶 液使RNA探針的自由末端的生物素連接上鏈霉親和素，從而后續(xù)RNA探針的降解具有信號 放大效果；
[0020] 向cDNA樣本中加入RNase H，并將含有RNase H的cDNA樣本置于所述反應池中， 使用所述成像儀實時檢測miRNA檢測芯片表面的RNA探針降解情況，通過比較通入cDNA樣 本前后的基線變化值獲得miRNA檢測芯片表面的RNA探針的降解量，從而得到待測miRNA 的含量。
[0021] 上述miRNA檢測芯片中的特異性RNA序列可以與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜 交形成雜交序列，當待測miRNA逆轉錄形成的cDNA能與該特異性RNA序列雜交時，再使用 RNase H酶解RNA-cDNA雜交體中特異性RNA序列，同時釋放的cDNA可以反復與芯片表面的 特異性RNA序列結合，再水解，直到芯片表面的RAN探針完全被水解，從而形成了一種基于 非PCR的放大檢測效應，操作簡便，可以實現(xiàn)miRNA的高通量快速檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為一實施方式的miRNA檢測芯片的結構示意圖；
[0023] 圖2為表面等離子共振成像儀監(jiān)測通入HlNlcDNA分析物(含有RNase H的濃度為 I. 0單位/ μ L)后miRNA檢測芯片表面RNA探針的降解過程示意圖。

【具體實施方式】
[0024] 下面主要結合附圖及具體實施例對miRNA檢測芯片、其制備方法和應用作進一步 詳細的說明。
[0025] 如圖1所示，一實施方式的miRNA檢測芯片100包括基底110、鉻膜120、金膜130、 自組裝單層140以及RNA探針150。
[0026] 基底110為平板狀的玻璃基片。鉻膜120設在基底110的一側表面上，厚度為1? 2nm。金膜130設在鉻膜120上，厚度為50nm。
[0027] 12-巰基十二烷酸形成的自組裝單層140-端通過巰基固定在金膜120表面上，另 一端為羧基端。
[0028] 在本實施方式中，RNA探針150包括一根據(jù)呼吸道病毒的保守區(qū)序列設計的特異 性序列、分別位于該特異性序列兩端的20個胸腺嘧啶（T)、與一端的胸腺嘧啶端部連接的 生物素以及與另一端的胸腺嘧啶端部連接的氨基（-NH 2)。具體在本實施方式中，RNA探針 150的序列包括序列表中的SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3。可以理解，在其他 實施方式中，RNA探針150的結構不限于此，如可以沒有胸腺嘧啶重復序列或者只在特異性 序列的一端設置重復的胸腺嘧啶序列等；胸腺嘧啶的數(shù)量也不限于20個；RNA探針150的 序列也可以為其他疾病病毒保守區(qū)序列等。在一端的胸腺嘧啶的端部連接生物素，可以在 后續(xù)的檢測過程中構成生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)實現(xiàn)檢測信號的放大作用。
[0029] RNA探針150上的氨基可以與自組裝單層140的羧基反應生成酰胺鍵，從而RAN探 針140可通過反應生成的酰胺鍵固定在金膜130上。
[0030] 本實施方式還提供了 一種含有上述任一實施例所述的miRNA檢測芯片的miRNA檢 測試劑盒。該miRNA檢測試劑盒進一步還包括鏈霉親和素溶液及核糖核酸酶H (RNase H) 等。
[0031] 此外，本實施方式還提供了一種miRNA檢測芯片的制作方法，其包括如下步驟：
[0032] 步驟一：構建用于檢測待測miRNA的特異性序列，并在特異性序列的一端進行氨 基修飾，特異性序列可與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜交。
[0033] 在本實施方式中，在步驟一中，還包括在構建的特異性序列兩端分別連接20個胸 腺嘧啶的步驟，再在特異性序列一端的胸腺嘧啶的端部進行氨基修飾。進一步，還包括在特 異性序列另一端的胸腺嘧啶的端部進行生物素修飾的步驟，以方便在后續(xù)檢測過程中形成 生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)來實現(xiàn)檢測信號的放大。
[0034] 步驟二：在潔凈的基底表面蒸鍍一層鉻膜，再在鉻膜表面蒸鍍一層金膜，將含有鉻 膜及金膜的基底清洗干凈后置于濃度為IOmmoVL的12-巰基十二烷酸乙醇溶液中，室溫過 夜孵育，使12-巰基十二烷酸通過巰基自組裝于金膜的表面，取出后洗凈，并用氮氣吹干， 得到修飾有羧基的芯片。
[0035] 在本實施方是中，制作的鉻膜的厚度為1?2nm ;制作的金膜的厚度為50nm。
[0036] 步驟三：將修飾有羧基的芯片置于1-乙基-3( 3-二甲氨基丙基)碳二亞胺與N-羥 基丁二酰亞胺的混合溶液中對金膜表面的羧基進行活化處理，將特異性序列點樣至芯片表 面，特異性序列一端的氨基與羧基反應形成酰胺鍵而將特異性序列固定在芯片表面，即得 到miRNA檢測芯片。
[0037]
[0038] 上述miRNA檢測芯片中的特異性RNA序列可以與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜 交形成雜交序列，當待測miRNA逆轉錄形成的cDNA能與該特異性RNA序列雜交時，再使用 RNase H酶解RNA-cDNA雜交體中特異性RNA序列，同時釋放的cDNA可以反復與芯片表面的 特異性RNA序列結合，再水解，直到芯片表面的RAN探針完全被水解，從而形成了一種基于 非PCR的放大檢測效應，操作簡便，可以實現(xiàn)miRNA的高通量快速檢測。
[0039] 進一步，本實施方式還提供了一種miRNA的檢測方法，其包括如下步驟：
[0040] 提取待測miRNA，并以提取的該miRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成互補的 cDNA樣本；
[0041] 將上述制作的miRNA檢測芯片置于表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance Imaging，SPR)成像儀的反應池中，以濃度為10mM、pH為7. 4的磷酸緩沖液作為流動相，流速 設定為2 μ L/s，待成像儀的基線穩(wěn)定后，通入濃度為10 μ g/mL的鏈霉親和素溶液使RNA探 針的自由末端的生物素連接上鏈霉親和素，從而后續(xù)RNA探針的降解具有信號放大效果；
[0042] 向cDNA樣本中加入RNase H，并將含有RNase H的cDNA樣本置于SPR成像儀的反 應池中，SPR成像儀實時檢測miRNA檢測芯片表面的RNA探針降解情況，通過比較通入cDNA 樣本前后的基線變化值獲得miRNA檢測芯片表面的RNA探針的降解量，從而得到待測miRNA 的含量。
[0043] 以下為具體實施例部分：
[0044] 試劑：RNA提取試劑盒(北京天澤基因產(chǎn)品），鹽酸乙醇胺（2-Aminoethanol Hydrochloride)(日本TCI公司產(chǎn)品）;1_乙基-3 (3-二甲氨基丙基）碳二亞胺（1-61:1171-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydr-ochloride, EDC)(力口拿大 Bio Basic Inc 公司產(chǎn)品）;N-輕基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccini-mide, NHS)(上海共價化學科技有限公 司產(chǎn)品）；無水乙醇(純度：分析純，廣東光華化學廠有限公司產(chǎn)品）；所有其他試劑均為分析 純。
[0045] 儀器：ClOOOThermal cycler PCR擴增儀(美國伯樂公司），離心機，漩潤混勻器(德 國IKAMS公司），Hybex Microsamp Incubator，ND-1000微量紫外可見光分光光度計(美 國Nanodrop公司）（用途：應用于測定蛋白質和DNA的濃度)，SPR成像儀（PlexArray? Analyzer第二代產(chǎn)品）。
[0046] RNA探針的合成：
[0047] 甲流 HlNl :Biotin-T2(l-GGACUACCACGAUUCAAAUGUG-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 1);
[0048] 呼吸道合胞病毒（RSV) :Biotin-T2(l-CCAUGUGAAUUCCCUGCAUCAAU-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 2)；
[0049] 腺病毒（ADV) :Biotin-T2(l-CACCGAGACGUACUUCAGCCUG-T2(l-NH 2 (SEQ ID NO. 3);
[0050] 其中，Biotin為生物素。
[0051] 實驗步驟：
[0052] I. RAN探針的合成：從NCBI上下載所需的GenBank文件，利用軟件premier5在呼 吸道病毒（HlNl、RSV及ADV)的保守區(qū)序列上設計RNA探針的特異性序列。再在該特異性 序列的5'端進行了生物素修飾，以使生物素標記的探針可以通過鏈霉親和素實現(xiàn)信號放大 的作用。在RNA探針的另一端進行了氨基修飾，為了便于探針固定及保證探針雜交效率，進 一步，本實施例在特異性序列的3'和5'端添加了 20個poly (T)。poly (T)作為間隔臂 可使RNA探針在固相表面充分伸展以利于探針的固定和雜交反應。合成的RNA探針的序列 為序列表中的 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 及 SEQ ID NO. 3。
[0053] 2. miRNA檢測芯片制作：在潔凈的玻璃基片表面蒸鍍或磁控濺射1?2nm厚度的 鉻膜，再在鉻膜的表面蒸鍍或者磁控濺射50nm的金膜。得到的芯片經(jīng)過清洗后立即浸泡入 10mmol/L12-巰基十二烷酸乙醇溶液中，室溫過夜孵育，使巰基有序的自組裝于金膜表面， 12-巰基十二烷酸的羧基游離，取出后，用無水乙醇反復沖洗5次，再用去離子水洗凈，氮氣 吹干；將上述12-巰基十二烷酸修飾的芯片用新配置的EDC/NHS溶液活化表面的羧基基團， 將呼吸道病毒相關的RNA探針用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini或手工點樣于芯片 的特定區(qū)域，得到所述miRNA檢測芯片。
[0054] 3.樣品的處理：呼吸道病毒的RNA提取采用北京天澤試劑公司的RNA提取試劑 盒，具體實驗操作流程按照試劑盒的說明逐步操作。以樣本中提取的miRNA為模板，在逆轉 錄酶的作用下，合成出互補的cDNA樣本。
[0055] 4. SPR快速檢測：采用的SPR成像儀為PkxArray? Analyzer第二代產(chǎn)品，將 制作的miRNA檢測芯片按照儀器的操作流程安裝在SPR儀器中。并以磷酸緩沖溶液（PBS buffer，濃度為10mM，pH為7. 4)作為流動相，流速設定為2L/s。待成像儀的基線穩(wěn)定后，通 入鏈霉親和素（Streptavidin，濃度為10g/mL) 500s,使RNA探針的末端結合鏈霉親和素， 使得后續(xù)RNA的降解具有信號放大效果。在cDNA樣本中加入RNase H，使得最終的RNase H的濃度為I. O單位/L。將含有RNase H的cDNA樣本通入SPR成像儀的反應池中，SPR實 時檢測表面RNA降解情況。通過比較通入樣品的前后的基線變化值獲得表面RNA探針的降 解量。
[0056] 實驗結果
[0057] 本實施例以檢測流感病毒HlNl為實驗組，RSV和ADV為對照組，利用咽拭子提取 病毒miRNA，以提取的miRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA作為檢測樣 本。咽拭子的采集對象為經(jīng)深圳口岸入境、紅外探測儀有發(fā)熱跡象、初步檢查具有流行性感 冒癥狀的病例。
[0058] 實驗中通過HlNl病毒的cDNA樣品時，HlNl的RNA探針點的SPR信號顯著下降， 在1小時內(nèi)SPR信號下降達到1000RU，表明miRNA檢測芯片表面的質量減少。其他兩種探 針RSV和ADV對應的RNA探針點略有微小的下降（5個小時內(nèi)僅僅下降260和382RU)，具體 見表1和圖2。
[0059] 表I. RNA微陣列芯片中RNA探針降解隨時間的變化情況
[0060]

【權利要求】
1. 一種miRNA檢測芯片，其特征在于，包括基底、設在所述基底上的鉻膜、設在所述鉻 膜上的金膜、在所述金膜上的以自組裝方式引入的12-巰基十二烷酸自組裝單層以及與所 述自組裝單層結合的RNA探針；所述自組裝單層通過巰基固定在所述金膜表面上；所述RNA 探針含有用于檢測待測miRNA的特異性序列，所述特異性序列可與由miRNA逆轉錄形成的 cDNA雜交；所述RAN探針的一端與自組裝單層之間通過酰胺鍵連接。
2. 如權利要求1所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述鉻膜的厚度為1?2nm。
3. 如權利要求1所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述金膜的厚度為50nm。
4. 如權利要求1所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述RNA探針的另一端連接有生 物素。
5. 如權利要求4所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述RNA探針在所述特異性序列 的兩端分別設有20個與所述特異性序列直接連接的胸腺嘧啶。
6. 如權利要求5所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述特異性序列為呼吸道病毒的 保守序列。
7. 如權利要求6所述的miRNA檢測芯片，其特征在于，所述RNA探針的序列為序列表中 的 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 及 SEQ ID NO. 3 中的至少一種。
8. -種含有如權利要求1-7中任一項所述的miRNA檢測芯片的miRNA檢測試劑盒。
9. 一種miRNA檢測芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步驟： 構建用于檢測待測miRNA的特異性序列，并在所述特異性序列的一端進行氨基修飾， 所述特異性序列可與由miRNA逆轉錄形成的cDNA雜交； 在潔凈的基底表面蒸鍍一層鉻膜，再在所述鉻膜表面蒸鍍一層金膜，將含有所述鉻膜 及所述金膜的基底清洗干凈后置于濃度為10mm〇l/L的12-巰基十二烷酸乙醇溶液中，室溫 過夜孵育，使12-巰基十二烷酸通過巰基自組裝于所述金膜的表面，取出后洗凈，并用氮氣 吹干，得到修飾有羧基的芯片； 將所述修飾有羧基的芯片置于1-乙基-3 (3-二甲氨基丙基)碳二亞胺與N-羥基丁二 酰亞胺的混合溶液中對所述金膜表面的羧基進行活化處理，將所述特異性序列點樣至所述 芯片表面，所述特異性序列一端的氨基與所述羧基反應形成酰胺鍵而將所述特異性序列固 定在所述芯片表面，即得到所述miRNA檢測芯片。
10. -種miRNA的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 提取待測miRNA，并以提取的所述miRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成互補的 cDNA樣本； 將如權利要求1-7中任一項所述的miRNA檢測芯片置于表面等離子共振成像儀的反應 池中，以濃度為10mM、pH為7. 4的磷酸緩沖液作為流動相，流速設定為2 μ L/s，待成像儀的 基線穩(wěn)定后，通入濃度為10 μ g/mL的鏈霉親和素溶液使RNA探針的自由末端的生物素連接 上鏈霉親和素，從而后續(xù)RNA探針的降解具有信號放大效果； 向cDNA樣本中加入RNase H，并將含有RNase Η的cDNA樣本置于所述反應池中，使用 所述成像儀實時檢測miRNA檢測芯片表面的RNA探針降解情況，通過比較通入cDNA樣本前 后的基線變化值獲得miRNA檢測芯片表面的RNA探針的降解量，從而得到待測miRNA的含 量。
【文檔編號】C40B50/06GK104293898SQ201310302860
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權日:2013年7月17日
【發(fā)明者】何建安, 顧大勇, 姚旌羽, 劉春曉, 史蕾, 趙純中, 徐云慶 申請人:深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心