專利名稱：左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及建立疾病的動(dòng)物模型，可用于肺鱗癌的病因、發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移規(guī)律和新藥物的藥理作用、療效及副作用等方面的研究。
背景技術(shù)：
肺癌是嚴(yán)重危害人類生命的常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)，盡管過去數(shù)十年里對(duì)肺癌的研究取得了很大進(jìn)展，但早期診斷和治療的手段仍十分有限，其主要原因之一是缺乏合適的動(dòng)物模型作為研究對(duì)象，難以進(jìn)行系列的深入研究。因而為了深入研究肺癌的病因、發(fā)病機(jī)制、轉(zhuǎn)移規(guī)律和治療方法，需要建立合適的動(dòng)物肺癌模型。
現(xiàn)有建立動(dòng)物肺癌模型的方法有(1)從自然發(fā)生的綿羊肺腺瘤病的基因組DNA庫中分離全長的綿羊肺腺瘤病逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，通過氣管內(nèi)接種體內(nèi)轉(zhuǎn)染新生綿羊，可誘發(fā)與人類的細(xì)支氣管肺泡癌類似的綿羊肺腺瘤病，該方法的不足之處在于技術(shù)難度大、操作復(fù)雜。參考文獻(xiàn)Palmarini M，et al.Jaagsiekte sheep retro virus isnecessary and sufficient to induce a contagious lung cancer insheep(綿羊肺腺瘤病逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生綿羊傳染性肺癌).JVirol，1999，73(8)6964。(2)用一種新的基因靶向方法建立攜帶K-ras等位癌基因的小鼠品系，該品系小鼠可以通過自然重組過程隨機(jī)產(chǎn)生活化的K-ras突變基因而對(duì)許多腫瘤有高易感性，尤其是早期發(fā)生肺癌，該方法的不足之處也在于技術(shù)要求高、難度大、操作復(fù)雜。參考文獻(xiàn)Johnson L，et al.Somatic activation of the K-rasoncogene causes early onset lung cancer in mice(K-ras癌基因活化引起小鼠早期肺癌發(fā)生).Nature，2001，410(6832)1111。(3)經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)或經(jīng)皮將新鮮的犬科動(dòng)物腫瘤細(xì)胞接種至狗的肺內(nèi)，并使用環(huán)孢菌素抑制免疫，6-10周后肺內(nèi)有肉眼可見的散在腫瘤結(jié)節(jié)，該方法的不足之處在于其發(fā)生過程與人類差異太大。參考文獻(xiàn)AhrarK，et al.Development of a large animal model for lung tumors(大動(dòng)物肺癌模型的建立).J Vasc Interv Radiol，2002，13(9 Pt1)923。(4)采用煤焦瀝青(CPT)經(jīng)支氣管灌注亦可誘發(fā)肺癌，該方法的不足之處在于沒有使用碘劑，不利于觀察定位誘癌過程，而且需多次灌注，成癌時(shí)間長達(dá)6個(gè)月。參考文獻(xiàn)吳逸民等，大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展動(dòng)物模型的構(gòu)建，河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35(3)232。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，該方法通過用甲基膽蒽與二乙基亞硝胺溶解在碘油中配制成致癌質(zhì)碘油溶液，對(duì)Wistar大鼠左肺葉下部支氣管灌注，定位誘發(fā)大鼠肺鱗癌。本發(fā)明能在肺內(nèi)定位、定點(diǎn)誘發(fā)肺鱗癌，癌發(fā)生階段明顯，與人類肺鱗癌相似，誘癌率高，誘癌時(shí)間短，可重復(fù)性強(qiáng)，大鼠帶瘤生存期長，易于后續(xù)研究，且方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)，易推廣。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下列步驟(1)致癌質(zhì)碘油為每毫升罌粟子之碘化脂酸乙脂含100毫克甲基膽蒽與0.1毫升二乙基亞硝胺的溶液，將配好的溶液置于70～75℃溫箱中12～24小時(shí)；(2)選取體重180～220克、鼠齡3～6月Wistar大鼠，雌雄各半；(3)灌注前2天至灌注后5天，每只大鼠每天肌肉注射青霉素2萬單位、鏈霉素50毫克；(4)基礎(chǔ)麻醉采用鹽酸氯胺酮，用量為每公斤體重20毫克，當(dāng)大鼠出現(xiàn)早期麻醉狀態(tài)時(shí)，再用乙醚吸入麻醉；(5)將麻醉狀態(tài)的大鼠上頜門齒掛于操作臺(tái)固定線上，在大鼠左肺葉下部支氣管內(nèi)注入0.1毫升的致癌質(zhì)碘油；(6)注入致癌質(zhì)碘油第2天攝片檢查，保留左肺下部可見碘油的大鼠。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)誘發(fā)的肺癌均為肺鱗癌，多數(shù)為高分化，少數(shù)為低分化，用常規(guī)病理切片技術(shù)可觀察到肺鱗癌形成的全過程，包括細(xì)支氣管上皮增生、鱗狀上皮化生、不典型增生等癌前病變、原位鱗癌、早期浸潤鱗癌、晚期浸潤鱗癌及癌的擴(kuò)散(胸膜種植、肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移)等，與人類肺鱗癌相似，可用于肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的基礎(chǔ)性研究、治療肺癌新藥物的實(shí)驗(yàn)研究和肺癌新治療方法的探索研究，且誘癌時(shí)間短，最早發(fā)生肺鱗癌的時(shí)間是13天，誘癌率高達(dá)85％。
(2)大鼠左肺僅一個(gè)肺葉，供血條件較好，而右肺有四葉，其中心后葉常發(fā)生自發(fā)性肺萎陷及纖維化，血供差，故選擇左肺誘癌既有利于腫瘤形成，又有利于實(shí)驗(yàn)性抗癌治療的研究。另外，經(jīng)左肺葉下部支氣管灌注致癌質(zhì)碘油溶液，只在左肺葉局部引起肺癌，帶瘤動(dòng)物生存時(shí)間長，有利于模型建立后的研究工作。
(3)用罌粟子之碘化脂酸乙脂作溶劑溶解致癌質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)a、溶解度高，溶解效果優(yōu)于普通碘油，更優(yōu)于水，致癌質(zhì)濃度高，易通過支氣管粘膜上皮細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)促使癌變；b、在肺內(nèi)存留時(shí)間長，只用一次灌注即可成功誘癌，操作簡便；c、不易排出，不污染環(huán)境；d、因其含碘，具有脂溶劑及造影劑的雙重作用，可供X線觀察；e、微生物不易生長，可降低感染。
(4)用鹽酸氯胺酮、乙醚作麻醉劑，大鼠咽喉肌肉松弛好，支氣管腔內(nèi)分泌物少，容易灌注且更安全。
總之，本發(fā)明能在肺內(nèi)定位、定點(diǎn)誘發(fā)肺鱗癌，不引起肺外腫瘤，癌發(fā)生階段明顯，與人類肺鱗癌相似，誘癌率高，誘癌時(shí)間短，可重復(fù)性強(qiáng)，大鼠帶瘤生存期長，易于后續(xù)研究，且方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)，易推廣，是肺癌研究理想的模型。
具體實(shí)施例方式左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，包含下列步驟1、致癌質(zhì)碘油為每毫升罌粟子之碘化脂酸乙脂(Lipiodol)含100毫克甲基膽蒽與0.1毫升二乙基亞硝胺的溶液，將配好的溶液置于70～75℃溫箱中12～24小時(shí)；2、選取體重180～220克、鼠齡3～6月的Wistar大鼠，雌雄各半；3、灌注前2天至灌注后5天，每只大鼠每天肌肉注射青霉素2萬單位、鏈霉素50毫克，以預(yù)防感染；4、基礎(chǔ)麻醉采用鹽酸氯胺酮，用量為每公斤體重20毫克，當(dāng)大鼠出現(xiàn)早期麻醉狀態(tài)時(shí)，再用乙醚吸入麻醉；5、將麻醉狀態(tài)的大鼠上頜門齒掛于操作臺(tái)固定線上，操作臺(tái)與水平面成45°角，用鴨嘴鑷將大鼠的舌輕輕拉出，在額鏡直視下，當(dāng)大鼠吸氣的瞬間，將特制的鈍頭注射針插入大鼠左肺葉下部支氣管內(nèi)，注入0.1毫升的致癌質(zhì)碘油；特制的鈍頭注射針為12號(hào)腰穿針，在針尖處加焊錫，距針尖5.5厘米處向左彎曲140°～170°，距針尖1.5厘米處向背側(cè)彎曲170°～178°；6、注入致癌質(zhì)碘油的第2天攝片檢查，保留左肺下部可見碘油的大鼠，其余剔除；若動(dòng)態(tài)觀察腫瘤大小，則需多次攝片；7、注入致癌質(zhì)碘油的第3天，大鼠支氣管粘膜上皮出現(xiàn)過度增生，第5、6天出現(xiàn)鱗狀化生，第7～9天出現(xiàn)不典型增生，第13～16天出現(xiàn)早期浸潤癌，22天后可形成浸潤性鱗癌。
權(quán)利要求
1.左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，該方法包含下列步驟a、致癌質(zhì)碘油為每毫升罌粟子之碘化脂酸乙脂含100毫克甲基膽蒽與0.1毫升二乙基亞硝胺的溶液，將配好的溶液置于70～75℃溫箱中12～24小時(shí)；b、選取體重180～220克、鼠齡3～6月Wistar大鼠，雌雄各半；c、灌注前2天至灌注后5天，每只大鼠每天肌肉注射青霉素2萬單位、鏈霉素50毫克；d、基礎(chǔ)麻醉采用鹽酸氯胺酮，用量為每公斤體重20毫克，當(dāng)大鼠出現(xiàn)早期麻醉狀態(tài)時(shí)，再用乙醚吸入麻醉；e、將麻醉狀態(tài)的大鼠上頜門齒掛于操作臺(tái)固定線上，在大鼠左肺葉下部支氣管內(nèi)注入0.1毫升的致癌質(zhì)碘油；f、注入致癌質(zhì)碘油第2天攝片檢查，保留左肺下部可見碘油的大鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，其特征在于，步驟e所述的在大鼠左肺葉下部支氣管內(nèi)注入致癌質(zhì)碘油的方法為使操作臺(tái)與水平面成45°角，用鴨嘴鑷將大鼠的舌輕輕拉出，在額鏡直視下，當(dāng)大鼠吸氣的瞬間，將特制的鈍頭注射針插入大鼠左肺葉下部支氣管內(nèi)，注入致癌質(zhì)碘油。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，其特征在于，所述的特制的鈍頭注射針為12號(hào)腰穿針，在針尖處加焊錫，距針尖5.5厘米處向左彎曲140°～170°，距針尖1.5厘米處向背側(cè)彎曲170°～178°。
全文摘要
本發(fā)明公開了左肺葉支氣管灌注致癌質(zhì)碘油建立肺鱗癌大鼠模型的方法，該方法用甲基膽蒽與二乙基亞硝胺溶解在碘油中配制成致癌質(zhì)碘油溶液，對(duì)Wistar大鼠左肺葉下部支氣管灌注，定位誘發(fā)大鼠肺鱗癌。本發(fā)明在注入致癌質(zhì)碘油的第3天，大鼠支氣管粘膜上皮出現(xiàn)過度增生，第5、6天出現(xiàn)鱗狀化生，第7～9天出現(xiàn)不典型增生，第13～16天出現(xiàn)早期浸潤癌，22天后形成浸潤性鱗癌?？捎糜诜伟┌l(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究、治療肺癌新藥物的實(shí)驗(yàn)研究和肺癌新治療方法的探索研究。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)能在肺內(nèi)定位、定點(diǎn)誘發(fā)肺鱗癌，癌發(fā)生階段明顯，與人類肺鱗癌相似，誘癌率高，誘癌時(shí)間短，可重復(fù)性強(qiáng)，且方法操作簡便、經(jīng)濟(jì)，易推廣，是肺癌研究理想的模型。
文檔編號(hào)G09B23/28GK1480910SQ03128288
公開日2004年3月10日 申請(qǐng)日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者劉銘球, 田鴻生, 楊飛, 江曼, 刁路明, 魯植艷, 夏東, 張玉霞, 鄒祖玉, 葉波, 陳洪雷, 李紅鋼, 劉絢, 胡雪峰, 劉駿方, 梅列軍 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)