專利名稱：顯微鏡成像的校準靶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及顯微鏡成像技術(shù)，并且具體地涉及用于提高顯微鏡放大倍率的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代科學研究中采用許多不同類型的成像系統(tǒng)來采集小或遠的物體的圖像，包括極高分辨率電子顯微鏡、極高分辨率掃描隧道(“STM”)與原子力(“AFM”)成像儀器和許多不同類型的光學顯微鏡、望遠鏡與圖像生成傳感器。如同大多數(shù)類型的成像裝置、儀器和技術(shù)，存在與不同類型的顯微鏡方法關(guān)聯(lián)的許多不同的折衷和平衡。例如，透射電子顯微鏡方法對固定和薄切片樣品進行，并且因此約束于對基本上二維、無生命樣品使用。掃描隧道和原子力顯微鏡方法是用于獲得材料表面的高分辨率圖像的非光學技術(shù)，但不可以用于獲得關(guān)于表面下方樣品的體積的納米尺度或微米尺度內(nèi)含物的信息。所有類型的顯微鏡方法無論如何受分辨率限制約束，而光學顯微鏡方法與稱為“衍射極限”的可能最有名的分辨率限制關(guān)聯(lián)，其將傳統(tǒng)可見光光學顯微鏡方法限制于大約200nm的分辨率極限。在過去的20年期間，開發(fā)了各種超分辨率技術(shù)來允許熒光團-標記樣品(最經(jīng)常是生物樣品)由光學突光-顯微鏡方法儀器以顯著低于傳統(tǒng)光學顯微鏡方法的衍射-限制分辨率的分辨率的成像。這些技術(shù)基于收集從熒光團-標記樣品隨時間發(fā)射的熒光。假如發(fā)射熒光團按大于大約200nm的距離彼此分開，或換句話說，假如熒光團在樣品中的位置將可由傳統(tǒng)光學顯微鏡方法分辨，可以確定熒光團在樣品中的位置，在某些情況下達到IOnm以下的分辨率。然而，因為僅當發(fā)射熒光團在樣品內(nèi)稀疏布置時可以解釋熒光-發(fā)射信號，一般需要從不同組的稀疏布置的熒光團產(chǎn)生大量的中間圖像，以便構(gòu)建熒光團-標記物體的超分辨率最終圖像。從而超分辨率圖像以積累相對弱的信號來產(chǎn)生更大量的中間圖像需要的時間為代價而獲得。超分辨率成像需要的時間不利于活細胞的成像，其趨于在收集相對弱的信號(從其構(gòu)建超分辨率圖像)需要的時間段期間移動和改變形狀。收集相對弱的信號需要的長時間段還可導致活細胞暴露于有害或致命水平的電磁輻射，其包括紫外光。采集用于超分辨率成像的足夠數(shù)據(jù)需要的時間還可代表顯著的實驗約束，而不管成像的樣品的類型。由于所有這些原因，設計和開發(fā)、制造光學顯微鏡的那些人繼續(xù)尋找系統(tǒng)和方法來捕捉衍射極限以下的圖像。

發(fā)明內(nèi)容
該公開針對光學顯微鏡校準裝置，其可以與光學顯微鏡一起使用來調(diào)節(jié)顯微鏡成像參數(shù)使得樣品的圖像可以在衍射極限以下獲得。這些顯微鏡校準裝置包括至少一個校準靶。每個校準靶包括具有顯微鏡物鏡的衍射極限以下的尺寸的多個特征。對特定放大倍率獲得校準靶中的一個的單獨顏色分量衍射限制的圖像。圖像處理可以用于組合這些顏色分量圖像，并且獲得校準靶的聚焦并且無畸變的圖像。用于獲得校準靶的該聚焦并且無畸變的圖像的參數(shù)可以用于用相同的參數(shù)獲得對相同放大倍率的樣品的聚焦并且無畸變的圖像。


圖1A-1C示出光學顯微鏡校準裝置的不同視圖。圖2示出接收從物面中的點源輸出的光并且分散開來在對應像面中產(chǎn)生斑點的光學系統(tǒng)。圖3A-3B示出理論點擴散函數(shù)的示例表示。圖4示出與光學系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的衍射極限。圖5示出固定到顯微鏡載玻片的表面的校準裝置。圖6示出附連到載玻片的表面的校準裝置的橫截面視圖。圖7示出具有附連的校準裝置的載玻片的橫截面視圖。圖8A示出顯微鏡內(nèi)的光學路徑，該顯微鏡具有發(fā)射在可見光譜中波長的寬范圍上的光的光源。圖8B示出從校準靶的子區(qū)中的孔輸出的光束的一示例。圖SC示出與從校準靶的子區(qū)中的孔輸出的光關(guān)聯(lián)的三個單獨顏色分量圖像的一示例。圖8D示出具有各自發(fā)射在可見光譜的不同波長范圍中的光的單獨光源的顯微鏡的一示例。圖9A-9B示出與校準靶的子區(qū)關(guān)聯(lián)的一系列原像的示例表示。圖10示出用于校正物鏡的色差和衍射極限的圖像校準的一假設示例。圖11A-11D示出當校準原像來產(chǎn)生校準圖像時要確定的校準參數(shù)的圖形表示。圖12示出在與校準靶的子區(qū)關(guān)聯(lián)的三維圖像空間中的區(qū)的假設透視圖。圖13示出具有六個單獨校準靶的光學顯微鏡校準裝置。圖14A-14B示出具有校準裝置的蓋玻片的立體圖和俯視圖。圖15A-15B示出具有固定到顯微鏡載玻片的校準的蓋玻片。圖16示出獲得衍射極限以下的樣品圖像的方法的流程圖。圖17示出執(zhí)行圖像處理步驟的典型電子計算機系統(tǒng)。
具體實施例方式圖1A-1C示出光學顯微鏡校準裝置100的不同視圖。在圖1A中，校準裝置100包括設置在透明板104上的不透明層102。該不透明層102包括位于裝置100的近似中心的校準靶106。裝置100還可包括設置在該不透明層102外表面上的多個方向箭頭108來輔助安置裝置100，使得靶106位于顯微鏡物鏡的視場內(nèi)。圖1B示出由特征110的二維方形點陣構(gòu)成的校準靶106的放大視圖。在其他實施例中，特征108可以具有其他二維點陣布置，例如特征的菱形、六邊形、矩形、平行四邊形或甚至隨即分布。特征110可以是在不透明層102中形成的孔。圖1C示出沿圖1B中示出的線1-1的校準裝置100的校準靶106部分的橫截面視圖。該橫截面視圖展現(xiàn)設置在透明板104的表面上的不透明層102，并且特征110是位于層102內(nèi)的孔。圖1C包括層102和透明板104的一部分的放大視圖112。該放大視圖112展現(xiàn)將層102粘附到透明板104的表面的薄粘合劑層114，并且示出跨越不透明層102和粘合劑層114的高度并且具有大致上垂直于表面的側(cè)壁的孔110。也就是說，每個孔110暴露粘合劑層114設置在其上的透明層104表面的一部分。如在圖1C中示出的，透明板102的厚度T可以從大約0.1mm變化到大約1.0mm,并且可以由任何適合的透明材料構(gòu)成，例如玻璃或透明聚合物。不透明層102的厚度t可以從大約20nm變化到大約IOOnm或更大，并且可以由任何適合的不透明材料構(gòu)成，例如金(“Au”)和銀(“Ag”)。粘合劑層114可以由任何適合的材料構(gòu)成，其將不透明層102附連到透明層104的表面。例如，如果不透明層102由Au構(gòu)成并且透明板104由玻璃構(gòu)成，那么鉻(“Cr”)可以用于將不透明層102附連到玻璃表面。如圖1B的示例示出的,孔110的點陣包括由孔的較不密集方形點陣118環(huán)繞的孔的內(nèi)部密集方形點陣116?；氐綀D1C，鄰近的內(nèi)部點陣孔110之間的距離D可以從大約2μπι變化到大約SMffl，并且鄰近的外部點陣孔之間的距離可以從大約5Mm變化到大約15ΜΠ1。孔110的直徑d可以從大約50nm變化到大約190nm。注意孔的直徑可以選擇成小于顯微鏡的衍射極限，其是大約 λ/2，其中λ是光的波長。例如，在校準裝置100的一個實施例中，孔110可具有大約IOOnm的直徑，帶有5Mm的內(nèi)部點陣距離和大約IOMm的外部點陣距離。大約IOOnm的直徑完全在可見光光學顯微鏡方法的衍射極限以下,該可見光光學顯微鏡方法具有大約200nm的分辨率極限。校準裝置100可以通過首先在透明板的表面上沉積粘合劑層來制造。該粘合劑可以通過將粘合劑噴射或刷到表面上而沉積。在沉積粘合劑層后，沉積不透明層。如果不透明層是金屬或半導體，不透明層可以使用等離子體或化學氣相沉積或晶片接合而沉積?？卓梢允褂镁劢闺x子束刻蝕在不透明和粘合劑層中形成，來產(chǎn)生具有大致上直的圓柱壁的孔。在備選實施例中，特征108可以是設置在不透明層102上的珠子。這些珠子具有直徑d并且可以是反射珠或熒光珠，其當暴露于特定波長的光時發(fā)熒光。與下文描述的圖像處理組合的校準裝置100可以產(chǎn)生在衍射極限以下的樣品的微觀要素的圖像。例如，考慮諸如顯微鏡的典型的衍射限制光學系統(tǒng)，其可以僅收集入射波陣面的一部分以改造成像面中的圖像。通過光學系統(tǒng)的光偏離直線傳播并且在像面中稍微分散開。當具有圓孔的光學系統(tǒng)接收從物面中的點源輸出的平面波時，光實際上分散成叫做由暈環(huán)環(huán)繞的艾里斑的微小圓形斑點，而不是在像面中存在對應的像點。該艾里斑的半徑確定相鄰圖像的重疊，并且因此確定分辨率。圖2示出光學系統(tǒng)202，其接收從物面206中的點源(X，y)204輸出的光并且將光分散開以在對應的像面210中產(chǎn)生斑點208。從點源204輸出的光具有輻照度I (X，y)，并且由光學系統(tǒng)202變換成以點(X’，y’)212為中心的斑點208，其具有在斑點208之上由對稱點擴散函數(shù)214表示的對應輻照度。例如，用于表示例如斑點208的斑點之上的輻照度分布的合適的點擴散函數(shù)可以是艾里函數(shù)。圖3A示出像面內(nèi)一維中理論點擴散函數(shù)的一示例表示。水平軸302是通過例如圖2中示出的點212的像面中的點(X’，y’)的像面中的線。理論點擴散函數(shù)具有高而相對窄的中央峰304，帶有在遠離該中央峰的兩個方向上延伸的高度減少的二次峰305-314。曲線的高度對應于強度并且水平軸302對應于在輸出-像面中離起點的直線距離。圖3B提供點擴散函數(shù)在三維空間中的表示，其中兩個水平軸316和318位于像面的平面中并且在點(X’，I，)相交，并且在點擴散函數(shù)的表面上任意點處的高度對應于在像面上的對應位置處觀察到的強度。由光學系統(tǒng)產(chǎn)生的脈沖響應函數(shù)的圖像表現(xiàn)為中央亮斑(對應于點擴散函數(shù)的中央峰)，其具有對應于環(huán)繞中央峰的環(huán)或脊的半徑增加的同心環(huán)。圖4示出與光學系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的衍射極限。考慮在物面中按距離S1 406分開的兩個點(X1, 和(x2, y2>404O從光學系統(tǒng)輸出的這兩個點的圖像是中心在像點(X’D y')和(x’2，y’2)的兩個點擴散函數(shù)408和410。光從點源402和404擴散成在像面中具有由點擴散函數(shù)408和410表示的輻照度分布的斑點，這是衍射有關(guān)的現(xiàn)象。當S1足夠大使像面中點擴散函數(shù)408和410的中心之間的對應距離s’ , 412分開點擴散函數(shù)，使得兩個點擴散函數(shù)的總和(在圖4中由曲線414表示)仍然是明顯雙峰時，像面中的點402和404的圖像可以彼此分辨。然而，當物面中的兩個點416和418按足夠小的距離S2 420分開使像面中的兩個點422和424的對應圖像重疊，在兩個點擴散函數(shù)的總和(由曲線426表示)合并成單個峰的情況下，兩個點416和418在像面中不能彼此分辨。傳統(tǒng)光學顯微鏡方法的最小間距或最大分辨率一般認作:
其中 Θ是可以進入或離開光學系統(tǒng)的光的最大圓錐的半角； λ是光的波長；
η是光學系統(tǒng)在其中操作的介質(zhì)的折射率；并且 NA是顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑。輸入圖像中的最小間距或最大分辨率對應于右側(cè)點擴散函數(shù)的第一左側(cè)零點與左側(cè)點擴散函數(shù)的第一側(cè)手零點在其處重合的點擴散函數(shù)之間的間距?？梢猿上竦奶卣鞯淖钚》指艋蜃畲蠓直媛蕦τ诠鈱W顯微鏡方法系統(tǒng)對應于大約200nm。因為點源在像面中的點擴散函數(shù)圖像由于衍射的結(jié)果出現(xiàn)，最小間距或最大分辨率稱為“衍射極限”。參照圖4討論的衍射極限不是使用光學顯微鏡方法獲得的樣品圖像的絕對分辨率極限。在衍射極限以下獲得的校準靶100的放大圖像可以使用各種成像技術(shù)處理來獲得圖像處理校準參數(shù)，其可以進而用于調(diào)節(jié)具有也在衍射極限以下的放大分辨率的樣品圖像?，F(xiàn)在提供參照圖5-11校準靶100如何可以用于確定一組校準參數(shù)的描述，所述一組校準參數(shù)可以用于調(diào)節(jié)具有在衍射極限以下的放大分辨率的樣品圖像。圖5示出固定到顯微鏡載玻片502的表面的校準裝置100。在圖5中，安置校準裝置100使得不透明表面102面向載玻片502的表面504。具有大致上匹配載玻片502和透明板104的折射率的折射率的光學凝膠506設置在不透明表面102和載玻片502的表面504之間。例如，透明板104和載玻片502可以用具有1.52的折射率的玻璃構(gòu)成，并且光學凝膠506可以用也具有1.52的折射率的材料構(gòu)成。圖6示出使用位于沿校準裝置100的邊緣的粘合劑602附連到載玻片502的表面的校準裝置100的橫截面視圖。該粘合劑602可以是例如甲苯磺酰胺-甲醛樹脂的聚合物粘合劑，其可以粘附到拋光表面，例如載玻片502的拋光表面。
載玻片502和校準裝置100然后放置在顯微鏡臺上，其中校準裝置100面向顯微鏡物鏡，并且載玻片502面向顯微鏡光源。圖7不出安置用于用光學顯微鏡的顯微鏡物鏡702觀察的具有附連的校準裝置100的載玻片502的橫截面視圖。在圖7中，浸油704設置在透明板104和物鏡702之間。該浸油704具有大致上匹配透明板104和載玻片502的折射率的折射率。光706從位于物鏡702對面的照明源輸出。該光706通過載玻片502和校準靶106。如在圖7中示出的，物鏡702安置使得通過校準靶106的至少一部分的光落在由虛線708和710限定的物鏡的視場內(nèi)。圖7不意在限制校準裝置100與油浸物鏡的使用。校準裝置100可以與其他類型的顯微鏡物鏡一起使用，例如在空氣介質(zhì)中工作的物鏡和在水介質(zhì)中工作的物鏡。校準裝置100可以與許多不同種類的光源一起使用。例如，適合的光源包括白熾燈、鹵素照明器或發(fā)射在可見光譜中波長的寬范圍上的光的任何源。其他的適合光源包括發(fā)射在可見光譜中窄的波長段上的光的發(fā)光二極管(“LED”)和激光器，例如可見光譜的藍色、綠色或紅色段。圖8A示出顯微鏡內(nèi)的光學路徑，該顯微鏡具有發(fā)射在可見光譜中波長的寬范圍上的光的光源，例如鹵素照明器。有許多不同類型的顯微鏡和對應的光學路徑。圖8A不意在表示顯微鏡的所有不同的眾所周知的變化內(nèi)的光學路徑，圖8A也不表示顯微鏡的所有各種組件。圖8A意在示出如應用于顯微鏡成像的顯微鏡方法的一般原理，其使用校準裝置100來獲得可以用于處理在衍射極限以下拍攝的樣品圖像的圖像處理參數(shù)。在圖8A中，載玻片502和校準裝置100設置在臺802上，其中透明板104面向顯微鏡物鏡804，并且光源806安置在載玻片502對面。點線方向箭頭808表示從光源806發(fā)射的光。光源806可以是白熾燈、鹵素照明器或發(fā)射在可見光譜中波長的寬范圍上的光的任何光源。從光源802發(fā)射的光通過載玻片502和校準裝置100。較低放大倍率物鏡可以用于定位板100的方向箭頭108 (在圖1中示出)以便將校準靶106的至少一部分沿顯微鏡物鏡的光軸放置。選擇較高放大倍率物鏡804，并且物鏡804和/或臺802安置在z_方向810上來獲得校準靶106的子區(qū)的放大圖像。如上文參照圖1描述的，構(gòu)成校準靶106的孔的直徑(例如， IOOnm)小于從光源806發(fā)射的可見光的波長(即，從大約380nm至大約750nm的可見光范圍)并且小于衍射極限(S卩廣200nm)。通過校準靶106中的每個孔的光輸出為窄光束，其在該束進入物鏡804時分散開。從校準靶106中的孔輸出的每個光束由物鏡804收集并且經(jīng)歷由于物鏡804的色差和衍射極限引起的畸變。結(jié)果，從校準靶106中的孔輸出的每個光束分成發(fā)散的有不同顏色的束，其包括從該孔輸出的束的光譜。色差是其中透鏡不能將通過該透鏡的光的波長中的全部聚焦到相同會聚點的光學畸變類型。色差由對于光的不同波長具有不同折射率的透鏡引起。典型的物鏡包括膜或透鏡涂層，其提供對色差的一些校正。圖8B示出從校準靶106的子區(qū)811中的孔輸出的白光束的一示例。該子區(qū)811在圖1B中由虛線界限120標示，并且表示落入物鏡804的視場內(nèi)的校準靶106的一示例部分。在圖8B的示例中，物鏡804 (在圖8A中示出)由塊表示，并且方向箭頭812表示從子區(qū)811中的孔814輸出的光束的方向。當光束812通過物鏡804時，構(gòu)成物鏡804的透鏡形成色差，其將束812分成有不同顏色的束，其中每個束從束812的原始路徑發(fā)散，并且每個束是構(gòu)成束812的光的色譜中的不同顏色分量。例如，不同圖案的方向箭頭816-818剛好表示束812的藍色、綠色和紅色分量束。由于物鏡804的色差和衍射極限，有不同顏色的束816-818從束812的路徑發(fā)散?；氐綀D8A，顯微鏡包括三個二向色鏡820-822，其配置成將可見光譜中的藍色、綠色和紅色波長范圍反射到對應檢測器824-826，其連接到例如下文參照圖17描述的計算機系統(tǒng)的計算機系統(tǒng)827以用于圖像處理。方向箭頭828-830表示特定放大倍率的子區(qū)811的圖像的藍色、綠色和紅色分量。二向色鏡820使在紅色和綠色波長范圍中的光通過并且將藍色波長范圍中的光反射到檢測器824的像面；二向色鏡821使在紅色波長范圍中的光通過并且將綠色波長范圍中的光反射到檢測器825的像面；并且二向色鏡822將紅色波長范圍中的光反射到檢測器826的像面。結(jié)果，檢測器824捕捉子區(qū)811的圖像的藍色分量，檢測器825捕捉子區(qū)811的圖像的綠色分量，并且檢測器826捕捉子區(qū)811的圖像的紅色分量。這三個單獨的圖像是從孔輸出的光的藍色、綠色和紅色分量的藍色、綠色和紅色圖像，對相同的放大倍率捕捉并且發(fā)送給計算機系統(tǒng)827以用于圖像處理。三個單獨的藍色、綠色和紅色圖像可以同時或在不同的時間對相同的放大倍率捕捉。例如，如果圖像要在不同的時間對相同的放大倍率捕捉，那么每次僅使用二向色鏡和對應檢測器中的一個來捕捉對應的顏色圖像。因為物鏡804引起從校準靶106中的孔輸出的光束分成發(fā)散的顏色分量，如上文關(guān)于圖8B描述的，在單獨的藍色、綠色和紅色圖像中表示的孔沒有對齊。圖SC示出在圖SB中示出的子區(qū)811的三個單獨的藍色、綠色和紅色圖像的一示例表示。如上文參照圖SB描述的，物鏡804引起從每個孔輸出的光束分成單獨的發(fā)散的有色光束。在圖SC的示例表示中，藍色、綠色和紅色圖像831-833表示如上文參照圖8A描述的由檢測器824-826對校準靶106的特定放大倍率捕捉的圖像。因為對應的有色束發(fā)散，單獨圖像831-833中的斑點沒有對齊。例如，如在圖8C中示出的，方向箭頭834表示從孔814輸出的光束812的路徑，并且虛線圓圈835-837表示光束812的圖像將位于圖像831-832中的每個中的地方。然而，由于物鏡804的色差和衍射極限，產(chǎn)生在三個單獨的藍色、綠色和紅色分量圖像中的斑點。從孔814輸出的光的藍色分量由藍色圖像831中的藍色斑點840表示，從孔814輸出的光的綠色分量由綠色斑點841表示，并且從孔814輸出的光的紅色分量由紅色圖像833中的紅色斑點842表示。三個圖像831-833由處理器328求和來產(chǎn)生組合的原像844。該原像844是對特定放大倍率的從子區(qū)811的孔輸出的每個光束的剛好藍色、綠色和紅色分量的單個圖像。例如，虛線圓圈846表示從孔814輸出的光將在圖像844中出現(xiàn)的斑點，但由于物鏡804的色差和衍射極限，從孔814輸出的光分成分量顏色，其具有在圖像844中表示為藍色、綠色和紅色斑點840-842的分量顏色中的剛好三個。盡管藍色、綠色和紅色斑點在單獨的圖像831-833中沒有對齊，每個斑點是對特定放大倍率的從對應孔輸出的光的顏色分量的聚焦和無畸變圖像。例如，圖像831-833中的藍色、綠色和紅色斑點840-842各自是束812的剛好藍色、綠色和紅色分量的聚焦和無畸變的單獨圖像。如上文描述的，校準裝置可以與使用由LED和/或激光器的組合構(gòu)成的光源的顯微鏡一起使用，其中每個LED或激光器發(fā)射在可見光譜的不同窄波長范圍中的光。圖8D示出具有由單獨的藍色、綠色和紅色光源構(gòu)成的光源850的顯微鏡的一示例。在圖8D中示出的顯微鏡與上文參照圖8A描述的顯微鏡相似，除了三個二向色鏡820-822由部分鍍銀鏡851、半鍍銀鏡852、鏡853和對應的藍色、綠色和紅色濾光器855-857代替。源850輸出在可見光譜的窄藍色、綠色和紅色波長段中的光，其通過校準板100的校準靶中的每個孔，并且由物鏡804收集和聚焦，如參照圖8A和8B描述的。部分鍍銀鏡851將從物鏡804輸出的光的近似1/3朝濾光器855反射，其僅使窄藍色波長段中的光通過，而光的近似2/3通過鏡851到半鍍銀鏡852。鏡852將透射通過鏡851的光的近似一半朝濾光器856反射，其僅使窄綠色段通過。透射通過鏡852的光由鏡853朝濾光器857反射，其僅使窄紅色段中的光通過。檢測器824-826捕捉子區(qū)811的藍色、綠色和紅色圖像，如上文參照圖8A和SC描述的。在圖8A-8D的示例中，因為藍色、綠色和紅色分量是可以用不同輻照度組合來生成多種不同顏色圖像的原色，使用從物鏡804輸出的光的藍色、綠色和紅色分量。備選地，可以使用生成、反射和透射除藍色、綠色和紅色外的顏色的其他類型的光源、二向色鏡和濾光器，來捕捉從物鏡輸出的光的不同顏色分量圖像。顯微鏡常常用于將樣品和顯微鏡物鏡之間的一系列物面成像。該操作可以用于產(chǎn)生一組像面，其一起表示由物鏡形成的圖像的三維圖像空間。圖9A示出與校準靶106的子區(qū)811關(guān)聯(lián)的一系列原像901-908的一示例表示。這些原像901-908中的每個使用子區(qū)811的不同聚焦獲得，并且這些原像901-908形成從子區(qū)811中的孔的每個輸出的分量光束的三維圖像空間。方向箭頭910和911 (指示為X-和y_軸)表示子區(qū)811的平面，并且方向箭頭914表示原像901-908在子區(qū)域811上的升高，其中每個原像與子區(qū)811的不同物面關(guān)聯(lián)。圖像空間展現(xiàn)物鏡804將從子區(qū)811中的每個孔輸出的光的藍色、綠色和紅色光分量聚焦在哪里。圖9B示出使用物鏡804形成的圖像空間中的區(qū)916 (在圖9A中示出)的假設透視圖。斑點918-920表示從子區(qū)811中的孔輸出的單個光束的單獨藍色、綠色和紅色分量的單獨藍色、綠色和紅色焦點。斑點918-920表示物鏡804如何將藍色、綠色和紅色分量聚焦成中心在與物鏡804關(guān)聯(lián)的三維圖像空間中的不同點的單獨焦點。校準靶106的原像然后可以使用各種成像技術(shù)處理來獲得校準圖像和關(guān)聯(lián)的圖像校準參數(shù)，其可以進而用于處理具有在衍射極限以下的放大分辨率的樣品圖像。可以用于獲得校準參數(shù)的適合的顯微鏡成像技術(shù)的一示例是在2010年3月31日提交并且由Applied Precision有限公司(GE Healthcare公司)所有的美國專利申請12/751，816中描述的密集隨機采樣成像(“DSSI”)，其通過引用結(jié)合于此。因為DSSI的細節(jié)在12/751,816專利申請中描述，現(xiàn)在提供如應用于校準靶100的原像的使用DSSI獲得的圖像校準參數(shù)的概觀。圖10示出圖像校準如何可以用于校正物鏡的色差和衍射極限的一假設示例。在圖10中，圖像1002表示子區(qū)811的特定放大倍率的原像，其如上文描述的參照圖8獲得。不同陰影化斑點的每個三元組表示對特定放大倍率的物鏡804的藍色、綠色和紅色斑點。例如，圖10包括藍色、綠色和紅色斑點1006-1008的放大視圖。藍色、綠色和紅色斑點1006-1008表示從子區(qū)811中的孔輸出的單個光束的藍色、綠色和紅色分量顏色的圖像。盡管物鏡804的色差和衍射極限引起從校準靶中的孔輸出的每個光束分成顏色分量束，與顏色分量關(guān)聯(lián)的每個斑點是從孔輸出的光的該顏色分量的放大、聚焦并且無畸變的圖像。例如，藍色、綠色和紅色斑點1006-1008各自是對特定放大倍率的從子區(qū)811中的對應孔輸出的光的藍色、綠色和紅色分量的放大、聚焦并且無畸變的圖像。由于物鏡804的色差和衍射極限，這三個單獨的分量放置在由圖像1002表示的像面中的不同空間位點中。圖像校準調(diào)節(jié)圖像1002的空間參數(shù)，以便將與從每個孔輸出的光關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點組合來產(chǎn)生子區(qū)811的校準圖像1010。校準圖像1010表示子區(qū)811的放大圖像，其中例如斑點1012的每個斑點表示從子區(qū)811中的每個孔輸出的光的放大、聚焦并且無畸變的圖像。圖像1010中的每個斑點可以使用DSSI組合原像1002中的對應顏色分量斑點而生成。例如，圖10包括斑點1012的放大1014，其在校準圖像1010中表現(xiàn)為無畸變的白斑并且通過組合藍色、綠色和紅色斑點1006-1008產(chǎn)生。也就是說，原像1002中的每組顏色分量斑點被組合以產(chǎn)生校準圖像1010中的單個斑點，其中校準圖像1010中的每個斑點顯得焦點對準(即，沒有由于物鏡804的色差和衍射極限引起的畸變)，即使校準圖像1010中的斑點是從具有在物鏡804的衍射極限以下的直徑的孔輸出的光的放大視圖。圖11A-11D示出被調(diào)節(jié)以便從原像1002產(chǎn)生校準圖像1010的校準參數(shù)的圖形表示。校準包括圖像平移、圖像旋轉(zhuǎn)、放大和非線性幾何畸變的組合，其進而用于組合與子區(qū)811中的每個孔關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點。圖1lA示出校準如何組合與三個單獨的藍色、綠色和紅色圖像關(guān)聯(lián)的藍色、綠色和紅色斑點1101-1103來形成單個聚焦的無畸變斑點1104的一示例標示，該單個聚焦的無畸變斑點1104表示透射通過校準裝置100中的孔的光的圖像。如在圖1lA中示出的，斑點1101-1103具有分別由高斯分布1105-1107表示的強度輪廓。校準是使用平移、旋轉(zhuǎn)、放大和幾何畸變來調(diào)節(jié)強度峰的坐標和大小的過程，使得強度峰對齊來產(chǎn)生具有關(guān)聯(lián)的強度輪廓1108的斑點1104。圖11B-11C示出關(guān)于由X、Y和Z坐標表征的三維笛卡爾坐標參考系的圖像平移和旋轉(zhuǎn)的示例。圖1lB表示將單獨的原像藍色、綠色和紅色分量圖像1110-1112中的每個在參考系內(nèi)平移來對齊與校準靶中的相同孔關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點的一示例。例如方向箭頭1114-1116的方向箭頭表示顏色分量圖像中的每個可以在參考系中平移的三個不同方向。圖1lC表示將單獨的原像藍色、綠色和紅色分量圖像1110-1112中的每個關(guān)于參考系坐標旋轉(zhuǎn)來進一步對齊與相同孔關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點的一示例。方向箭頭1118-1120表示與像面1110關(guān)聯(lián)的正交x、y和z局部坐標，它們已經(jīng)相對于參考系旋轉(zhuǎn)來進一步對齊與相同孔關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點。非線性幾何畸變是數(shù)字圖像處理技術(shù)，其中數(shù)字操作顏色分量圖像的部分來進一步對齊與相同孔關(guān)聯(lián)的顏色分量斑點。在圖1lD的示例中，圖像1110-1112的三個重疊子區(qū)1122-1124的非線性畸變被畸變以對齊與相同孔關(guān)聯(lián)的斑點并且可以是焦深依賴的。例如，子區(qū)1122-1124的平移、旋轉(zhuǎn)、放大倍率調(diào)節(jié)和畸變對齊與相同孔關(guān)聯(lián)的斑點1125-1127。形成三維圖像空間的原像可以平移、旋轉(zhuǎn)和局部翹曲來將顏色分量的焦點偏移到共同焦點。圖12示出在圖9B中示出的區(qū)916的假設透視圖。校準可以用于將藍色、綠色和紅色焦點918-920偏移到單個焦點1202，其對應于在沒有由物鏡804的色差和衍射極限引起的畸變的情況下從子區(qū)811中的孔輸出的光束的焦點。在備選實施例中，校準裝置可以包括任何數(shù)量的校準靶，對于每個校準靶具有變化的或相同的特征，而不是將校準裝置限制于僅一個校準。圖13示出具有六個單獨校準靶1301-1306的光學顯微鏡校準裝置1300。校準靶的每個鄰近對由例如隔離裝置1308的隔離裝置分開，該隔離裝置涂在裝置1300的不透明層1310上或蝕刻到裝置1300的不透明層1310中。校準靶1301-1306可以具有特征尺寸，或者校準靶1301-1306可以具有特征尺寸的任意組合。例如,校準靶1301-1303可以由具有大約90nm直徑的不透明層1310中的孔構(gòu)成，而校準靶1304-1306可以由具有大約IlOnm的直徑的孔構(gòu)成。也可以在蓋玻片中形成一個或多個校準裝置以能夠?qū)崿F(xiàn)校準參數(shù)的確定，之后通過簡單地將樣品滑入顯微鏡物鏡的視場而將樣品在衍射極限以下成像并且使用校準參數(shù)來處理樣品的圖像。圖14A-14B示出具有在蓋玻片的一部分中形成的校準裝置1402的蓋玻片1400的立體圖和俯視圖。校準裝置1402包括校準靶1406和方向箭頭1408，其采用與上文描述的校準裝置100相同的方式配置，但與包括透明板104的校準裝置100不同，校準裝置1402包括相對更大的透明板1404。板1404的第一區(qū)專用于校準裝置1402，并且板1404的第二區(qū)1410不覆蓋來收容樣品。校準裝置1402采用與校準裝置100相同的方式使用，但蓋玻片1400的剩余未覆蓋區(qū)1410可以放置在要使用顯微鏡觀察的樣品上。圖15A示出要固定到顯微鏡載玻片1502的表面的校準裝置1402和蓋玻片1404。在圖15A中，安置校準裝置1402使得校準裝置1402的不透明表面面向載玻片1502的表面1504。具有大致上匹配載玻片1502和蓋玻片1404的折射率的折射率的光學凝膠1506設置在不透明表面和表面1504之間，并且樣品1508放置在蓋玻片1404的未覆蓋區(qū)1410上。圖15B示出附連到載玻片1502的表面1504的蓋玻片沿圖15A中示出的線I1-1I的橫截面視圖。可以使用位于沿蓋玻片1400的邊緣的粘合劑1510來將蓋玻片1400固定到載玻片1502。該粘合劑1510可以是例如甲苯磺酰胺-甲醛樹脂的聚合物粘合劑，其可以粘附到拋光表面，例如拋光表面1504。圖16示出獲得衍射極限以下的樣品圖像的方法的流程圖。在框1601中，校準靶如上文參照圖8A和8D描述的使用光源照射。在框1602中，從校準靶的子區(qū)輸出的光如上文參照圖8A和8D描述的使用顯微鏡物鏡收集。在框1603中，生成從物鏡輸出的光的某些顏色分量的靶的單獨顏色圖像，如上文參照圖8A和8C描述的。在框1604中，單獨的顏色圖像被組合來形成原像，如上文參照圖8C描述的。在框1605中，生成使用例如DSSI的視頻處理基于原像的校準圖像。存儲用于調(diào)節(jié)校準靶的原像(例如原像1002)來產(chǎn)生校準靶的校準圖像(例如校準圖像1010)的放大倍率和圖像校準參數(shù)。保存校準靶的圖像放大倍率和關(guān)聯(lián)的校準參數(shù)使得當實際樣品使用特定的放大倍率成像時，關(guān)聯(lián)的校準參數(shù)可以用于調(diào)節(jié)樣品的衍射限制的圖像。圖17示出執(zhí)行DSSI或另一個適合的圖像處理方法的圖像處理步驟的典型電子計算機系統(tǒng)。該計算機系統(tǒng)包含一個或多個中央處理單元(“CPU”)1702-1705、通過CPU/存儲器子系統(tǒng)總線1710或多個總線與CPU互連的一個或多個電子存儲器1708、將CPU/存儲器子系統(tǒng)總線1710與另外的總線1714和1716互連的第一橋1712、或其他類型的高速互連介質(zhì)，包括多個高速串行互連。這些總線或串行互連進而將CPU和存儲器與例如圖形處理器1718的專用處理器連接，并且與一個或多個另外的橋1720連接，所述橋與高速串行鏈路或與例如控制器1727的多個控制器1722-1727互連，其提供對各種不同類型的計算機可讀介質(zhì)的訪問，例如計算機可讀介質(zhì)1728、電子顯示器、輸入裝置和其他這樣的組件、子組件和計算資源。計算機可讀介質(zhì)1728可以是參與向CPU提供指令以用于執(zhí)行的任何適合的介質(zhì)。例如，計算機可讀介質(zhì)1728可以是非易失性介質(zhì)，例如固件、光盤、閃速存儲器、磁盤或磁盤驅(qū)動器。圖像處理也可在分布式計算機系統(tǒng)上實現(xiàn)并且也可以部分在硬件邏輯電路中實現(xiàn)。前面的描述為了解釋的目的使用特定命名法來提供本公開的全面理解。然而，為了實踐本文描述的系統(tǒng)和方法而不需要特定細節(jié)，這對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將是明顯的。為了圖示和描述的目的呈現(xiàn)特定示例的前面的描述。它們不意為詳盡的或?qū)⒈竟_限于描述的確切形式。明顯地，鑒于上文的教導許多修改和變化是可能的。示出并且描述這些示例以便最好地解釋本公開的原理和實際應用，由此使本領(lǐng)域內(nèi)其他技術(shù)人員能夠最好地利用本公開和具有如適合于預想的特定使用的各種修改的各種示例。意圖是本公開的范圍由隨附權(quán)利要求和它們的等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種校準裝置，包括: 至少一個校準靶，其中每個校準靶包括具有小于顯微鏡物鏡的衍射極限的尺寸的多個特征，所述顯微鏡物鏡用于將所述至少一個校準靶的子區(qū)成像。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，進一步包括: 透明板；以及 附連到所述透明板的表面的不透明層，所述不透明層包括所述至少一個校準靶。
3.如權(quán)利要求2所述的裝置，進一步包括設置在所述不透明層和所述透明層的第一表面之間來將所述不透明層附連到所述表面的粘合劑。
4.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括暴露所述表面的所述不透明層中的孔。
5.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括所述不透明層中的熒光珠。
6.如權(quán)利要求2所述的裝置，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括所述不透明層中的反射珠。
7.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，具有小于所述衍射極限的尺寸的所述特征進一步包括每個特征具有小于所述顯微鏡物鏡的所述衍射極限的直徑。
8.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一個校準靶的光的波長的直徑。
9.一種顯微鏡蓋玻片,包括: 包含第一部分和第二部分的透明板； 設置在所述第一部分上的不透明層；以及 在所述不透明層中形成的至少一個校準靶，其中每個校準靶包括具有小于顯微鏡物鏡的衍射極限的尺寸的多個特征，所述顯微鏡物鏡用于將設置在所述第二部分與載玻片之間的樣品和所述至少一個校準靶成像。
10.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，進一步包括設置在所述蓋玻片和所述不透明層之間以將所述不透明層附連到所述表面的粘合劑。
11.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括暴露所述表面的所述不透明層中的孔。
12.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括所述不透明層中的熒光珠。
13.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，其中，所述至少一個校準靶的所述特征進一步包括所述不透明層中的反射珠。
14.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，其中，具有小于所述衍射極限的尺寸的所述特征進一步包括每個特征具有小于所述顯微鏡物鏡的所述衍射極限的直徑。
15.如權(quán)利要求9所述的蓋玻片，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一個校準靶的光的波長的直徑。
16.一種用于校準 衍射-限制的顯微鏡圖像的方法，所述方法包括: 照射校準靶，其包括具有小于顯微鏡物鏡的衍射極限的尺寸的多個特征； 使用所述物鏡收集從所述校準靶的子區(qū)輸出的光，所述物鏡將從每個特征輸出的所述光分成顏色分量； 生成對某些顏色分量的單獨顏色圖像，每個顏色圖像表示所述靶的不同顏色圖像； 組合所述單獨顏色圖像以形成所述子區(qū)的原像；以及 基于所述原像生成校準圖像，所述校準圖像示出所述子區(qū)的聚焦并且無畸變的特征。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述校準靶進一步包括: 透明板；以及 附連到所述透明板的表面的至少一部分的不透明層，所述不透明層包括所述校準靶。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，照射所述校準靶進一步包括用光源照射所述校準靶，所述光源發(fā)射在與可見光譜中的不同顏色關(guān)聯(lián)的多個波長范圍上的光。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，照射所述校準靶進一步包括用多個光源照射所述校準靶，每個光源發(fā)射在與可見光譜中的不同顏色關(guān)聯(lián)的波長范圍上的光。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，生成對某些分量的單獨顏色圖像進一步包括將每個顏色分量分別弓I導到檢測器的像面，同時使其他顏色分量通過。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，生成對某些分量的單獨顏色圖像進一步包括將所述單獨顏色圖像存儲在計算機可讀介質(zhì)中。
22.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，基于所述原像生成所述校準圖像進一步包括對所述單獨顏色圖像執(zhí)行圖像平移、圖像旋轉(zhuǎn)、放大和非線性幾何畸變以獲得所述校準圖像。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，進一步包括將與以下關(guān)聯(lián)的參數(shù)數(shù)據(jù)存儲在計算機可讀介質(zhì)中:圖像平移、圖像旋轉(zhuǎn)、放大和非線性幾何畸變，其與所述單獨顏色圖像關(guān)聯(lián)。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，具有小于所述衍射極限的尺寸的所述特征進一步包括每個特征具有小于所述顯微鏡物鏡的所述衍射極限的直徑。
25.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述特征具有小于用于照射所述至少一個校準靶的光的波長的直徑。
全文摘要
該公開針對光學顯微鏡校準裝置，其可以與光學顯微鏡一起使用來調(diào)節(jié)顯微鏡成像參數(shù)使得樣品的圖像可以在衍射極限以下獲得。這些顯微鏡校準裝置包括至少一個校準靶。每個校準靶包括具有顯微鏡物鏡的衍射極限以下的尺寸的多個特征。對特定放大倍率獲得校準靶中的一個的單獨顏色分量衍射限制的圖像。這些顏色分量圖像可以被組合并且圖像處理來獲得校準靶的聚焦并且無畸變的圖像。用于獲得校準靶的該聚焦并且無畸變的圖像的參數(shù)可以用于通過使用相同的參數(shù)獲得對相同放大倍率的樣品的聚焦并且無畸變的圖像。
文檔編號G02B21/34GK103119496SQ201180046755
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者P.C.古德溫 申請人:應用精密公司