專利名稱:全內(nèi)反射熒光(tirf)顯微鏡的制作方法
技術領域：
0001
本發(fā)明涉及一種全內(nèi)反射顯微鏡，且優(yōu)選地涉及一種全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡。
背景技術：
0002
近年來，TIRF顯微術或方法已日益盛行，特別是其可作為一種研究宏觀分子酶類，蛋白質(zhì)等的實時移動行為的工具。一般，一個或多個探測器在定義的方向上被連接到待研究的蛋白質(zhì)或其它分子。然后，隨著分子移動，例如當其經(jīng)歷催化作用時，探測方向上的變化被檢測。大多數(shù)探測器是熒光的，并具有自然偶極子。具有與偶極子平行的極化方向的光優(yōu)選被吸收；類似地，由探測器發(fā)射的熒光也優(yōu)選在平行于偶極子軸線的方向上被極化。

0003
在典型的TIRF顯微鏡中，待研究的樣本是由合適波長的平面極化激光照射的，以由探測器吸收。這使探測器發(fā)出熒光(一般以不同的波長)，并且發(fā)射的光被分解成兩個垂直極化部件。通過研究這些部件的比率，可以確定各向異性。

0004
在TIRF顯微鏡中，通過將待研究的分子放置得非?？拷ＡЩ蚱渌砻?；然后用光以一掠射角透過玻璃照射，以在與樣本相鄰的內(nèi)表面上獲得全內(nèi)反射，使場的有效深度保持為很小。在全內(nèi)反射發(fā)生的此點上，隱失波被產(chǎn)生，其從玻璃表面向外延伸出大約200納米左右。樣本被放置在隱失波中，并且極化的隱失波激勵熒光探測器發(fā)射，然后如前面所述發(fā)射的光被檢測并分析。

0005
典型的TIRF配置示意地示于圖1中。待研究的樣本10放置在兩個玻璃片14，16之間的狹長的樣本空間12內(nèi)。物鏡18被設置在樣本的前面，透鏡和玻璃片16之間的縫隙13一般被油填充。

0006
照射樣本10的激光19只照射通過透鏡的邊沿，透鏡充分折射此光，以當其到達與樣本緊鄰的玻璃片16的前邊沿時，能完全從內(nèi)部被反射。此內(nèi)反射使樣本置于樣本空間12內(nèi)的隱失波的光中。由樣本內(nèi)的探測器發(fā)射的熒光沿透鏡的整個區(qū)域被采集，并傳遞到其它光學元件上(未示出)以用于分析。

0007
當?shù)竭_邊界的光被極化時，隱失波(evanescent wave)也被極化。當吸收偶極子的方向與隱失波的極化方向一致時，所研究的分子的熒光是最大的。發(fā)射的熒光也被極化。如果分子的方向是雜亂的，則分子系綜沒有極化，但檢查時域上的各向異性現(xiàn)像提供了有關偶極子的旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)速率(tumbling rate)的信息。當用現(xiàn)代CCD照相機觀察單個分子時，可以確定單個分子的方向。通過將發(fā)射的熒光強度的角變化作為激發(fā)光的極化角度的函數(shù)進行測量，可以計算偶極子的方向。精確計算熒光偶極子的角度需要測量多個極化角度。

0008
在TIRF顯微鏡中，玻璃(16)的表面和樣本縫隙(12)(通常充滿水)之間的界面本身可用作起偏振器。僅在一個方向上照射光，以使入射和反射波存在于一個平面上，產(chǎn)生極化隱失波，該隱失波在一些方向上比在另一些方向上更適合于激勵偶極子?？朔祟悊栴}的一種方法已經(jīng)在S.Wakelin & C.R.Bagshow，A prism combination fornear isotropic fluorescence excitation by total internalreflection，Journal of Microscopy vol.209.Pt 2 Februray 2003，pages 143-148中公開。該文中描述的設備使用復雜的棱鏡組合作為光分束器，以在三維方向上獲得同向激勵。不過，此文中描述的配置相對比較復雜，并且也不適于使用在TIRF顯微鏡內(nèi)(Wakelin & Bagshow依靠棱鏡組合照射樣本，棱鏡組合完全與用來接收發(fā)射的熒光的物鏡分離)。

發(fā)明內(nèi)容

0009
本發(fā)明的第一個目標是至少減輕現(xiàn)有技術的各種困難。

0010
本發(fā)明的另一個目標是提供一種TIRF顯微鏡，在這種顯微鏡中，使用者可以很容易地改變隱失波的極化。

0011
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種全內(nèi)反射顯微鏡，其包括物鏡和共軛透鏡，由此，入射在所述共軛透鏡上的照射光束被焦距到所述物鏡上的束斑；所述共軛透鏡被固定在可調(diào)節(jié)的載片上，由此所述透鏡是可移動的以使所述束斑繞所述物鏡的圓周移動。

0012
優(yōu)選地，此顯微鏡是TIRF顯微鏡。

0013
物鏡和共軛透鏡具有平行的光軸，載片優(yōu)選地固定共軛透鏡以繞物鏡的光軸/顯微鏡的光軸旋轉(zhuǎn)?？蛇x地，透鏡可被選擇為傾斜一角度，而不是旋轉(zhuǎn)的，以使束斑繞物鏡的圓周移動。在這種情況下，共軛透鏡可以在物鏡光軸的中心。

0014
當然，應該理解在權利要求
和說明書中表述“束斑”表明物鏡的前表面上的一個很小的但非零大小的區(qū)域。應該理解此斑點不一定是照射光束的焦點，而是由物鏡的前表面和入射光束的會聚光錐(converging cone)相交定義的區(qū)域。

0015
優(yōu)選地，載片可進一步調(diào)節(jié)，以使束斑在物鏡的徑向上奇跡周圍上能移動。在一個實施例中，這可以通過調(diào)節(jié)物鏡的光軸和共軛透鏡的平行光軸之間的間距實現(xiàn)。

0016
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種操作全內(nèi)反射顯微鏡的方法，所述全內(nèi)反射顯微鏡具有物鏡和共軛透鏡，其中入射在所述共軛透鏡上的照射光束被聚焦成所述物鏡上的束斑，該方法包括關于物鏡移動共軛透鏡以使束斑繞物鏡的圓周移動。

0017
此方法進一步擴展到從已經(jīng)被光束照射過的樣本中采集光，并將采集的光作為物鏡的圓周上的束斑的角位置的函數(shù)進行分析。也可以類似地將采集的光作為物鏡的束斑的徑向位置的函數(shù)進行分析。




0018
本發(fā)明可以以多種方式被實際實施，參考附圖并通過例子，一個具體的實施方式將被描述，在圖中
0019
圖1一般圖解說明了TIRF顯微鏡的原理；
0020
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的TIRF顯微鏡的示意0021
圖3是通過共軛透鏡和物鏡的縱剖面。

0022
圖4a顯示了共軛透鏡安裝的方式；和
0023
圖4b顯示了撞擊到物鏡的表面上的入射激光的運動。
具體實施方式

0024
圖2是根據(jù)本發(fā)明的實施方式的TIRF顯微鏡的示意圖。顯然，應該理解此圖純粹是示意性的，其并不代表準確的相對大小或距離。

0025
如圖中所示，激光20產(chǎn)生光束，該光束通過擴束器22，光束調(diào)節(jié)器(例如光測彈性調(diào)制器)24和擋塊26，該光束被從擋塊26導向成一角度的分色鏡28。分色鏡28將光束反射到偏離軸的共軛透鏡30。通過此透鏡之后，光以一定角度被折射，如參考號32所示，以撞擊到物鏡34的外邊沿。然后，光折射通過該透鏡并進入總體表示為36的樣本夾持器。在夾持器中，樣本44被保持在下玻璃片40和上玻璃片42之間充滿水的縫隙中。下琉璃板40和物鏡34之間的空間38填滿了油。

0026
來自物鏡34邊沿的入射光以一掠射角撞擊到玻璃片40上，并在玻璃/水界面上完全是內(nèi)反射的，從而產(chǎn)生如上文描述的在樣本44的區(qū)域內(nèi)的隱失波。反射光返回通過物鏡的另一邊沿并且或返回到共軛透鏡30或可選地由光學路徑中的擋塊(未示出)阻擋。反射光在TIRF裝置中不是特別關心的。

0027
樣本在各個方向上發(fā)射熒光，發(fā)射的光中的部分被物鏡采集，并如虛線48(更準確地說，在由虛線32，46定義的錐形內(nèi))所示返回共軛透鏡。從共軛透鏡上其返回通過分色鏡并通過濾光器50，可移動的極化檢偏器52和半鍍銀鏡54到達照相機56。目鏡58使使用者能實時地查看捕捉到的圖像。

0028
共軛透鏡30被提供有可調(diào)節(jié)的載片60，其允許使用者手動或自動地改變共軛透鏡的光軸BB和物鏡34和顯微鏡的主光軸AA之間的間隔。此調(diào)節(jié)可以通過任何簡便的裝置，諸如舉例來說導螺桿62來實現(xiàn)，從圖3和4a可清楚看出這一點。通過旋轉(zhuǎn)導螺桿，使用者能調(diào)節(jié)物鏡的光軸和激光斑撞擊物鏡上的那一點之間的距離。如果此距離太小，內(nèi)部反射不會發(fā)生，但當此距離大于所需的最小值時，隨著共軛透鏡被移動，總內(nèi)反射會發(fā)生在不同的掠射入射的角度。

0029
共軛透鏡載片60還被布置成使偏離軸的共軛透鏡30繞與主顯微鏡軸AA共軸的旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)。圖4a是沿著顯微鏡軸AA看進去的共軛透鏡和載片的圖。載片在雙方向箭頭66的方向上的旋轉(zhuǎn)使入射激光斑64在物鏡34的邊沿繞透鏡的圓周移動。不管光斑在圓周的位置如何，樣本上繼續(xù)生成隱失波。然而，在界面上生成的極化或偏振基面會隨透鏡旋轉(zhuǎn)。因此，通過將發(fā)射的熒光的強度作為共軛透鏡的旋轉(zhuǎn)位置的函數(shù)進行測量，使用者可以得到有關偶極子引起熒光的空間中的方向的信息，因此獲得被研究的微觀分子的位置的信息。這使使用者能實時研究分子的翻轉(zhuǎn)。

0030
如圖4a所示，共軛透鏡載片60被布置為圓形，其中心位于顯微鏡軸AA上的一點。圓形載片被對齊以使平行于其上表面的平面垂直于顯微鏡軸。共軛透鏡30被裝在載片上，并被布置以使圓形載片的中心不位于沿共軛透鏡的光軸BB上的一點，即，共軛透鏡的光軸與顯偏離顯微鏡的軸。為了使圓形共軛透鏡載片60繞其中心旋轉(zhuǎn)，即關于與顯微鏡軸AA共軸的旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，可購買的徑向滾珠，諸如從SKF可獲得的6210-2RS1，可用在圓形透鏡載片(未示出)的外周邊上。

0031
因此，如上所述，隱失波的極化基面是在玻璃/水界面上產(chǎn)生的，其將隨共軛透鏡30的旋轉(zhuǎn)而旋轉(zhuǎn)，根據(jù)本發(fā)明的實施例能使光的極化平面旋轉(zhuǎn)入射到樣本44上。

0032
在可替代的布置中(未示出)，所示設備可以被轉(zhuǎn)化成傳統(tǒng)的以明視場模式運行的顯微鏡，這僅需將照射燈放置在樣本夾持器36的遠側(cè)即可實現(xiàn)。這提供了同時獲得樣本的相襯像和TIRF圖像的可能。這種布置對于Waklin & Bagshaw的方法是不可行的，原因是棱鏡的位置將必需阻擋明視場照明的附加源。

0033
用以上所述的裝置，顯微鏡運行在“遠場”模式下，這是一種能同時獲得全視場的實時圖像的一種模式；使用者不必像在傳統(tǒng)的共焦顯微術中必需的那樣對全視場進行掃描。

0034
再次參考圖2，另一種可能性就是使用光測彈性調(diào)制器24，以旋轉(zhuǎn)入射激光束的極化平面，并由此旋轉(zhuǎn)全內(nèi)反射激勵光束的極化平面。我們不認為作為第一近似，這會改變隱失波的極化，盡管可能存在次級效應。如果想研究反射光46，并允許其沿光軸無阻礙地返回，可以使用極化檢偏器52進行額外的分析。
權利要求
1.一種全內(nèi)反射顯微鏡，包括物鏡和共軛透鏡，入射在所述共軛透鏡上的照射光束由此被焦距成所述物鏡上的束斑；所述共軛透鏡被固定在可調(diào)節(jié)的載片上，從而使所述透鏡是可移動的以使所述束斑繞所述物鏡的圓周移動。
2.根據(jù)權利要求
1所述的顯微鏡，其中所述載片固定所述共軛透鏡以關于所述物鏡的光軸旋轉(zhuǎn)。
3.根據(jù)權利要求
1或2所述的顯微鏡，其中所述載片使所述物鏡的光軸和所述共軛透鏡的平行光軸之間的間距是可被調(diào)節(jié)的。
4.一種操作全內(nèi)反射顯微鏡的方法，所述全內(nèi)反射顯微鏡具有物鏡和共軛透鏡，其中入射在所述共軛透鏡上的照射光束由此被焦距成所述物鏡上的束斑，所述方法包括使所述共軛透鏡關于所述物鏡移動，以使所述束斑圍繞所述物鏡的圓周移動。
5.根據(jù)權利要求
4所述的方法，其中所述物鏡具有第一光軸，所述共軛透鏡具有第二平行光軸，該第二平行光軸與所述第一光軸相隔開，所述方法包括繞所述第一軸旋轉(zhuǎn)所述共軛透鏡。
6.根據(jù)權利要求
4或5所述的方法，包括在所述物鏡的徑向方向上移動所述束斑。
7.根據(jù)權利要求
4-6中的任何一項權利要求
所述的方法，包括從已經(jīng)被所述光束照射過的樣本中采集光，并將所采集的光作為所述物鏡的所述圓周上的所述束斑的角位的函數(shù)進行分析。
8.根據(jù)權利要求
6或權利要求
7所述的方法，包括如權利要求
4-6中的任何一項權利要求
所述的方法，包括從已經(jīng)被所述光束照射過的樣本中采集光，并將所采集的光作為所述物鏡上的所述束斑的徑向位置的函數(shù)進行分析。
9.根據(jù)權利要求
7或權利要求
8所述的方法，其中來自所述樣本的光是由所述樣本發(fā)射的熒光。
專利摘要
一種全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡具有共軛透鏡30，其被放置在偏離主顯微鏡軸AA的位置。透鏡30被載片固定，以使顯微鏡軸AA和共軛透鏡軸BB之間的徑向間距可被改變。載片60還使透鏡繞顯微鏡軸旋轉(zhuǎn)。當透鏡30旋轉(zhuǎn)時，由入射激光束產(chǎn)生的光斑64繞物鏡34的圓周移動。這改變了隱失波的極化方向，樣本44位于隱失波中。通過將發(fā)射的熒光作為透鏡角的函數(shù)進行研究，可提供有關研究中的分子的空間姿態(tài)的信息。
文檔編號G01Q60/22GKCN101076867SQ200580037869
公開日2007年11月21日 申請日期2005年11月8日
發(fā)明者M·A·費倫齊 申請人:帝國創(chuàng)新技術有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan