專利名稱：一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程功能材料，尤其是具有生物功能性的肝素化界面材料制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝素是硫酸乙酰肝素的高度硫酸化的形式，是一種具有抗凝血性的生物分子，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中、它也是多種蛋白酶和生長(zhǎng)因子的特異性識(shí)別體。因此，界面肝素化材料具有的抗凝活性和特異識(shí)別性，在生物芯片技術(shù)以及生物材料領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用。目前制備肝素化界面材料的方法主要有物理吸附和共價(jià)固定。肝素分子物理吸附于材料表面的結(jié)合方式不穩(wěn)定，體內(nèi)情況下很短時(shí)間釋放完。肝素在材料表面的共價(jià)固定是制備肝素化界面材料的最常用方法，盡管共價(jià)固定的肝素化界面材料對(duì)于肝素分子的保留具有較持久性，然而共價(jià)固定使肝素分子的生物活性被大大削弱，其潛在的蛋白特異性識(shí)別能力的大大降低，限制了其進(jìn)一步拓展的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的是提供一種可制備出具有高度肝素生物活性保持力的界面材料的方法，在保證其具有高度生物活性保持力的同時(shí)，使之具有制備操作簡(jiǎn)單方便，無(wú)需昂貴的專用設(shè)備，制備成本低的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下手段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法，采用如下步驟在生物材料表面獲得肝素化界面材料A、采用脈沖等離子體聚合方法在經(jīng)濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜；B、將A處理后的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡于pH值為2-7的PBS 溶液中I-M小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化；C、將肝素鈉加入B步驟所述的PBS緩沖溶液中，濃度為l-10mg/ml，室溫25°C下反應(yīng)I-M小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，得目標(biāo)材料。采用本發(fā)明方法制備的肝素化界面材料不僅具有優(yōu)異的抗凝和抗平滑肌細(xì)胞粘附和增殖能力，并且對(duì)其特異性識(shí)別的酶(如蛋白酶ATIII)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如而)、生長(zhǎng)因子(如VEGF)、趨化因子(如SDF-I α )表現(xiàn)出優(yōu)異的特異識(shí)別能力。結(jié)合特異性識(shí)別的蛋白酶(ATIII)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白蛋白(纖連蛋白)、生長(zhǎng)因子(FGF-1、FGF-2、VEGF)、趨化因子(SDF-Ia)等的肝素功能化界面材料在抗凝、血管生成、免疫學(xué)、促進(jìn)傷口愈合、組織再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明獲得的316L不銹鋼和肝素化界面材料H印-PPAam的APTT結(jié)果圖。
圖2為316L不銹鋼和肝素化界面材料Ifep-PPAam結(jié)合ATIII和VEGF的定量結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作進(jìn)一步的描述，實(shí)施例所用試劑均為分析純。 為敘述方便，本申請(qǐng)中的“基底材料”是對(duì)采用本發(fā)明方法進(jìn)行表面改性生物的材料和器件的統(tǒng)稱。實(shí)施例1制備鈷基合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為0. 01時(shí)， 通入流量為Isccm的氬氣，在射頻功率為50W，負(fù)偏壓為50的條件下進(jìn)行5分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為0. OlPa，通入流量為0. 5sccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺，使工作壓力為lPa， 在射頻功率5W、負(fù)偏壓為50V、脈沖占空比為5%的條件下進(jìn)行為時(shí)60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在基底材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡于pH值為2的PBS溶液中1小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩沖溶液中，濃度為lmg/ml，室溫25°C下反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。實(shí)施例2制備鐵基材料為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為2 時(shí)，通入流量IOsccm的氬氣，在射頻功率為200W，負(fù)偏壓為150V的條件下進(jìn)行30分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為2Pa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺，使工作壓力lOPa，在射頻功率50W、負(fù)偏壓為150V、脈沖占空比為100%的條件下進(jìn)行為時(shí)5分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在基底材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的基底材料浸泡于pH值為7的PBS溶液中M小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩沖溶液中，濃度為10mg/ml，室溫25°C下反24小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。
實(shí)施例3制備NiTi合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為0. 2Pa時(shí)， 通入流量為kccm的氬氣，在射頻功率為100W，負(fù)偏壓為100V的條件下進(jìn)行15分鐘的濺射
清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為0. 2Pa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺使工作壓力為5Pa，在射頻功率30W、負(fù)偏壓為100V、脈沖占空比為30%的條件下進(jìn)行為時(shí)30分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡于pH值為4的PBS溶液中12小時(shí)， 使其表面氨基質(zhì)子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩沖溶液中，濃度為5mg/ml，室溫25°C下反應(yīng)12小時(shí)， 反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。實(shí)施例4制備鈦合金為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將材料放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為1 時(shí)，通入流量為Ssccm的氬氣，在射頻功率為150W，負(fù)偏壓為75V的條件下進(jìn)行25分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為lPa，通入流量為如ccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺，使工作壓力為8Pa，在射頻功率40W、負(fù)偏壓為120V、脈沖占空比為50%的條件下進(jìn)行為時(shí)45分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在血管支架表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡于pH值為5. 5的PBS溶液中小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩沖溶液中，濃度為8mg/ml，室溫25°C下反應(yīng)20小時(shí)， 反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。D、ATIII 固定將C步表面肝素化的材料浸泡在含抗凝血酶原(ATIII)的PBS溶液中，室溫25°C 下反應(yīng)M小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。其Hep-PPAam的 APTT結(jié)果如圖1。實(shí)施例5制備316L不銹鋼為基底材料的肝素化界面材料A、等離子體聚烯丙胺薄膜的沉積Al濺射清洗將基底材料放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為0. OlPa時(shí)，通入流量為IOsccm的氬氣，在射頻功率為200W，負(fù)偏壓為150V的條件下進(jìn)行30分鐘的
濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為0. OlPa，通入流量為^ccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺，使工作壓力為10Pa，在射頻功率50W、負(fù)偏壓為150V、脈沖占空比為5%的條件下進(jìn)行為時(shí)60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，即在材料表面上沉積富含氨基的等離子體聚合薄膜。B、等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子功能化將A步沉積有等離子體聚合薄膜的材料浸泡于pH值為2的PBS溶液中M小時(shí)， 使其表面氨基質(zhì)子化。C、肝素單分子層自組裝將肝素鈉加入B步的PBS緩沖溶液中，濃度為10mg/ml，室溫25°C下反應(yīng)M小時(shí)， 反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得。D、VEGF 的固定將C步表面肝素化的材料浸泡在含內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的PBS溶液中，室溫 25°C下反應(yīng)M小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，即得目標(biāo)產(chǎn)物。其 Hep-PPAam結(jié)合ATIII和VEGF的定量結(jié)果如圖2所示。圖1為用本發(fā)明的方法制備的肝素化界面材料的部分凝血活酶時(shí)間結(jié)果表明肝素化界面材料表面顯著地提高了內(nèi)源性抗凝血性能，說(shuō)明本專利制備的肝素化界面材料具有優(yōu)異的抗凝血性。圖2為用本發(fā)明的方法制備的肝素化界面材料對(duì)AT-III和VEGF特異性結(jié)合的定量測(cè)試結(jié)果，表明該化界面材料能顯著提升對(duì)AT-III和VEGF的結(jié)合量，說(shuō)明本專利制備的肝素化界面材料具有優(yōu)異的優(yōu)異肝素-蛋白結(jié)合功能。圖1和圖2的良好結(jié)果對(duì)本發(fā)明其它實(shí)施例亦不失一般性。本發(fā)明制備方法在生物材料及其器械表面構(gòu)建具有高度生物活性保持力的肝素單分子層。采用等離子體聚合技術(shù)在生物材料及其器械表面沉積上一層結(jié)合牢固且富含胺基官能團(tuán)的等離子體聚合薄膜。經(jīng)過(guò)在酸性PBS中浸泡后，表面氨基被質(zhì)子化并帶上豐富的正電荷，與肝素分子自身負(fù)電基團(tuán)(羧酸根和磺酸根)發(fā)生強(qiáng)靜電作用后，有效的把肝素結(jié)合上其表面。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是一、聚合涂層與生物材料及其器械表面采用等離子沉積方法，結(jié)合牢固，涂層含有豐富的氨基官能團(tuán)。二、依靠肝素的羧酸根和磺酸根和等離子體聚合薄膜表面質(zhì)子化的氨基的強(qiáng)靜電吸附作用在其表面固定的肝素具有很強(qiáng)的結(jié)合力。三、由于肝素固定不采用任何偶聯(lián)劑，使得肝素功能性得到有效的保持，表現(xiàn)出優(yōu)異肝素-蛋白結(jié)合功能。通過(guò)進(jìn)一步在該肝素功能化界面材料表面結(jié)合特異性識(shí)別的蛋白、生物分子和生長(zhǎng)因子，能實(shí)現(xiàn)其在抗凝、血管生成、免疫學(xué)、促進(jìn)傷口愈合、組織再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。同時(shí)此種肝素功能化界面材料的制備，僅需以浸泡自組裝的的方式在等離子體聚合薄膜表面構(gòu)建肝素單分子層，其制備過(guò)程，操作簡(jiǎn)單方便，也無(wú)需昂貴的專用設(shè)備，制備成本低。 采用本發(fā)明的基本方法，在實(shí)際實(shí)施時(shí)還可有廣泛的實(shí)際變例，例如本申請(qǐng)中的 “基底材料”可包括生物醫(yī)用金屬基材料(Fe、鎂基材料、316L SS、Ti、Ti合金Ni-Ti合金及 Co-Cr合金等)、無(wú)機(jī)材料(Ti_0、TiN等)、不可降解聚合物(如PET、PTFE、PDMS等)及可降解聚合物材料(如PLA、PLGA和PCL等)。
權(quán)利要求
1.一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法，采用如下步驟在生物材料表面獲得肝素化界面材料A、采用脈沖等離子體聚合方法在經(jīng)濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜；B、將A處理后的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡于pH值為2-7的PBS溶液中I-M小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化；C、將肝素鈉加入B步驟所述的PBS緩沖溶液中，濃度為l-10mg/ml，室溫25°C下反應(yīng) 1-24小時(shí)，反應(yīng)完畢后，分別用PBS和蒸餾水充分漂洗，干燥，得目標(biāo)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法，其特征在于，所述A步用脈沖等離子體聚合法在生物醫(yī)用材料及其器件表面上沉積等離子體聚合薄膜的具體作法為Al濺射清洗將生物醫(yī)用材料及其器件表面放入薄膜沉積反應(yīng)室中，當(dāng)反應(yīng)室真空抽至為0. 01-2Pa時(shí)，通入流量為I-IOsccm的氬氣，在射頻功率為50-200W，負(fù)偏壓為50-150V 的條件下進(jìn)行5-30分鐘的濺射清洗；A2等離子體聚合薄膜制備濺射清洗后，重新使反應(yīng)室的真空度為0. 01-2Pa,通入流量為0. 5-^ccm的氬氣作為放電氣體，并通入作為反應(yīng)氣體的烯丙胺，使工作壓力為 Ι-lOPa，在射頻功率5-50W、負(fù)偏壓為50-150V、脈沖占空比為5-100 %的條件下進(jìn)行為時(shí) 5-60分鐘的等離子體聚合薄膜沉積，得到所述烯丙胺等離子體聚合薄膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法，其特征在于，所述基底材料可為生物醫(yī)用金屬基材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法，其特征在于，所述生物醫(yī)用金屬基材料為316L不銹鋼、鈦及其合金、NiTi合金、鈷基合金、鐵基材料和鎂基材料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高生物功能性的肝素化界面材料制備方法。首先采用脈沖等離子體聚合方法在經(jīng)濺射清洗的基底材料表面上沉積一層烯丙胺等離子體聚合薄膜，然后將處理后的沉積有等離子體聚合薄膜的生物材料浸泡于pH值為2-7的PBS溶液中1-24小時(shí)，使其表面氨基質(zhì)子化；再將肝素鈉加入的PBS緩沖溶液中，濃度為1-10mg/ml，室溫25℃下反應(yīng)1-24小時(shí)，經(jīng)蒸餾水充分漂洗，干燥，得目標(biāo)材料。本發(fā)明方法僅需以浸泡自組裝的的方式在等離子體聚合薄膜表面構(gòu)建肝素單分子層，其制備過(guò)程操作簡(jiǎn)單方便，無(wú)需昂貴的專用設(shè)備，制備成本低。
文檔編號(hào)C23C14/12GK102268639SQ20111019570
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者冷永祥, 楊志祿, 王進(jìn), 趙元聰, 黃楠 申請(qǐng)人:成都交大麥迪克科技有限公司, 西南交通大學(xué)