一種人生理特征基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人生理特征基因芯片，包括步驟：1）提取受檢者樣本DNA；2）對樣本DNA進行目的基因的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標記；3）熒光素標記的PCR產(chǎn)物進行基因芯片雜交，檢測目的基因多態(tài)性位點；4）根據(jù)步驟3）得到的基因分型結(jié)果，評估受檢者的生物學性狀。通過相關(guān)基因分型，可以對受檢者進行性格、情感、智商、閱讀、數(shù)學、飲酒、成癮性、運動和體質(zhì)等生理特征預(yù)估，從而制訂最科學的個體化培養(yǎng)計劃，提高教育培養(yǎng)成功率。
【專利說明】-種人生理特征基因芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)和檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基因芯片，以及包括該 芯片的檢測人生理特征相關(guān)基因各基因型的寡核苷酸芯片套組和方法。
[0002] 背景
[0003] 通過比較同卵雙生和異卵雙生孿生子的群體遺傳學研究表明，人體的生長發(fā)育以 及大腦各部分功能的發(fā)展與完善受到遺傳因素和環(huán)境因素的影響和制約，其中大約40-50% 受遺傳因素的影響。由于遺傳因素目前人們無法掌控，而環(huán)境因素卻是人們可以創(chuàng)造和調(diào) 節(jié)，因此可根據(jù)兒童本身的遺傳因素，為其創(chuàng)設(shè)量身定做的外部環(huán)境(包括自然和社會環(huán) 境)，強化優(yōu)勢天賦，消除潛在的不良人格，因材施教，進行個性化教育培養(yǎng)。
[0004] 三維人格問卷將人格分為三個相互獨立的維度，即獵奇性（Novelty-Seeking, NS)、躲避傷害性（Harm-Avoidance，HA)和獎賞依賴性（Reward-Dependence，RD)，分別與多 巴胺（DA)神經(jīng)遞質(zhì)、5-羥色胺（5-HT)神經(jīng)遞質(zhì)和去甲腎上腺素（NA)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。多巴 胺主要與大腦的情欲和感覺有關(guān)，傳遞興奮及快樂的信息，也與上癮有關(guān)。腦部多巴胺含量 多，人會變得極富好奇心，愛冒險，積極進取。愛情其實就是腦里產(chǎn)生大量多巴胺作用的結(jié) 果。所以，吸煙和吸毒都可以增加多巴胺的分泌，使上癮者感到開心及興奮。若多巴胺較少 時，便會導致優(yōu)柔寡斷而冷漠的個性，缺乏啟動力和積極性。5-羥色胺可以直接影響人的心 理功能和生理功能，比如人的喜怒哀樂、睡眠、食欲等。血液中5-羥色胺水平低，兒茶酚胺 濃度較高的人脾氣容易急躁，性格比常人剛強、倔犟，遇事好沖動。反之，血液中5-羥色胺 濃度較高，兒茶酚胺濃度偏低的人性情比常人溫和，遇事較冷靜，不易產(chǎn)生急躁情緒。與這 些神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的遺傳變異在不同程度上影響了個體的人格。大腦是一切心理活動的 物質(zhì)基礎(chǔ)，大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育差異不僅影響個體的智商，同時也影響個體的人格。如BDNF基因 參與與大腦海馬發(fā)育，低BDNF活性的個體比正常人的大腦海馬的體積要小11%，從而影響 部分記憶功能，并與焦慮、抑郁等相關(guān)。不良性格的人在人際交往、社會支持度和事業(yè)等方 面，相對不易獲得成功，嚴重者甚至存在嚴重的心理障礙、自殺等精神疾病，關(guān)系到社會的 穩(wěn)定。另一方面，個體運動能力等也受到遺傳因素影響。
[0005] 在兒童教育培養(yǎng)上，年紀越小可塑性越強，良好的人格越容易培養(yǎng)。利用人類行為 遺傳學的研究進展，通過檢測生物學性狀相關(guān)基因，即可判斷兒童最初的潛能，以正確的 撫養(yǎng)方式對孩子的先天弱點進行"基因治療"，對孩子的先天優(yōu)點進行強化。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 1.發(fā)明目的：
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人生物學性狀基因檢測芯片，能有效地檢測 生物學性狀相關(guān)基因的多態(tài)性，從而使家長、教師及心理醫(yī)生能及時了解孩子性格、情感、 智商、音樂、運動和體質(zhì)等相關(guān)遺傳信息，預(yù)測兒童最初的性格和潛能，并根據(jù)兒童所具有 的遺傳特性，創(chuàng)造合適的生活環(huán)境，制定針對性的教育計劃，制定合理的個性化培養(yǎng)方案， 充分發(fā)揮兒童的優(yōu)勢天賦，取長補短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長。為此，本發(fā)明還要提供 應(yīng)用該芯片檢測人生物學性狀相關(guān)基因多態(tài)性的方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0009] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種人生物學性狀遺傳學檢測芯片，包括固相載體 和探針，所述探針與待測的人生物學性狀遺傳學相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列 進行雜交。
[0010] 本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相 容，不會影響檢測結(jié)果就可以。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素 膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
[0011] 所述待測人生物學性狀遺傳學相關(guān)多態(tài)性包括rs2770296、rs2350780、 rs2061174、rs4680、rsl042713、rs2242446、rsl799971、rs6265、rsl3212041、rs429358、 MAOA G941T、rsl800955、rsl815739、rs671、rsl695、rs7412、rs2143340、rs363449 和 MSTN C66493737T。
[0012] 所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長度沒 有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長度對雜交效率、信號 特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基 對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對之間的為最佳。所述探針的自身互補 序列最好少于6個堿基對，以免影響雜交效率。
[0013] 本發(fā)明檢測芯片的探針為DNA，包括：⑴與待測rs2770296雜交的（a)SEQ ID N0:l?SEQIDN0:2所示序列，（b)SEQIDN0:l?SEQIDN0:2所示序列中每條序列的 互補鏈，（c)與SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 2所示的序列中每條序列有至少70%同源性的 序列；
[0014] (2)與待測rs2350780 雜交的（a)SEQIDN0:3?SEQIDN0:4所示序列，（b)SEQ ID N0:3?SEQ ID N0:4所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:3?SEQ ID N0:4所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0015] (3)與待測 rs2061174 雜交的（a)SEQ ID N0:5 ?SEQ ID N0:6 所示序列，（b) SEQ ID N0:5?SEQ ID N0:6所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:5?SEQ ID N0:6所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0016] ⑷與待測rs4680 雜交的（a)SEQIDN0:7?SEQIDN0:8所示序列，（b)SEQID N0:7?SEQ ID N0:8所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:7?SEQ ID N0:8 所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0017] (5)與待測 rsl042713 雜交的（a)SEQ ID N0:9 ?SEQ ID N0:10 所示序列，（b) SEQ ID N0:9?SEQ ID NO: 10所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:9?SEQ ID NO: 10所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0018] (6)與待測rs224244 6 雜交的（a)SEQIDN0:ll?SEQIDN0:12所示序列，（b) SEQ ID N0:11?SEQ ID N0:12所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:11?SEQ ID NO: 12所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0019] (7)與待測rsl799971 雜交的（a)SEQIDN0:13?SEQIDN0:14所示序列，（b) SEQ ID N0:13?SEQ ID N0:14所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:13?SEQ ID NO: 14所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0020] (8)與待測rs6265 雜交的（a)SEQIDN0:15?SEQIDN0:16所示序列，（b)SEQ ID NO: 15?SEQ ID NO: 16所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID NO: 15?SEQ ID NO: 16所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0021] (9)與待測rsl3212041 雜交的（a)SEQIDN0:17?SEQIDN0:18所示序列，（b) SEQ ID N0:17?SEQ ID N0:18所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:17?SEQ ID NO: 18所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0022] (10)與待測 rs429358 雜交的（a)SEQ ID N0:19 ?SEQ ID N0:20 所示序列，（b) SEQ ID N0:19?SEQ ID N0:20所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:19?SEQ ID N0:20所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0023] (11)與待測 ΜΑ0Α G941T 雜交的（a)SEQ ID N0:21 ?SEQ ID N0:22 所示序列， (b)SEQ ID N0:21?SEQ ID N0:22所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:21? SEQ ID N0:22所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0024] (12)與待測rsl800955 雜交的（a)SEQIDN0:23?SEQIDN0:24所示序列，（b) SEQ ID N0:23?SEQ ID N0:24所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:23? SEQ ID N0:24所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0025] (13)與待測rsl815739 雜交的（a)SEQIDN0:25?SEQIDN0:26所示序列，（b) SEQ ID N0:25?SEQ ID N0:26所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:25?SEQ ID N0:26所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0026] (14)與待測 rs671 雜交的（a)SEQ ID N0:27 ?SEQ ID N0:28 所示序列，（b)SEQ ID NO: 27?SEQ ID NO: 28所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID NO: 27?SEQ ID N0:28所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0027] (15)與待測rsl695 雜交的（a)SEQIDN0:29?SEQIDN0:30所示序列，（b)SEQ ID N0:29?SEQ ID N0:30所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:29?SEQ ID N0:30所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0028] (16)與待測rs7412雜交的（a)SEQIDN0:31?SEQIDN0:32所示序列，（b)SEQ ID N0:31?SEQ ID N0:32所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:31?SEQ ID N0:32所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0029] (17)與待測rs2143340 雜交的（a)SEQIDN0:33?SEQIDN0:34所示序列，（b) SEQ ID N0:33?SEQ ID N0:34所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:33?SEQ ID N0:34所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0030] (18)與待測 rs363449 雜交的（a)SEQ ID N0:35 ?SEQ ID N0:36 所示序列，（b) SEQ ID N0:35?SEQ ID N0:36所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:35?SEQ ID N0:36所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0031] (19)與待測 MSTN C66493737T 雜交的（a)SEQ ID N0:37 ?SEQ ID N0:38 所示 序列，（b) SEQ ID NO: 37?SEQ ID NO: 38所示序列中每條序列的互補鏈，（c)與SEQ ID N0:37?SEQ ID N0:38所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0032] 優(yōu)選的，本發(fā)明檢測芯片的探針選自SEQ ID N0:1?SEQ ID N0:38所示序列。
[0033] 所述探針序列可包含1?10個錯配堿基，較佳地，可包含1?5個錯配堿基，更佳 地，可包含1?2個錯配堿基。
[0034] 本發(fā)明檢測芯片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自：陰性對照探針、 陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。
[0035] 所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提 供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進行[AfanassievV, HanemannV, Wolf1 S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res. 2000， 28: e66; USA Patent No. 5556752]。連 接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括15?30個功能基團長度。連接臂可以選用 適當形式的功能基團，如Poly T (A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T (A、C或G) 的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
[0036] 所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過 C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時 使用）。娃氧燒鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的二氣甲娃燒基或二燒氧基甲娃燒基等 基團反應(yīng)完成。氣基燒基娃燒、輕基燒基娃燒、2 -輕乙基一氣丙基二乙氧基娃燒、輕乙基 一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團。
[0037] 所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5' -NH2修飾、5' -SH修飾、5' -Poly T (A、 C或G)修飾、5' -生物素修飾、3' -NH2修飾、3' -SH修飾、3' -Poly T (A、C或G)修飾和 3' -生物素修飾等。
[0038] 所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過標記的，所述標記包括熒光素標 記、生物素標記、放射性元素標記、酶標記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標記。
[0039] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片對人生物學性狀進行遺傳學檢測 的方法，包括如下步驟：
[0040] (1)在固相載體表面點載與待測人生物學性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/ 或其互補序列進行雜交的探針；
[0041] (2)抽提待測樣品的核酸；
[0042] (3)制備待測人生物學性狀相關(guān)基因的目的核苷酸序列；
[0043] (4)標記步驟⑶的目的核苷酸序列；
[0044] (5)在適于與步驟（1)所述的點載在固相載體上的探針進行雜交的條件下，加入 經(jīng)標記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；
[0045] (6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
[0046] (7)將步驟（6)中的基因分型結(jié)果導入人生物學性狀分析軟件進行受檢者生物學 性狀分析。
[0047] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片對人生物學性狀進行基因多態(tài) 性檢測的方法，包括如下步驟：
[0048] (1)標記與待測生物學性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/或其互補序列進行 雜交的探針；
[0049] (2)抽提待測樣品的核酸；
[0050] (3)制備待測生物學性狀相關(guān)基因多態(tài)性的目的核苷酸序列；
[0051] (4)在固相載體表面點載步驟（3)所述的目的核苷酸序列；
[0052] (5)在適于與步驟（4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進行雜交的條 件下，加入經(jīng)標記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；
[0053] (6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。
[0054] (7)將步驟（6)中的基因分型結(jié)果導入人生物學性狀分析軟件進行受檢者生物學 性狀分析。
[0055] 所述目的核苷酸序列的制備可包括擴增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細胞 直接擴增，也可用抽提的靶核酸直接擴增。如用磁珠從全血中分離白細胞，直接用分離的白 細胞或用全血抽提的核酸作模板，擴增目的核酸序列。擴增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA 可含有熒光或生物素標記，標記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述 芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過變性等處理后也于本發(fā) 明所述芯片雜交。
[0056] 目的核苷酸序列可使用任何適當?shù)臄U增方法進行富集，如：聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR),多重 PCR,連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction, LCR)，滾環(huán)擴增（rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的擴增（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA),鏈置換擴增（strand displacement amplification, SDA)和轉(zhuǎn)錄介導的擴增（transcription medicated amplification, TMA) 等。
[0057] 在本發(fā)明的一個實施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴增方法，該方法所 用引物含有SEQ ID N0:39?SEQ ID N0:78所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈。
[0058] 所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標記。探針在合成引入標記，目的核苷酸 序列可以在擴增中引入標記，或者擴增后用合適的方法引入標記。
[0059] 合適的標記包括熒光標記、放射性同位素標記、發(fā)色團、發(fā)光體、FRET、酶、生物素 或有特殊結(jié)合配體的配基。
[0060] 本發(fā)明方法的雜交可在任何適當?shù)臏囟认逻M行，如25°C?65°C，所述雜交時間為 2分鐘?18小時?？梢愿淖冸s交條件以提高或降低雜交的嚴謹程度、雜交特異性。
[0061] 本發(fā)明生物學性狀基因芯片及其檢測套組和方法，使家長、教師及心理醫(yī)生及時 掌握兒童大量遺傳信息，從而可以結(jié)合兒童實際情況，制定個體化的教育培養(yǎng)方案，充分發(fā) 揮兒童的優(yōu)勢天賦，取長補短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長。同時對于心理疾病患者，也可 為臨床心理醫(yī)生提供用藥參考。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0062] 圖1是本發(fā)明的實施例1中多重PCR擴增后的電泳檢測結(jié)果圖；
[0063] 圖2是本發(fā)明的實施例1中PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測結(jié)果圖；
[0064] 圖3是本發(fā)明實施例1的人生物學性狀遺傳學檢測芯片的雜交結(jié)果圖； 圖4是本發(fā)明實施例1的電泳檢測基因缺失結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0065] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0066] 實施例1反向雜交
[0067] 1.基因芯片的制備
[0068] (1)探針溶解
[0069] 將SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 38所示序列探針的每條探針用TE溶液稀釋，終濃 度為10 mM。將濃度為10 mM的探針與濃度為200 mM的PBS溶液于384孔板中等體積混 合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20°C保存，以備點樣使用。
[0070] ⑵點樣
[0071] 將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材 質(zhì)的固相載體片基上。片基米用Cell Associates CSS-100醒基片基，GeneMachine公司 的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度：65 - 75%(以FullMoon片基為準)，溫度為25°C 的條件下點樣，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。
[0072] 2.待測樣品的處理和標記
[0073] (1)人基因組DNA抽提及目的基因的擴增
[0074] 采用 FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN，Cat. No. 51206)試劑盒抽提人外周 血中基因組DNA。取lul進行電泳（1%瓊脂糖凝膠，0. 5XTBE，EB，80MV，1. 5小時電泳)，在 FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進 行定量。
[0075] 用 rs2770296 的引物（SEQ ID N0:39、40)、rs2350780 的引物（SEQ ID N0:41、 42)、rs2061174 的引物（SEQ ID N0:43、44)、rs4680 的引物（SEQ ID N0:45、46)、rsl042713 的引物（SEQ ID N0:47 ?48)、rs2242446 的引物（SEQ ID N0:49、50)、rsl799971 的引 物（SEQ ID N0:51、52)、rs6265 的引物（SEQ ID N0:53、54)、rsl3212041 的引物（SEQ ID N0:55、56)、rs429358 的引物（SEQIDN0:57、58)、MA0AG941T的引物（SEQIDN0:59、 60)、rsl800955 的引物（SEQ ID N0:61、62)、rsl815739 的引物（SEQ ID N0:63、64)、rs671 的引物（SEQ ID N0:65、66)、rsl695 的引物（SEQ ID N0:67、68)、rs7412 的引物（SEQ ID N0:69、70)、rs2143340 的引物（SEQ ID N0:71、72)、rs363449 的引物（SEQ ID N0:73、74) 和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID N0:75?76)進行目的核苷酸序列的擴增。PCR擴 增用30 μ?反應(yīng)體系進行，反應(yīng)體系是0. 3 mM dNTP、10 mM Tris-HCl、50 mM KC1、2 mM MgC12、20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的濃度 0.16 μΜ、基因組 DNA 10ng，Taq 酶 0.6 U (Takara)。應(yīng)用 Touch-down PCR 反應(yīng)程序[Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991，19: 4008] :94°C變性5 min ;94°C變性40 s， 64°C退火1 min，每個循環(huán)降低0. 5°C，72°C延伸50 s，共10個循環(huán)；然后94°C變性40 s， 59°〇退火4〇8,721：延伸5〇8，共30個循環(huán)；最后721：延伸5 1^11。？0?結(jié)束后用1.5% 瓊脂糖凝膠檢測擴增結(jié)果。
[0076] 當進行多重PCR反應(yīng)時，將SEQ ID N0:39?SEQ ID N0:78所示序列的引物放入 一個反應(yīng)體系中進行擴增，體系為5〇μ1。多重PCR的反應(yīng)體系為：每種dNTP 0. 3 Mmol/L， Tricine-KOH (PH8. 7)40 mmol/L, KC1 16 mmol/L, MgCl23. 5 mmol/L, BSA 3.75 μδ/πι1, 每條引物 2Mmol/L，DNA 80ng 和 2.2X Titanium Taq DNA 聚合酶（Clontech，USA)。多重 PCR反應(yīng)條件：95°C變性3 min;95°C變性30s，66°C退火2 min，68°C延伸4 min，共40個 循環(huán)；最后68°C延長10 min。PCR擴增后，取3 μ? PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳 結(jié)果見圖1。這些PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后可用于下面的雜交步驟。
[0077] (2) PCR產(chǎn)物純化和片段化
[0078] 每個樣品的所有 PCR 產(chǎn)物混合，用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)純化。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測定濃度后，用DNase I進行片段化。片段化的 反應(yīng)體系包括：30 μ?純化PCR產(chǎn)物（10 Pg)，4 μ?的10X DNase I緩沖液，0. 12 μ?的 DNase Ι，5. 88 μ?的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化后的 產(chǎn)物跑4%瓊脂糖凝膠，保證絕大多數(shù)的片段處于30-200個堿基對，電泳檢測結(jié)果如圖2所 /_J、1 〇
[0079] (3)熒光素標記
[0080] 利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3'末端進行熒光素標記，標記的40 μ?反應(yīng)體系包括： 25 μ?片段化PCR產(chǎn)物，8 μ?的5Χ脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，1 μ?的CY3-N6_ddCTP (1 mM)，3 μ?的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（20 υ/μ1)，3 μ?的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴120min，然 后 95°C加熱 15min。
[0081] 3.雜交、洗滌和結(jié)果檢測
[0082] 熒光標記的PCR產(chǎn)物95°C變性10 min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng)20 μ? 體系包括：熒光素標記的 PCR 產(chǎn)物 15 μ1，20Χ SSPE 1.2 μ1，1% Triton 0.2 μ?，10Χ Denhandts 0.9 μ?，甲酰胺 0.5 μ?，ddH20 2.2 μ?。反應(yīng)條件為 48°C溫浴 120 min，然后相 繼用 IX 洗滌緩沖液 I (5X SSC，0. 1% SDS)、1X 洗滌緩沖液II (2X SSC，0. 1% SDS)和 IX 洗滌緩沖液IIK1X SSC)在42°C各洗滌10 min，最后用ddH20洗滌0. 5 min。
[0083] 洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進行掃描(也可以 用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePix Pro 處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件利用人生物學性狀評估軟件(上海芯超生物科技 有限公司）進行處理就可以得到受檢者生物學性狀的結(jié)果，從而指導家長、教育學家或心理 醫(yī)生為制定個性化的教育方案或心理治療方案。
[0084] 實施例2正向雜交
[0085] 1.人生物學性狀相關(guān)基因多態(tài)性的擴增和芯片制備
[0086] 用 rs2770296 的引物（SEQ ID N0:39、40)、rs2350780 的引物（SEQ ID N0:41、 42)、rs2061174 的引物（SEQ ID N0:43、44)、rs4680 的引物（SEQ ID N0:45、46)、rsl042713 的引物（SEQ ID N0:47 ?48)、rs2242446 的引物（SEQ ID N0:49、50)、rsl799971 的引 物（SEQ ID N0:51、52)、rs6265 的引物（SEQ ID N0:53、54)、rsl3212041 的引物（SEQ ID N0:55、56)、rs429358 的引物（SEQ ID N0:57、58)、MA0A G941T 的引物（SEQ ID N0:59、60)、 rsl800955 的引物（SEQ ID N0:61、62)、rsl815739 的引物（SEQ ID N0:63、64)、rs671 的引 物（SEQ ID N0:65、66)、rsl695 的引物（SEQ ID N0:67、68)、rs7412 的引物（SEQ ID N0:69、 70)、rs2143340 的引物（SEQIDN0:71、72)、rs363449 的引物（SEQIDN0:73、74)和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID N0:75?76)擴增基因。PCR擴增用100 μ?反應(yīng)體系進行，反應(yīng) 體系是 0.3 mM dNTP，10 mM Tris-HCl，50 mM KC1，2 mM MgCl2,20% Q solution(Qiagen)， 0.01 μΜ SHV_F，0.2 μΜ SHV_R，100 ng 基因組 DNA，3 U Ex Taq 酶（Takara)。循環(huán)參數(shù)： 94°C變性5 min;94°C變性40 s，65°C退火1 min，72°C延伸1 min，共40個循環(huán)；最后72°C 延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen，Cat. No. 28106)純 化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400 ng/μ?。
[0087] 將濃度為400 ng/μ?的PCR產(chǎn)物與100%的DMS0于384孔板中等體積混合，以粘膠 片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200 ng/μ?的PCR產(chǎn)物通過接觸式點樣或噴 墨式點樣點載到玻片、娃片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度：65 - 75%(以FullMoon片基為準)，溫度為25°C的條件下點樣， 點樣完畢放置半小時后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37°C水化過夜，次日取出，600 mj交 聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。
[0088] 2.芯片雜交
[0089] 雜交反應(yīng)體系包括：2 nM熒光標記的寡核苷酸探針（SEQ ID N0:1?SEQ ID Ν0:54)，1·2 μ? 20X SSPE，0.2 μ? 1% Triton，0.9 μ? 10X Denhandts，0.5 μ? 甲酰胺， 2. 2 μ? ddH 20。反應(yīng)條件為50°C溫浴2小時，然后相繼用IX洗滌緩沖液I (5Χ SSC，0. 1% 305)、1\洗滌緩沖液11(2乂55(：，0.1%505)和1\洗滌緩沖液111(1\35〇在421：各洗 漆10 min,最后用ddH20洗漆10秒。洗漆后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦 激光掃描儀進行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。
[0090] 實施例3 :受檢者生物學性狀評估
[0091] 樣本：受檢者(女,4歲）
[0092] 按照實施例1的檢測操作流程進行檢測，其中，該受檢者目的基因多重PCR擴增后 的電泳檢測結(jié)果見圖1，PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測結(jié)果見圖2,檢測芯片雜交結(jié)果見圖 3, 電泳檢測基因缺失結(jié)果見圖4。將所得檢測結(jié)果導入人生物學性狀評估軟件，得到本實施 例中的受檢者的性格為A、情感為D、智商為B、閱讀為A、數(shù)學為C、飲酒為A、成癮性為B、運 動為C、體質(zhì)為B。
【權(quán)利要求】
1. 一種人生理特征基因芯片，包括步驟： 1) 提取受:檢者樣本DNA ; 2) 對樣本DNA進行目的基因 SNP的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標記，所述目的基 因 SNP 包括 rs2770296、rs2350780、rs2061174、rs4680、rsl042713、rs2242446、rsl799971、 rs6265、rsl3212041、rs429358、MAOA G941T、rsl800955、rsl815739、rs671、rsl695、 rs7412、rs2143340、rs363449 和 MSTN C66493737T ; 3) 熒光素標記的PCR產(chǎn)物進行基因芯片雜交，檢測目的基因的SNP位點； 4) 根據(jù)步驟3)得到的基因分型結(jié)果，評估受檢者的生物學性狀。
2. 如權(quán)利要求1所述的人生物學性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于：所 述步驟2)中的rs2770296 的引物是SEQIDN0:39?40所示序列的引物，rs2350780 的引 物是SEQ ID N0:41?42所示序列的引物，rs2061174的引物是SEQ ID N0:43?44所示序 列的引物，rs4680 的引物是SEQIDN0:45?46所示序列的引物，rsl042713 的引物是SEQ ID N0:47?48所示序列的引物，rs2242446的引物是SEQ ID N0:49?50所示序列的引物， rsl799971的引物是SEQ ID NO:51?52所示序列的引物，rs6265的引物是SEQ ID NO:53?54 所示序列的引物，rsl3212041 的引物是SEQIDN0:55?56所示序列的引物，rs429358 的引 物是SEQ ID NO:57?58所示序列的引物，MAOA G941T的引物是SEQ ID NO:59?60所示序列 的引物，rsl800955的引物是SEQ ID N0:61?62所示序列的引物，rsl815739的引物是SEQ ID N0:63?64所示序列的引物，rs671的引物是SEQ ID N0:65?66所示序列的引物，rsl695 的引物是SEQ ID N0:67?68所示序列的引物，rs7412的引物是SEQ ID N0:69?70所示序列 的引物，rs2143340的引物是SEQIDN0:71?72所示序列的引物，rs363449 的引物是SEQID N0:73?74)和MSTNC66493737T的引物是SEQIDN0:75?76所示序列的引物。
3. 如權(quán)利要求1所述的人生物學性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于：所 述步驟2)中的片段化是將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測定濃度后，用DNase I進行片段化； 所述熒光素標記是將片段化PCR產(chǎn)物利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3'末端進行熒光素標 記。
4. 如權(quán)利要求1所述的人生物學性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于：所 述步驟3)基因芯片的制備是將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點 載到玻片或硅片材質(zhì)的固相載體片基上，其中，探針是SEQ ID N0:1?SEQ ID N0:38所示 序列的DNA探針。
5. 如權(quán)利要求1所述的人生物學性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于：所 述步驟4)中的基因分型結(jié)果導入人生物學性狀評估軟件進行受檢者生物學性狀評估。
6. 如權(quán)利要求1所述的人生物學性狀包括：性格、情感、智商、閱讀、數(shù)學、飲酒、成癮 性、運動和體質(zhì)。
【文檔編號】C40B40/06GK104109707SQ201210513259
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月22日
【發(fā)明者】郜恒駿, 張新, 盛海輝 申請人:泰州醫(yī)藥城博奧邦科生物科技有限公司