相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年8月13日提交的標(biāo)題為“線掃描、樣品掃描共聚焦顯微鏡(line-scanning，sample-scanningconfocalmicroscope)”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/037030的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。上述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文。

背景技術(shù)：

癌癥是美國(guó)死亡的第二大原因，每年致死約五十萬(wàn)人。早期檢測(cè)有助于去除原發(fā)性腫瘤，這對(duì)于通過(guò)去除原發(fā)性腫瘤來(lái)預(yù)防轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的。早期生長(zhǎng)期是轉(zhuǎn)移性起始的隨后階段的非常優(yōu)選的檢測(cè)窗口。

確定癌癥是否存在于身體中的能力通常受到去除組織樣品以及用顯微鏡檢查組織中是否存在具有已知癌癥性狀的細(xì)胞的能力的限制。這個(gè)過(guò)程通常通過(guò)以下方式來(lái)完成：將組織切成薄切片，以便實(shí)現(xiàn)比細(xì)胞小一個(gè)數(shù)量級(jí)的分辨率，用標(biāo)記細(xì)胞和其他組織成分的化學(xué)品染色切片并將薄切片放置在顯微鏡上以便進(jìn)行觀察和評(píng)估。

共聚焦顯微鏡是對(duì)組織中的細(xì)胞進(jìn)行成像的替代技術(shù)，其不需要物理切割組織，也稱為物理切片。實(shí)際上，共聚焦顯微鏡實(shí)施光學(xué)切片，對(duì)組織的不同焦平面進(jìn)行成像代替物理切片。共聚焦顯微鏡探測(cè)組織內(nèi)的點(diǎn)并在二維中掃描所述點(diǎn)以形成圖像。

然而，用于通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)組織進(jìn)行成像的當(dāng)前技術(shù)在某些方面是受限的。在一個(gè)示例中，共聚焦顯微鏡不能獲得具有大視場(chǎng)(例如，大于約1cm)和高分辨率(例如，小于約5μm)的連續(xù)圖像。在另一個(gè)示例中，共聚焦顯微鏡未能提供執(zhí)行與組織病理學(xué)相當(dāng)?shù)牟±矸治鏊璧男畔ⅲ鼋M織病理學(xué)是卓越的標(biāo)準(zhǔn)。在另一個(gè)示例中，共聚焦顯微鏡是緩慢和麻煩的，以致阻止在外科手術(shù)或圍手術(shù)期手術(shù)室中的應(yīng)用。

因此，存在對(duì)改進(jìn)的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)和相應(yīng)技術(shù)的持續(xù)需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開的實(shí)施方式涉及改進(jìn)的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)和使用所述共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的分析方法。在非限制性實(shí)施方式中，這樣的系統(tǒng)可以用作手術(shù)床旁病理裝置，用于提供生物組織(例如，人類生物組織)中癌癥的存在或不存在的快速測(cè)定的分析方法。

如下面詳細(xì)討論的，所公開的共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式包括光源(例如，相干光源)、適于接收樣品的可移動(dòng)載物臺(tái)、多個(gè)光檢測(cè)器、以及適于將光從光源引導(dǎo)到樣品并且將光從樣品引導(dǎo)到多個(gè)線性陣列檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)。

例如，由光源(例如，激光器)發(fā)射的相干光由光學(xué)系統(tǒng)接收并聚焦成線(例如，通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)的柱面透鏡)。入射光的所述聚焦線由光學(xué)系統(tǒng)引導(dǎo)到固定到載物臺(tái)的目標(biāo)樣品的關(guān)注的焦平面上。通過(guò)響應(yīng)于入射光的熒光，從樣品的焦平面反射或從樣品的焦平面發(fā)射的入射光的至少一部分被接收并且由光學(xué)系統(tǒng)(例如，物鏡)聚焦到多個(gè)線性陣列檢測(cè)器上，所述檢測(cè)器根據(jù)時(shí)間測(cè)量檢測(cè)光。光學(xué)系統(tǒng)可以進(jìn)一步配置成使得入射到樣品上的入射光的路徑和從樣品反射或熒光發(fā)射的檢測(cè)光的路徑遵循不同的路徑。

當(dāng)載物臺(tái)相對(duì)于照明線移動(dòng)樣品時(shí)，時(shí)變檢測(cè)的光特性改變，從而導(dǎo)致線透射，并且因此探測(cè)不同的樣品區(qū)段?？梢砸苿?dòng)載物臺(tái)以便引導(dǎo)線穿過(guò)樣品，從而允許對(duì)關(guān)注的整個(gè)焦平面進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。所述過(guò)程可以針對(duì)多個(gè)焦平面重復(fù)，以根據(jù)時(shí)間和位置而獲取樣品的光學(xué)測(cè)量值。光學(xué)、時(shí)間和位置數(shù)據(jù)的至少一部分可以進(jìn)一步傳送到與共聚焦顯微鏡通信的計(jì)算裝置，所述共聚焦顯微鏡分析數(shù)據(jù)以生成樣品的三維圖像。

所公開的共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式和相應(yīng)的分析技術(shù)代表了顯著的進(jìn)步。值得注意的是，直到最近，使用線性陣列檢測(cè)器執(zhí)行共聚焦顯微術(shù)是不可行的，因?yàn)樵跇悠钒晒鈽?biāo)記的核的情況，由線性陣列檢測(cè)器記錄信號(hào)所需的入射光強(qiáng)度將導(dǎo)致組織的熱損傷或光漂白熒光分子。然而，近來(lái)，線性陣列檢測(cè)器已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了足夠的靈敏度，使得它們能夠檢測(cè)來(lái)自組織的微小體積的弱光信號(hào)。

與使用二維(例如，平面)光柵掃描方法進(jìn)行檢測(cè)的點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡相比，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行線掃描樣品并使用線性陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)方面，線掃描共聚焦顯微鏡的制造更簡(jiǎn)單和更便宜，因?yàn)樗鼈儾恍枰趦蓚€(gè)獨(dú)立方向上進(jìn)行掃描以形成2維圖像。典型的點(diǎn)掃描顯微鏡將使用可移動(dòng)反射鏡(例如，電流計(jì)反射鏡)，使得偏轉(zhuǎn)的激光束可以成角度進(jìn)入具有可變角度的物鏡，這進(jìn)而改變焦平面中的橫向位置。移動(dòng)反射鏡和對(duì)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行計(jì)時(shí)所需的光電子學(xué)是復(fù)雜的，并且包括反射鏡的其自身必須是“激光質(zhì)量”的部件是昂貴的。在另一方面，線掃描共聚焦顯微鏡能夠比點(diǎn)掃描類型更快地形成圖像，因?yàn)樗鼈円淮我恍械叵驁D像添加像素，而不是一次一個(gè)像素。典型的線性陣列檢測(cè)器可以具有可以同時(shí)注冊(cè)的數(shù)千個(gè)像素，而點(diǎn)檢測(cè)器僅在任何給定時(shí)刻注冊(cè)一個(gè)像素。

在本公開的實(shí)施方式中，提供了一種共聚焦顯微鏡。顯微鏡包括：光源；載物臺(tái)，其適于將樣品固定到其上；多個(gè)線性陣列檢測(cè)器；以及光學(xué)系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)包括：柱面透鏡，其定位成接收由光源發(fā)射的第一光，并且在所述樣品固定到載物臺(tái)時(shí)將第一光以線聚焦在樣品的選定平面上；以及物鏡，其定位成響應(yīng)于第一光入射到樣品上而接收來(lái)自樣品的第二光，并且將第二光聚焦在多個(gè)線性陣列檢測(cè)器中的至少一個(gè)上；其中載物臺(tái)進(jìn)一步適于將樣品定位在物鏡的焦平面附近，并且相對(duì)于第一光的聚焦線移動(dòng)樣品。

共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式可以任何組合進(jìn)一步包括以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，光源是單個(gè)激光源。

在實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡還包括光學(xué)斬波器，并且光源包括至少兩個(gè)激光器，每個(gè)激光器發(fā)射不同的激光束，其中光學(xué)斬波器允許每個(gè)不同的激光束以不同于其他激光束的時(shí)間傳遞到樣品上。

在實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡還包括計(jì)時(shí)系統(tǒng)，所述計(jì)時(shí)系統(tǒng)測(cè)量斬波器的位置，識(shí)別斬波器允許第一光照射樣品的光源，并且測(cè)量光源對(duì)樣品的照射的持續(xù)時(shí)間。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，其中計(jì)時(shí)系統(tǒng)包括運(yùn)動(dòng)檢測(cè)器、信號(hào)燈和位于斬波器兩側(cè)上的時(shí)鐘檢測(cè)器，其中時(shí)鐘檢測(cè)器響應(yīng)于信號(hào)燈的檢測(cè)而生成時(shí)鐘信號(hào)，所述時(shí)鐘信號(hào)對(duì)應(yīng)于所識(shí)別的光源對(duì)樣品的照射的持續(xù)時(shí)間。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，計(jì)時(shí)系統(tǒng)包括運(yùn)動(dòng)檢測(cè)器和與光源相對(duì)定位的時(shí)鐘檢測(cè)器，其中時(shí)鐘檢測(cè)器響應(yīng)于所識(shí)別的光源的照明的檢測(cè)而生成時(shí)鐘信號(hào)，并且其中時(shí)鐘信號(hào)對(duì)應(yīng)于所識(shí)別的光源對(duì)樣品的照射的持續(xù)時(shí)間。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，載物臺(tái)相對(duì)于聚焦在樣品上的第一光的線而物理地平移樣品，而不移動(dòng)第一光。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，光學(xué)系統(tǒng)還包括：第一分束器，其被定位成將從樣品熒光發(fā)射的第二光反射到多個(gè)線性檢測(cè)器陣列的第一線性檢測(cè)器陣列上；以及第二分束器，其被定位成將從樣品反射的第二光反射到多個(gè)線性檢測(cè)器陣列的第二線性檢測(cè)器陣列上。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，從樣品熒光發(fā)射的第二光具有不同于第一光的波長(zhǎng)，并且其中從樣品反射的第二光具有與第一光近似相同的波長(zhǎng)。

在共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式中，從樣品熒光發(fā)射的第二光與第一線性檢測(cè)器陣列之間的路徑不同于從樣品反射的所述第二光與第二線性檢測(cè)器陣列之間的路徑。

在本公開的實(shí)施方式中，提供了一種對(duì)樣品進(jìn)行成像的方法。所述方法包括提供共聚焦顯微鏡，其包括：光源；載物臺(tái)，其適于將樣品固定到其上；多個(gè)線性陣列檢測(cè)器；以及光學(xué)系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)包括：柱面透鏡，其定位成接收由光源發(fā)射的第一光，并且在固定到載物臺(tái)時(shí)將第一光以線聚焦在樣品的選定平面上；以及物鏡，其定位成響應(yīng)于第一光入射到樣品上而接收來(lái)自樣品的第二光，并且將第二光聚焦在多個(gè)線性陣列檢測(cè)器中的至少一個(gè)上；其中載物臺(tái)進(jìn)一步適于將樣品定位在物鏡的焦平面附近，并且相對(duì)于第一光的聚焦線移動(dòng)樣品。所述方法的實(shí)施方式還包括：將載物臺(tái)定位在第一位置處，其中第一光以線聚焦在樣品的第一選定平面上；由多個(gè)線性陣列檢測(cè)器中的至少一個(gè)根據(jù)聚焦在樣品的第一選定焦平面上的第二光的時(shí)間測(cè)量強(qiáng)度；將載物臺(tái)定位在不同于第一位置的第二位置處，其中第一光以線聚焦在樣品的第二選定平面上；以及由多個(gè)線性陣列檢測(cè)器中的至少一個(gè)根據(jù)聚焦在樣品的第二選定焦平面上的第二光的時(shí)間測(cè)量強(qiáng)度。

所述方法的實(shí)施方式可以任何組合進(jìn)一步包括以下各項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)。

在所述方法的實(shí)施方式中，第一選定位置近似垂直于第一光的聚焦線的方向平移。

在實(shí)施方式中，所述方法還包括從與共聚焦顯微鏡分離的數(shù)字圖像捕獲裝置獲取樣品的光學(xué)圖像，所述光學(xué)圖像具有大于述樣品的視場(chǎng)。

在實(shí)施方式中，所述方法還包括在與目標(biāo)計(jì)算裝置通信的顯示裝置上顯示光學(xué)圖像，目標(biāo)計(jì)算裝置適于從用戶接收矢量目標(biāo)輸入，其中矢量目標(biāo)對(duì)應(yīng)于樣品的關(guān)注區(qū)域。

在所述方法的實(shí)施方式中，目標(biāo)計(jì)算裝置與載物臺(tái)通信，并且其中載物臺(tái)進(jìn)一步適于：從目標(biāo)計(jì)算裝置接收矢量目標(biāo)；并且對(duì)樣品進(jìn)行定位，使得第一光以線聚焦在樣品的關(guān)注區(qū)域內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1a至圖1c是本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式的示意圖；

圖2a至圖2b是在所公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的某些實(shí)施方式中采用的照明和計(jì)時(shí)方案的示意圖；

圖3是在本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式中使用的照明和檢測(cè)路徑的示意圖；

圖4a至圖4b是在本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式中使用的檢測(cè)通道的示意圖；

圖5是在本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式中使用的光學(xué)配置的示意圖；

圖6是在本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式中使用的樣本掃描方案的示意性框圖；并且

圖7是示出并入本公開的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的實(shí)施方式的臨床顯微鏡設(shè)計(jì)的示意性框圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在將參考附圖討論本公開的實(shí)施方式。圖1a是本公開的共聚焦顯微鏡(101)的實(shí)施方式的示意圖。顯微鏡(101)包括光源(103)、柱面透鏡(105)、多個(gè)檢測(cè)器(107)、物鏡(109)、分束器(111)和載物臺(tái)(113)。在圖1a中，為了清楚描述起見，透鏡系統(tǒng)被象征性地表示為單個(gè)透鏡(105)和(109)。然而，隨后的附圖，從圖4開始，透鏡和光學(xué)配置被明確地表示。

利用柱面透鏡(105)將從光源(103)發(fā)出的光作為線聚焦到樣品的平面上。這種光在這里可以稱為“照明光”。然后，照明光從樣品反射和/或熒光地向后放射。來(lái)自樣品的所述光從入射光束的路徑(通過(guò)分束器111)朝向檢測(cè)器(107)分離，所述檢測(cè)器可以包括一個(gè)或多個(gè)線性陣列檢測(cè)器。檢測(cè)到的光由共軛光學(xué)系統(tǒng)(109)進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述共軛光學(xué)系統(tǒng)將樣品上的入射光的聚焦線映射到一個(gè)或多個(gè)共軛焦平面中的一個(gè)或多個(gè)線性陣列檢測(cè)器(107)上(在多個(gè)檢測(cè)器的情況下)。載物臺(tái)(113)使樣品(例如，組織樣本)在空間中相對(duì)于光學(xué)系統(tǒng)(例如，105、109)平移，從而允許探測(cè)整個(gè)樣本的部分。

在所公開的共聚焦顯微鏡(101)的某些實(shí)施方式中，入射激光線被聚焦到放置樣品(例如，組織樣本)的窗口的表面上或在其附近，并且使用了單獨(dú)的光路用于將所述平面成像到包含線性陣列檢測(cè)器的共軛焦平面。使用用于照明和檢測(cè)的兩個(gè)單獨(dú)路徑使得能夠獨(dú)立地調(diào)節(jié)兩個(gè)光束(例如，通過(guò)將柱面透鏡(105)放置在照明路徑中以在樣品焦平面中產(chǎn)生聚焦光線)。

在顯微鏡(101)的其他實(shí)施方式中，通過(guò)移動(dòng)載物臺(tái)以使樣品(例如，組織樣本)在空間中相對(duì)于設(shè)備平移來(lái)執(zhí)行組織樣本(例如，癌組織)的掃描，所述設(shè)備用線照亮樣品并且對(duì)檢測(cè)器平面處的照明線進(jìn)行成像。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，不需要波束掃描(波束相對(duì)于顯微鏡的光學(xué)移動(dòng))。

圖1b呈現(xiàn)用于允許來(lái)自熒光核染色的成像對(duì)比度的熒光檢測(cè)配置中的共聚焦顯微鏡(101)的實(shí)施方式的另一示意圖。例如，物鏡，lobj物鏡(109)被擴(kuò)展成兩個(gè)透鏡，以示出lobj是由復(fù)合透鏡和檢測(cè)器透鏡組成的透鏡系統(tǒng)，所述兩個(gè)透鏡一起工作以便在光撞擊線性陣列檢測(cè)器之前，調(diào)節(jié)來(lái)自樣品的返回的熒光和/或反射光。

圖1b進(jìn)一步示出分束器(111)透射照明激光并反射熒光發(fā)射光的配置。因此，入射光透射穿過(guò)分束器(111)，同時(shí)從樣品發(fā)射的熒光從分束器反射到檢測(cè)器(107)，線性熒光檢測(cè)器陣列。

圖1c呈現(xiàn)實(shí)現(xiàn)多模式成像對(duì)比度的共聚焦顯微鏡(101)的實(shí)施方式的另一示意圖，其中兩種模式是反射和熒光。反射模式提供與樣品的組織結(jié)構(gòu)的對(duì)比度，并且熒光模式提供與樣品的細(xì)胞核的對(duì)比度。在所述配置中，檢測(cè)到的光被分離到由單獨(dú)的檢測(cè)器(分別為107a、107b)檢測(cè)到的反射光路和熒光光路中?？梢宰⒁獾?，分束器(圖1a至圖1c中所示)可以用于反射照明光(圖1a)或反射檢測(cè)到的光(圖1b、圖1c)。

顯微鏡(101)的實(shí)施方式表示共聚焦顯微中的范例變化。在一個(gè)方面，常規(guī)的共聚焦顯微獲得具有點(diǎn)掃描共聚焦配置的方形視場(chǎng)。相比之下，所公開的共聚焦顯微鏡(101)的實(shí)施方式實(shí)施線掃描以克服高分辨率下視場(chǎng)的限制。這意味著所述線可以比斷言(predicate)點(diǎn)掃描系統(tǒng)中的方形視場(chǎng)更長(zhǎng)。

在另一方面，常規(guī)的共聚焦顯微鏡采用掃描激光束，這通常通過(guò)使照明波束聚焦離開旋轉(zhuǎn)鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)。相比之下，通過(guò)采用平移載物臺(tái)而不是掃描激光束，不存在場(chǎng)曲(所述場(chǎng)曲在掃描離開旋轉(zhuǎn)鏡時(shí)出現(xiàn))。在本公開中，樣品可以無(wú)限地平移(取決于驅(qū)動(dòng)載物臺(tái)的電機(jī)的范圍)，從而將垂直于線的方向上的視場(chǎng)擴(kuò)展為大于斷言點(diǎn)掃描系統(tǒng)的方形視場(chǎng)。因此，共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式在載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)的方向上提供不受限制的視場(chǎng)。

如上所討論，消除在載物臺(tái)掃描方向上的照明場(chǎng)曲的優(yōu)點(diǎn)與單獨(dú)的照明和檢測(cè)路徑的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，即，視場(chǎng)也不受聚焦光線的方向(近似垂直于載物臺(tái)掃描的方向)上的場(chǎng)曲限制。這是因?yàn)橹嫱哥R在其軸線(聚焦光線的軸線)上沒有曲率，因此可以在物理尺寸上延伸，以形成在空間中是筆直(即，基本上不彎曲)的長(zhǎng)線。

在聚焦光線的方向上不存在場(chǎng)曲以及在載物臺(tái)平移的方向上不存在場(chǎng)曲在合理的限度內(nèi)提供了大視場(chǎng)。例如，可以利用所公開的共聚焦顯微鏡的實(shí)施方式容易地實(shí)現(xiàn)多厘米的視場(chǎng)。相比之下，標(biāo)準(zhǔn)的高分辨率顯微鏡通常限于小于1mm的視場(chǎng)。這表示大于10倍的視場(chǎng)的改善，這在檢查通常大于1mm的視場(chǎng)的切除組織樣本時(shí)是非常有利的。

光源(103)的實(shí)施方式可以是相干點(diǎn)源，諸如激光器。在某些實(shí)施方式中，激光源進(jìn)行準(zhǔn)直。在替代實(shí)施方式中，激光源不進(jìn)行準(zhǔn)直，而是在柱面透鏡(105)的曲率方向上發(fā)散，并且在光被注入系統(tǒng)中以便行進(jìn)通過(guò)物鏡系統(tǒng)的合成部件，之后投射到樣品上的情況下可以省略柱面透鏡，并且因此在激光束不發(fā)散的方向上使用物鏡的聚焦能力。在這種情況下激光器的重要參數(shù)是：發(fā)散度(以度計(jì))將確定樣品中的線的長(zhǎng)度。約3度的典型發(fā)散因子對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物鏡的視場(chǎng)是足夠的，但是可以通過(guò)使用更大的激光發(fā)散度來(lái)擴(kuò)展線。

柱面透鏡(105)的實(shí)施方式可以是數(shù)值孔徑，其與照明光的波長(zhǎng)結(jié)合產(chǎn)生足夠小的聚焦線以解析生物組織的重要細(xì)胞和核細(xì)節(jié)，使得能夠確定所述組織的病理狀態(tài)。例如，聚焦線可以具有小于或等于約1μ的厚度。

多個(gè)檢測(cè)器(107)的實(shí)施方式可以包括在垂直于線性陣列的方向上的像素寬度，近似等于在投射到檢測(cè)器焦平面中時(shí)的聚焦線的厚度。以這種方式，實(shí)現(xiàn)了線檢測(cè)中的共聚焦門控。多個(gè)檢測(cè)器還能夠具有與載物臺(tái)(113)的行進(jìn)速率相稱的線采集速率。多個(gè)檢測(cè)器的靈敏度(例如，光電靈敏度、電子增益和信號(hào)調(diào)節(jié)中的至少一個(gè))提供了強(qiáng)的信噪比。例如，多個(gè)檢測(cè)器中的每一個(gè)的信噪比可以在約10至約100之間的范圍內(nèi)獨(dú)立地選擇。

物鏡(109)的實(shí)施方式可以包括被設(shè)計(jì)成具有近似平坦的焦平面的球面透鏡。在這種情況下，保持?jǐn)?shù)值孔徑高(從而保持良好的分辨率)需要實(shí)施大透鏡。因此，在某些實(shí)施方式中，物鏡可以具有在約0.5英寸至約1.5英寸之間的范圍內(nèi)選擇的直徑。物鏡(109)的替代實(shí)施方式可以包括特殊的玻璃設(shè)計(jì)，其得到在照明線入射到共軛檢測(cè)器焦平面上的樣品焦平面的區(qū)域的近似平坦的共軛。

分束器(111)的實(shí)施方式可以包括薄膜分束器的實(shí)現(xiàn)方式，所述薄膜分束器是極其薄的膜(例如，約3-5μm)。使用薄分束器的優(yōu)點(diǎn)是使球面像差最小化。分束器(111)的實(shí)施方式還可以包括被偏振的板分束器(圖3，元件11)，用于與四分之一波片(圖3，元件8)結(jié)合從而最大程度地反射光。替代實(shí)施方式包括也稱為二向色分束器的彩色分束器(10)，以分離具有熒光發(fā)射波長(zhǎng)的光。

載物臺(tái)(113)的實(shí)施方式可以具有便于成像的一種或多種能力。在一個(gè)方面，載物臺(tái)(113)具有足夠小以解析核和細(xì)胞細(xì)節(jié)的最小步長(zhǎng)(例如，小于或等于約0.1μm)。在另一方面，載物臺(tái)(113)具有足夠精細(xì)使得順序獲取的相鄰掃描可以無(wú)縫地結(jié)合在一起(即，沒有實(shí)質(zhì)的配準(zhǔn)誤差)位置重復(fù)性。在另一方面，載物臺(tái)(113)具有俯仰和傾斜調(diào)整，以將光學(xué)窗口的平面(附接到載物臺(tái)(113)并且樣本被保持在所述平面上)與物鏡的焦平面對(duì)準(zhǔn)到約1μm的期望值內(nèi)，使得當(dāng)在樣品的大側(cè)向區(qū)域上平移載物臺(tái)時(shí)，光學(xué)窗口的位置變化不大于約5μm。

現(xiàn)在將討論圖2a至圖2b，其示出共聚焦顯微鏡(101)的實(shí)施方式，所述實(shí)施方式在發(fā)射不同波長(zhǎng)的照明光的兩個(gè)光源(103a、103b)之間交替光源。在某些實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡(101)還包括作用類似于風(fēng)扇的回旋葉片的光學(xué)斬波器(125)。斬波器(125)的功能是交替哪個(gè)照明光被允許穿過(guò)斬波器并且作為線聚焦在樣品上。

在實(shí)施方式中，具有信號(hào)燈(虛線)和時(shí)鐘檢測(cè)器(實(shí)線)的運(yùn)動(dòng)檢測(cè)器(127)定位于斬波器風(fēng)扇的兩側(cè)上，并生成時(shí)鐘信號(hào)，所述時(shí)鐘信號(hào)用于通過(guò)單獨(dú)的激光器103a、103b指示照明時(shí)段。在替代實(shí)施方式中，可以通過(guò)省略運(yùn)動(dòng)檢測(cè)器中的光源，而代之以檢測(cè)一個(gè)或兩個(gè)激光束的一小部分來(lái)獲得時(shí)鐘信號(hào)。共聚焦顯微鏡的這種配置導(dǎo)致在源(即，在兩個(gè)激光器之間)和因此波長(zhǎng)交替的照明光的輸出，以及用于對(duì)采集進(jìn)行定時(shí)的時(shí)鐘信號(hào)(131)。以這種方式，可以通過(guò)線性陣列檢測(cè)器在單獨(dú)的激光波長(zhǎng)照明下獲得單獨(dú)的線測(cè)量值，并且樣品保持載物臺(tái)的移動(dòng)可以被定時(shí)，使得在實(shí)現(xiàn)所有激光照明之后，樣品移動(dòng)到新的位置，并重復(fù)所述過(guò)程。在某些實(shí)施方式中，時(shí)鐘信號(hào)(131)直接到達(dá)線性陣列檢測(cè)器(18)(參見圖4、圖5)，而在其他實(shí)施方式中，時(shí)鐘信號(hào)(131)到達(dá)計(jì)算機(jī)(28)(參見圖7)，進(jìn)而觸發(fā)線性陣列檢測(cè)器(18)以獲取入射到其上的光的測(cè)量值。

在某些實(shí)施方式中(參見例如圖3)，共聚焦顯微鏡包括柱面透鏡[7]，所述柱面透鏡使來(lái)自光源(例如[1]、[2])的光通過(guò)四分之一波片[8]以線[9]聚焦到樣品上。在返回路徑上，其中光從樣品發(fā)出回到光學(xué)系統(tǒng)，第一分束器[10]被定位成相對(duì)于激光照明以約90度反射熒光發(fā)射。類似地，偏振分束器[11]被定位成當(dāng)線相對(duì)于激光照明以約90度照射組織時(shí)反射被散射的激光。兩個(gè)反射分束器將從樣品發(fā)出的光(熒光[12]和反射光[13])導(dǎo)向兩個(gè)檢測(cè)通道：熒光檢測(cè)通道[14](例如，第一線性陣列檢測(cè)器)和反射檢測(cè)通道[15](例如，第二線性陣列檢測(cè)器)。

在其中將四分之一波片[8]放置在光路中是不利的某些實(shí)施方式中，省略了四分之一波片[8]并且用50/50分束器代替偏振分束器[11]。

在某些實(shí)施方式中，共聚焦顯微鏡(例如參見圖4)還包括用于光學(xué)檢測(cè)的無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡[16]。透鏡[16]被定位以便聚焦到包含樣品焦平面[9]中的照明線的平面，使得物鏡[16]與分束器[10]之間的距離以及分束器[10]與線照明[9]之間的距離的和近似等于物鏡[16]的焦距。應(yīng)當(dāng)注意，就間距而言，這些實(shí)施方式中的術(shù)語(yǔ)“物鏡”是指物鏡的薄透鏡等同物的理論平面，其可以是多透鏡復(fù)合光學(xué)器件。

檢測(cè)器透鏡[17]放置在距物鏡一定距離處，所述距離是物鏡[16]的焦距和檢測(cè)器透鏡[17]的焦距的和。線性陣列檢測(cè)器[18]放置在檢測(cè)器透鏡的焦平面中(即，與檢測(cè)器透鏡相距一定距離，所述距離約為檢測(cè)器透鏡的焦距)。由熒光檢測(cè)通道[14]進(jìn)行的熒光檢測(cè)遵循由反射通道進(jìn)行的光學(xué)檢測(cè)方案[15]。

在某些實(shí)施方式中，為方便起見，可以可選地在透鏡[16、17]之間插入額外的望遠(yuǎn)鏡[19]，以調(diào)整照明線[9]到線性陣列檢測(cè)器[18]上的共軛的放大率，使得能夠添加額外的光調(diào)節(jié)光學(xué)器件[22]，或簡(jiǎn)單地拉長(zhǎng)光學(xué)系統(tǒng)。透鏡[16、17]的放置使得(例如在這個(gè)示例中)透鏡[21]與透鏡[17]之間的距離是兩個(gè)透鏡[21、17]的焦距的和，透鏡[20]與透鏡[21]之間的距離是兩個(gè)透鏡[20、21]的焦距的和，透鏡[20]與透鏡[16]之間的距離是兩個(gè)透鏡[20、16]的焦距的和?？梢灶愃频姆绞教砑宇~外的望遠(yuǎn)鏡[22]，以無(wú)限地修改共聚焦顯微鏡(101)。

在某些實(shí)施方式中(參見例如圖5)，調(diào)整物鏡[16]的位置，使得激光通過(guò)柱面透鏡[7]聚焦到物鏡[16]的后焦平面上。

在某些實(shí)施方式中，激光源不進(jìn)行準(zhǔn)直，而是在柱面透鏡[7]的曲率方向上發(fā)散，并且可以完全省略柱面透鏡[7]。

在某些實(shí)施方式中，本文所公開的裝置不包含移動(dòng)光束。實(shí)際上，樣品相對(duì)于光學(xué)系統(tǒng)俯仰、傾斜和平移。需要平移以形成圖像，并且需要俯仰/傾斜以使樣品的表面與物鏡的焦平面平行。平移方案(參見例如圖6)包括5維微定位單元[23]，所述5維微定位單元?jiǎng)傂缘伛詈系焦鈱W(xué)系統(tǒng)[24]并且控制樣品的x、y和z位置以及樣品相對(duì)于垂直于光學(xué)照明路徑[26]和檢測(cè)路徑[27]的平面的俯仰和傾斜。

在某些實(shí)施方式中，包含待成像樣本的樣品固定裝置以可調(diào)整的方式[25]機(jī)械地耦合到微定位單元[23]。俯仰、傾斜和z微操縱可以用于定位樣品，使其表面位于物鏡[16]的焦平面中。y微操縱器使樣品垂直于物鏡[16]的焦平面中的照明線[9]移動(dòng)，而線性陣列檢測(cè)器[14]獲取被組裝以形成平面視場(chǎng)的一系列線。y微操縱器沿著照明線的方向移動(dòng)樣品，使得在獲取視場(chǎng)之后，可以獲取隨后的一個(gè)或多個(gè)視場(chǎng)以覆蓋樣品表面的附加部分。z微操縱器可以用于獲取平面堆疊以形成3d圖像。

在某些實(shí)施方式中，所獲得的圖像數(shù)據(jù)可以由一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)處理器[28、36等]處理和/或顯示，并且經(jīng)處理的數(shù)據(jù)[34、37]、診斷或皮膚病的存在或不存在的指示符[38]可以輸出到一個(gè)或多個(gè)顯示模塊并由其顯示。在某些實(shí)施方式中，存在針對(duì)外科手術(shù)設(shè)置和遠(yuǎn)程醫(yī)療模式[36]優(yōu)化的數(shù)字顯示器[32]，使得可以由專家病理學(xué)家實(shí)時(shí)檢查顯微鏡圖像。共聚焦顯微鏡(參見例如圖7)通常包括通過(guò)計(jì)算機(jī)處理器[28]與從計(jì)算機(jī)到顯微鏡[29]的通信連接的共聚焦顯微鏡，所述通信諸如用于驅(qū)動(dòng)微定位平移載物臺(tái)[23]的命令、用于獲取線性陣列檢測(cè)器(18)上的數(shù)據(jù)的觸發(fā)器、用于打開/關(guān)閉激光器[1、2]和斬波器[3]以及從顯微鏡到計(jì)算機(jī)[30]的通信的信號(hào)，諸如來(lái)自斬波器[6]的時(shí)鐘信號(hào)、來(lái)自線性陣列檢測(cè)器[18]的圖像數(shù)據(jù)。

在某些實(shí)施方式中，常規(guī)的數(shù)字相機(jī)[31]對(duì)樣本進(jìn)行成像，并且實(shí)況視頻[33]被發(fā)送到計(jì)算機(jī)處理器[28]，所述計(jì)算機(jī)處理器進(jìn)而以數(shù)據(jù)流[34]將圖像饋送到數(shù)字觸摸屏顯示器[32]上，使得操作者可以通過(guò)手動(dòng)觸摸或鼠標(biāo)點(diǎn)擊期望的共聚焦掃描的區(qū)域坐標(biāo)來(lái)進(jìn)行選擇。所述用戶選擇的坐標(biāo)信息被中繼到計(jì)算機(jī)[35]以用于控制共聚焦圖像采集。

在某些實(shí)施方式中，在共聚焦圖像掃描期間，一個(gè)或多個(gè)共聚焦圖像被獲取，通過(guò)潛在地合并來(lái)組裝，并且作為信號(hào)[34]發(fā)送到臨床顯示監(jiān)視器[32]以進(jìn)行顯示。

在某些實(shí)施方式中，具有顯示器的遠(yuǎn)程病理學(xué)計(jì)算機(jī)處理器[36]接收?qǐng)D像數(shù)據(jù)[37]，并且可以用于傳送皮膚疾病存在或不存在的診斷或指示符或指示圖像樣本上的關(guān)注區(qū)域的修改圖像。

本文所使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)不意圖排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是認(rèn)識(shí)到在所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方式，示例性實(shí)施方式和任選特征具體公開，但是本文公開的概念的修改和變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采取，并且這樣的修改和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文提供的具體實(shí)施方式是本發(fā)明的有用實(shí)施方式的示例，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明可以使用本說(shuō)明書中所闡述的裝置、裝置部件、方法步驟的大量變化來(lái)實(shí)施。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，用于本方法的方法和裝置可以包括大量任選的組合物和處理元件和步驟。

當(dāng)本文公開了一組取代基時(shí)，應(yīng)理解所述基團(tuán)的所有單個(gè)成員和所有亞類(包括基團(tuán)成員的任何異構(gòu)體)對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體分別公開。當(dāng)在本文中使用馬庫(kù)什組或其他分組時(shí)，所述組的所有個(gè)體成員以及所述組的所有可能的組合和子組合旨在單獨(dú)地包括在本公開中。當(dāng)本文描述化合物使得化合物的特定異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體沒有例如在式或化學(xué)名稱中指定時(shí)，所述描述意在包括單獨(dú)或以任何組合描述的化合物的各異構(gòu)體和對(duì)映異構(gòu)體。另外，除非另有說(shuō)明，否則本文公開的化合物的所有同位素變體意欲包括在本公開內(nèi)容中。例如，應(yīng)當(dāng)理解，所公開的分子中的任何一個(gè)或多個(gè)氫可以被氘或氚代替。分子的同位素變體通常用作分子測(cè)定中以及與分子或其用途相關(guān)的化學(xué)和生物研究中的標(biāo)準(zhǔn)。制備這種同位素變體的方法是本領(lǐng)域已知的?；衔锏木唧w名稱意在是示例性的，因?yàn)橐阎绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可以不同地命名相同的化合物。

除非另有說(shuō)明，本文描述或舉例的每種制劑或組分的組合可用于實(shí)踐本發(fā)明。

每當(dāng)在說(shuō)明書中給出范圍時(shí)，例如，溫度范圍、時(shí)間范圍或組成、組分或濃度范圍、所有中間范圍和子范圍，以及包括在給定范圍內(nèi)的所有單獨(dú)值意在包括在本公開中。應(yīng)當(dāng)理解，包括在本文的說(shuō)明書中的范圍或子范圍中的任何子范圍或單個(gè)值可以從本文的權(quán)利要求中排除。

說(shuō)明書中提及的所有專利和出版物指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。本文引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文，以指示其出版或申請(qǐng)日期時(shí)的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，并且如果需要，本文可以采用所述信息以排除現(xiàn)有技術(shù)中的具體實(shí)施方式。例如，當(dāng)要求保護(hù)物質(zhì)組成時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在申請(qǐng)人的發(fā)明之前本領(lǐng)域已知和可獲得的化合物，包括在本文引用的參考文獻(xiàn)中提供了使能公開內(nèi)容的化合物，不旨在包括在本文的物質(zhì)組成。

必須注意，如本文和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確指示。因此，例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)這樣的細(xì)胞及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物等等。同樣，術(shù)語(yǔ)“一”(或“一個(gè)”)、“一個(gè)或多個(gè)”和“至少一種”可以在本文中互換使用。還要注意，術(shù)語(yǔ)“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有”可以互換使用。“任何權(quán)利要求xx-yy”(其中xx和yy是指權(quán)利要求號(hào))的表達(dá)意在以替代形式提供多重從屬權(quán)利要求，并且在一些實(shí)施方式中可與表達(dá)“如權(quán)利要求xx-yy中任一項(xiàng)”互換。

除非另外定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解含義相同的含義。盡管在實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明時(shí)可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法和材料。本文中的任何內(nèi)容不被解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格由于在先發(fā)明而早于這樣的公開。

除非另有說(shuō)明，本文描述或舉例的每種制劑或組分的組合可用于實(shí)踐本發(fā)明。

每當(dāng)在說(shuō)明書中給出范圍時(shí)，例如，溫度范圍、時(shí)間范圍或組成或濃度范圍、所有中間范圍和子范圍，以及包括在給定范圍內(nèi)的所有單獨(dú)值意在包括在本公開中。如本文所使用的，范圍具體包括作為范圍的端點(diǎn)值提供的值。例如，1至100的范圍具體包括1和100的端點(diǎn)值。應(yīng)當(dāng)理解，包括在本文的說(shuō)明書中的范圍或子范圍中的任何子范圍或單個(gè)值可以從本文的權(quán)利要求中排除。

如本文所用，“包括(comprising)”與“包括(including)”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括性的或開放式的，并且不排除額外的未記載的元件或方法步驟。如本文所用，“由...組成”排除未在權(quán)利要求元素中指定的任何元素、步驟或成分。如本文所用，“基本上由...組成”不排除不實(shí)質(zhì)上影響權(quán)利要求的基本和新穎特征的材料或步驟。在本文的每種情況下，術(shù)語(yǔ)“包括”、“基本上由...組成”和“由...組成”中的任何一個(gè)可以用其他兩個(gè)術(shù)語(yǔ)中的任一個(gè)替代。本文中示例性描述的本發(fā)明可以在不存在本文沒有具體公開的任何一個(gè)或多個(gè)元件、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下實(shí)施。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，除了那些具體舉例說(shuō)明的起始材料、生物材料、試劑、合成方法、純化方法、分析方法、測(cè)定方法和生物學(xué)方法可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中而不依賴于不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。任何這種材料和方法的所有本領(lǐng)域已知的功能等同物旨在包括在本發(fā)明中。所使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)不意圖排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是認(rèn)識(shí)到在所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方式和任選特征具體公開，但是本文公開的概念的修改和變化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采取，并且這樣的修改和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。