一種基于一階貝塞爾光束的sted超分辨顯微鏡及調(diào)節(jié)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微鏡技術(shù)，具體涉及一種基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡及其調(diào)節(jié)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超分辨顯微成像技術(shù)在生物成像、材料表征以及激光精細(xì)加工等領(lǐng)域產(chǎn)生了重大的影響。其中受激輻射損耗STED顯微鏡是一種在共聚焦點(diǎn)掃描式顯微鏡的基礎(chǔ)上，通過直接調(diào)節(jié)信號(hào)產(chǎn)生區(qū)域面積從而實(shí)現(xiàn)超分辨成像或者激發(fā)的顯微技術(shù)，相較于其他類型的超分辨顯微技術(shù)，其原理較為簡單，且成像速度較快，可以進(jìn)行活體實(shí)時(shí)超分辨成像，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用，并且在納米材料研究，激光加工以及光存儲(chǔ)領(lǐng)域提供了一種新的可行的方法。
[0003]受激輻射損耗顯微技術(shù)需要兩束光進(jìn)行照明。其中一束未經(jīng)調(diào)制的高斯光(激發(fā)光)經(jīng)過物鏡聚焦后產(chǎn)生一個(gè)近似于愛里斑的激發(fā)區(qū)域，焦點(diǎn)處的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光；另一束不同波長的高斯光通過0_2Pi螺旋形相位板的調(diào)制(損耗光)，在物鏡焦平面位置形成一個(gè)中空的面包圈狀的光斑，其中心光強(qiáng)接近于零，這樣使處在圓環(huán)上光強(qiáng)較強(qiáng)區(qū)域內(nèi)的激發(fā)態(tài)的熒光分子以受激輻射的方式躍迀回基態(tài)，不再發(fā)出熒光，這樣只有面包圈中心附近損耗光光強(qiáng)較弱的區(qū)域才能產(chǎn)生熒光，減小了熒光發(fā)光區(qū)域的面積從而突破衍射極限，提高分辨率。但是，這束損耗光對于相位分布十分敏感，對于高像差的樣品，在對其內(nèi)部進(jìn)行成像時(shí)，由于像差和散射導(dǎo)致?lián)p耗光聚焦光斑的形貌產(chǎn)生畸變，從而使分辨率急劇下降。
[0004]近年來，為了提高STED顯微鏡的成像深度，已經(jīng)有人通過調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)，在80-100微米的深度達(dá)到穩(wěn)定的分辨率，但是這些方法通常操作較為復(fù)雜且對于高散射樣品并不一定適用。還有人使用自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)對樣品帶來的像差進(jìn)行補(bǔ)償，但系統(tǒng)比較復(fù)雜且昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對以上現(xiàn)有技術(shù)中STED顯微鏡在深層成像時(shí)遇到的問題，本發(fā)明提出了一種利用貝塞爾光束的抗散射和自愈特性，將損耗光變?yōu)橐浑A貝塞爾光束，從而具有一定的像差和散射的自我補(bǔ)償能力，以達(dá)到樣品內(nèi)部的穩(wěn)定超分辨成像的實(shí)現(xiàn)方法。
[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡。
[0007]本發(fā)明的基于一階貝塞爾光束的受激福射損耗超分辨顯微鏡包括:激發(fā)光光源、損耗光光源、激發(fā)光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)、損耗光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)、螺旋形相位板、貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)、損耗光聚焦透鏡、合束系統(tǒng)、物鏡、壓電掃描系統(tǒng)、濾波片、信號(hào)收集系統(tǒng)和單光子探測器；其中，激發(fā)光光源輸出的激發(fā)光經(jīng)過激發(fā)光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)后充滿物鏡的入瞳；損耗光光源輸出的線偏振的損耗光依次經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)、螺旋形相位板、貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)和損耗光聚焦透鏡，通過合束系統(tǒng)和激發(fā)光精確合束后，再由物鏡聚焦到樣品上；樣品放置在壓電掃描系統(tǒng)上，通過壓電掃描系統(tǒng)掃描樣品，樣品產(chǎn)生的信號(hào)光通過信號(hào)收集系統(tǒng)進(jìn)入單光子探測器，從而得到樣品的超分辨圖像；損耗光聚焦透鏡與物鏡滿足共焦條件，構(gòu)成共焦系統(tǒng)，經(jīng)貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生的一階貝塞爾光束，通過損耗光聚焦透鏡和物鏡聚焦后，形成的聚焦光斑為軸向的線光；激發(fā)光在物鏡后形成的聚焦光斑為點(diǎn)光，通過調(diào)節(jié)貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)與損耗光聚焦透鏡之間的距離，使得激發(fā)光的聚焦光斑的點(diǎn)光的中心位于貝塞爾光束的聚焦光斑的線光的軸向中心，并且通過調(diào)節(jié)合束系統(tǒng)使損耗光與激發(fā)光的聚焦光斑的橫向精確重合。
[0008]損耗光聚焦透鏡與物鏡滿足共焦條件，構(gòu)成共焦系統(tǒng)，在損耗光聚焦透鏡的后焦點(diǎn)位于物鏡的前焦點(diǎn)附近，調(diào)節(jié)損耗光聚焦透鏡與物鏡之間的距離，使得形成的聚焦光斑的軸向最長。
[0009]貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)采用角錐鏡，通過調(diào)節(jié)角錐鏡和損耗光聚焦透鏡之間的距離，使得激發(fā)光在物鏡后形成的點(diǎn)光的中心位于貝塞爾光束的線光的軸向中心；角錐鏡的頂角越大，物鏡后一階貝塞爾光束的線光的軸向長度越長?；蛘撸惾麪柟馐a(chǎn)生系統(tǒng)采用環(huán)形模板和一個(gè)準(zhǔn)直透鏡，這種配置下要求環(huán)形模板在準(zhǔn)直透鏡的前焦面處，通過調(diào)節(jié)準(zhǔn)直透鏡與損耗光聚焦透鏡之間的距離，使得激發(fā)光在物鏡后形成的點(diǎn)光的中心位于貝塞爾光束的線光的軸向中心；環(huán)形模板包括一個(gè)透光的圓環(huán)和其余不透光的底板，其中透光的圓環(huán)的寬度與經(jīng)物鏡聚焦后產(chǎn)生的線光的軸向長度有關(guān)，環(huán)的寬度越寬，線光的長度越長?；蛘?，貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)采用空間光調(diào)制器，通過調(diào)節(jié)空間光調(diào)制器和損耗光聚焦透鏡之間的距離使激發(fā)光在物鏡后形成的點(diǎn)光的中心位于貝塞爾光束的線光的軸向中心。
[0010]合束系統(tǒng)采用第一和第二雙色鏡，兩個(gè)雙色鏡的透過光具有重合的波段，并且信號(hào)光的波段位于兩個(gè)雙色鏡的透過光重合的波段內(nèi)。對于損耗光與激發(fā)光平行，且損耗光和激發(fā)光與信號(hào)光垂直的情況，第一雙色鏡為對損耗光全反射，而對激發(fā)光全透射，并且對信號(hào)光全透射；第二雙色鏡為對激發(fā)光全反射，對信號(hào)光全透射；從而平行的損耗光和激發(fā)光分別經(jīng)過第一雙色鏡全反射和第二雙色鏡全反射后，兩路光路合束，共同進(jìn)入物鏡聚焦后，入射至樣品產(chǎn)生信號(hào)光，信號(hào)光分別經(jīng)第一和第二雙色鏡全透射，由信號(hào)收集系統(tǒng)收集。對于損耗光與激發(fā)光垂直，且損耗光與信號(hào)光平行的情況，第一雙色鏡為對損耗光全反射，而對激發(fā)光全透射，并且對信號(hào)光全透射；第二雙色鏡為對激發(fā)光全透射，對信號(hào)光全反射；從而損耗光經(jīng)過第一雙色鏡全反射后，與經(jīng)過第一和第二雙色鏡全透射后的激發(fā)光，兩路光路合束，共同進(jìn)入物鏡聚焦，入射至樣品產(chǎn)生信號(hào)光，信號(hào)光分別經(jīng)第一雙色鏡全透射后，經(jīng)第二雙色鏡全透射，由信號(hào)收集系統(tǒng)收集。
[0011]信號(hào)收集系統(tǒng)包括信號(hào)收集透鏡和一個(gè)作為共聚焦小孔的多模光纖，從而濾去聚焦光斑之外的信號(hào)，提高縱向分辨率。
[0012]損耗光經(jīng)損耗光聚焦透鏡和物鏡聚焦后，在軸向形成線光的長度大于20微米；調(diào)節(jié)貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)與損耗光聚焦透鏡之間的距離，使得激發(fā)光與塞爾光束的軸向重合，并且調(diào)節(jié)合束系統(tǒng)使得兩個(gè)聚焦光斑的橫向重合精度達(dá)到10納米以內(nèi)。
[0013]進(jìn)一步，在螺旋形相位板與貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)之間設(shè)置二分之一玻片，并且在物鏡前放置四分之一玻片，從而將損耗光從線偏振調(diào)整為左旋圓偏振光，這樣可以在損耗光聚焦光斑中心獲得接近于零的光強(qiáng)，從而提高成像信噪比。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡的調(diào)節(jié)方法。
[0015]本發(fā)明的一種基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡的調(diào)節(jié)方法，包括以下步驟:
[0016]I)激發(fā)光光源輸出的激發(fā)光經(jīng)過激發(fā)光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)后充滿物鏡的入瞳；損耗光光源輸出的線偏振的損耗光依次經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)、螺旋形相位板、貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)和損耗光聚焦透鏡，通過合束系統(tǒng)和激發(fā)光精確合束后，再由物鏡聚焦到樣品上；樣品放置在壓電掃描系統(tǒng)上，通過壓電掃描系統(tǒng)掃描樣品，樣品產(chǎn)生的信號(hào)光通過信號(hào)收集系統(tǒng)進(jìn)入單光子探測器，從而得到樣品的超分辨圖像；
[0017]2)通過調(diào)節(jié)貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)與損耗光聚焦透鏡之間的距離，使得激發(fā)光的聚焦光斑的點(diǎn)光的中心位于貝塞爾光束的聚焦光斑的線光的軸向中心；
[0018]3)通過調(diào)節(jié)合束系統(tǒng)使損耗光與激發(fā)光的聚焦光斑的橫向精確重合:
[0019]a)損耗光與激發(fā)光平行的情況，通過分別調(diào)節(jié)第一和第二雙色鏡的角度，分別改變損耗光和激發(fā)光的偏轉(zhuǎn)角，從而使得損耗光與激發(fā)光的聚焦光斑的橫向精確重合；
[0020]b)損耗光與激發(fā)光垂直的情況，通過調(diào)節(jié)第一雙色鏡的角度，改變損耗光的偏轉(zhuǎn)，從而使得損耗光與激發(fā)光的聚焦光斑的橫向精確重合；
[0021]4)調(diào)節(jié)損耗光聚焦透鏡與物鏡之間的距離，經(jīng)貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生的一階貝塞爾光束，通過損耗光聚焦透鏡和物鏡聚焦后，形成的聚焦光斑的軸向最長。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0023](I)損耗光為一階貝塞爾光束，其本身具有抗散射和自愈特性，在樣品較深的位置可以保持很好的光斑形貌，從而提高樣品深層區(qū)域的分辨率；
[0024](2)相比于調(diào)節(jié)物鏡校正環(huán)來實(shí)現(xiàn)STED超分辨顯微鏡深層成像的方法，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)操作上較為簡單，無需主動(dòng)調(diào)節(jié)；相比于使用自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)的方法，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)裝置上較為簡單且廉價(jià)。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明的基于一階貝塞爾光束的受激福射損耗超分辨顯微鏡的實(shí)施例一的不意圖；
[0026]圖2為本發(fā)明的基于一階貝塞爾光束的受激福射損耗超分辨顯微鏡的實(shí)施例二的不意圖；
[0027]圖3為本發(fā)明的基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡在物鏡的焦平面位置激發(fā)光和損耗光的聚焦光斑的形貌圖；
[0028]圖4本發(fā)明的基于一階貝塞爾光束的受激福射損耗超分辨顯微鏡對含有40nm焚光球的瓊脂樣品在不同深度的分辨率與傳統(tǒng)STED的對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0030]實(shí)施例一
[0031]如圖1所示，本實(shí)施例的基于一階貝塞爾光束的受激輻射損耗超分辨顯微鏡包括:激發(fā)光光源1、損耗光光源2、激發(fā)光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)3-1、損耗光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)3-2、螺旋形相位板4、二分之一玻片5、貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)6、損耗光聚焦透鏡14、合束系統(tǒng)8、物鏡9、壓電掃描系統(tǒng)10、濾波片11、信號(hào)收集系統(tǒng)12和單光子探測器13 ;其中，激發(fā)光光源I輸出的激發(fā)光經(jīng)過激發(fā)光擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)3-1后充滿物鏡9的入瞳；損耗光光源2輸出的線偏振的損耗光依次經(jīng)過擴(kuò)束準(zhǔn)直系統(tǒng)3-2、螺旋形相位板4、二分之一玻片5、貝塞爾光束產(chǎn)生系統(tǒng)6和損耗光聚焦透鏡14，通過合束系統(tǒng)8和激發(fā)光精確合束后，再由物鏡聚焦到樣品上；樣品放置在壓電掃描系統(tǒng)10上，通過壓電掃描系統(tǒng)掃描樣品，樣品產(chǎn)生的信號(hào)光通過信號(hào)收集系統(tǒng)12進(jìn)入單光子探測器13，從而得到樣品的超分辨圖像。損耗光與激發(fā)光平行，且損耗光和激發(fā)光與信號(hào)光垂直，第一