專利名稱：一株降解石油污染物的紅球菌jzx-01及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種紅球菌JZX-01，CGMCCNo. 5958、(Rhodococcus sp. JZX-Ol)培養(yǎng)方法及用途；他的培養(yǎng)條件以及該菌株在石油污染物降解過程中的作用。
背景技術(shù)：
在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域，石油及其衍生產(chǎn)品具有非常重要的作用。但是，石油在開采、冶煉、儲存、運輸和使用的過程中的排放，對環(huán)境造成了巨大的損害，加上世界各地頻繁發(fā)生的漏油事故更加加劇了這種危害。地球上大部分的水域，尤其是海洋常年遭受石油的污染，已經(jīng)引起了全世界的高度關(guān)注。 石油中不同的成分對人類和動植物有著不同的影響。低沸點的飽和烴會引起麻痹、昏迷、濃度過高時甚至?xí)?dǎo)致死亡。高沸點的烴類容易附著在植物的根系表面，形成一層阻礙營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣穿過的粘膜，造成植物根部腐爛，影響植物的生長。石油中的反應(yīng)基團，能與土壤中的無機氮和磷結(jié)合并限制硝化作用和脫磷酸作用。從而使土壤中有效的氮磷含量減少，影響作物的產(chǎn)量。石油中的多環(huán)芳烴類物質(zhì)雖然含量不多，卻是具有強烈毒性而且能對人體產(chǎn)生致癌作用的物質(zhì)。多環(huán)芳烴能夠在動植物尤其是海洋雙殼類生物體內(nèi)富集，通過食物鏈影響人類的身體健康。石油泄漏后引起的海域和陸地的污染也是對當(dāng)?shù)刈匀痪坝^的極大損害，受污染的鹽堿灘中，溢油的滲透可以達到很深的深度，難以清除，產(chǎn)生長期的有害影響。對石油的污染物的處理問題已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的，備受世界范圍內(nèi)矚目的重大課題。石油污染物的處理方法主要包括三種，分別是物理法，化學(xué)法和生物法。其中的生物降解法由于具有花費小、適應(yīng)能力強、高效安全且沒有二次污染的優(yōu)勢成為研究的熱點。微生物降解石油烴的能力取決于石油中各種組分的組成，碳鏈和多環(huán)芳烴的復(fù)雜程度，環(huán)境情況、菌株種類，表面活性劑、產(chǎn)生表面活性劑的細菌是否存在，以及環(huán)境的理化性質(zhì)等諸(PH、溫度、C N P的比率)諸多因素的綜合影響。概括起來說，影響微生物對石油降解的非生物影響因素主要包括兩大類第一是石油烴的情況，第二是環(huán)境因素。石油的烴類情況包括石油濃度、石油與水的互溶狀態(tài)機石油的化學(xué)組成。環(huán)境因素包括溫度、PH、氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和鹽度等。由于石油烴在水中的溶解性極低，使得石油烴的利用率很低，導(dǎo)致生物降解石油的能力下降。在解決這個問題，提出了利用生物表面活性劑進行乳化油相與水相，使石油更加容易接觸到細菌。生物表面活性劑是有微生物產(chǎn)生的兩性復(fù)合物，它不僅能夠黏附在細胞表面，而且也可以直接排除到胞外。將生物表面活性劑應(yīng)用到石油工業(yè)中，不僅降低了石油的開采和運輸?shù)碾y度，而且增加了石油的開采量，對于環(huán)境保護方面來說，生物表面活性劑可以增加泄露在環(huán)境中的石油污染物的可生物降解能力。目前石油污染物生物降解的重點集中在高效石油降解菌的篩選和分離上，石油烴中最容易被降解的是短鏈的烷烴，Subarna等在2002年發(fā)現(xiàn)石油烴中ClO到C20的烷烴最容易被降解，2009年，Le Thi Nhi-Cong等發(fā)現(xiàn)在石油烴的降解過程中，首先降解掉的是直鏈烷烴，有分支的長鏈烷烴在降解過程中能夠積累在一起，幾乎不會被降解掉。然而，1986年Rontani等以及2001年Alvarez等發(fā)現(xiàn)有一些細菌具有氧化這些頑固底物的能力。例如，1993年，Sorkhon等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌只能降解C15到C17的烴類；2001年Kato等發(fā)現(xiàn)喜熱噬油芽胞桿菌能降解烷烴的到C23 ；2005年，Nazina等發(fā)現(xiàn)脂肪地芽孢桿菌只在能在C6到C16碳源的烷烴中生長。只有少數(shù)幾種菌株具有大范圍的降解能力，Sakai等在1994年分離得到的不動桿菌屬能降解C13到C44鏈燒烴；2003年，van Beilen等篩選的紅球菌屬能將長鏈烷烴降解到C36。因此找到能夠降解范圍廣泛，可以將石油污染物內(nèi)的C38以內(nèi)的組分高效降解的微生物具有非常大的理論和實際應(yīng)用價值，這在石油污染區(qū)域的生物修復(fù)，改良生態(tài)環(huán)境和人類的安全健康方面具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的石油污染物降解菌株，即紅球菌JZX-01。本發(fā)明的另一個目的是提供上述紅球菌JZX-OI的培養(yǎng)條件。本發(fā)明的目的還包括提供紅球菌JZX-OI在實際生活中的應(yīng)用，具體的說是用于降解石油或原油等污染物為環(huán)境友好物質(zhì)。本發(fā)明所拱的菌株是采取逐級篩選的方法，直接從土壤中篩選含有所需的目的菌種并分離純化而得到，而且提供了該菌種的培養(yǎng)條件和在石油或原油等污染物降解的用途。本發(fā)明所述的紅球菌JZX-Ol的16S rDNA的鑒定是通過在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI中進行的，通過提交序列后得到的16S rDNA的序列號為JQ648650。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種紅球菌JZX-01，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏的登記號為CGMCC No. 5958的紅球菌；保藏日期2012年4月9日。一種紅球菌JZX-01，是通過16S rDNA測序以及在NCBI上進行比對得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具體的序列是5’-AGA GTT TGATCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具體的序列是 5’ -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3’。本發(fā)明的紅球菌JZX-Ol的培養(yǎng)方法，步驟如下(I)紅球菌JZX-Ol菌體或者孢子接到斜面上，在斜面上培養(yǎng)1-4天，所述的培養(yǎng)基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、瓊脂l-30g/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。(2)將菌體從斜面上取得后，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-4天，所述的培養(yǎng)液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物l_5g/L，誘導(dǎo)劑1-10ML/L，加蒸餾水定容至1L，pH值是3-9，培養(yǎng)溫度是5°C -45 °C。所述的碳源是為可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黃豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉或硝酸鉀。所述的微量元素是猛、鋅、鈷、鎳、鎂、鐵、 丐、銅、鉻、硒、鑰、鈷或氟。所述的誘導(dǎo)劑添加到培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中作為JZX-Ol的唯一碳源進行培養(yǎng)，保證菌種只能利用此種碳源進行生長代謝；所述的誘導(dǎo)劑是烷烴、原油、柴油、汽油、液態(tài)石蠟或多環(huán)芳烴。培養(yǎng)1-4天后的培養(yǎng)液在lOOO-lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速下，0_20°C的溫度下進行離心1-10分鐘。離心后的到的菌體JZX-01用不含碳源的無機鹽培養(yǎng)基洗滌1-3次，除去培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將純凈的JZX-01加入到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
本發(fā)明提供的紅球菌已于2012年4月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏的編號為CGMCC No. 5958，分類命名為紅球菌(Rhodococcus sp)。本發(fā)明的效果是紅球菌JZX-01能夠以很高的效率降解誘導(dǎo)劑，而且在較短的時間內(nèi)降解率較高。本發(fā)明的效果還有紅球菌JZX-01能夠高效的產(chǎn)生生物表面活性劑，而降低培養(yǎng)液的表面張力，增加誘導(dǎo)劑與無機鹽溶液的相互乳化能力。本發(fā)明所述的紅球菌JZX-01具有產(chǎn)生生物表面活性劑的能力，這種能力在以石油烴等誘導(dǎo)劑為底物的降解過程中具有重要意義。本發(fā)明提供的紅球菌JZX-01的生理生化特征，具體的說如下表
實驗項目結(jié)果實驗項目結(jié)果實驗項目結(jié)果實驗項目結(jié)果
精氨酸-硝酸鹽還原 +ONPG__+硫化氫__+_
鳥氨酸 -尿素__+蔗糖__+葡萄糖__+_
賴氨酸 -七葉苷__-麥芽糖 +氧化酶__+_
枸橡酸鹽__+__青定基質(zhì)試驗 -__木糖__^__革蘭氏染色 +_注表中+表示陽性，-表示陰性。具體說明如下本發(fā)明的紅球菌的鑒定是通過16S rDNA測序以及在NCBI上進行比對得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具體的序列是5’-AGA GTTTGATCC TGG CTCAG-3’，下游的通用引物是1492R，具體的序列是5’-GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3，。本發(fā)明的紅球菌JZX-01的篩選方法，具體的說是將誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液中，并將土壤加入到培養(yǎng)液或者培養(yǎng)基，在搖床中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度是10_40°C，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速是100-300rpm。培養(yǎng)1_4天后，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中進行篩選。本發(fā)明的紅球菌JZX-01的培養(yǎng)方法，具體的說是用接種針挑取從土壤中分離篩選純化得到的紅球菌jZX-ΟΙ菌體或孢子接種到斜面上，在斜面培養(yǎng)基生長1-4天，所述的培養(yǎng)基成分是碳源(可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油)l_20g/L，氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、瓊脂l_30g/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物l-5g/L加蒸懼水定容至1L。在生長良好的斜面培養(yǎng)基中加入沒有誘導(dǎo)劑的液體無機鹽培養(yǎng)基，洗滌下菌體之后將菌體直接倒入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度是是5°C _45°C，培養(yǎng)基或培養(yǎng)液的成分是氮源l-5g/L、NaCl 0_2g/L、微量元素混合溶液l_20mL/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物0_5g/L，誘導(dǎo)劑1-50ML/L，加蒸餾水定容，PH值是3_9，培養(yǎng)溫度是5°C -45°C，所述的誘導(dǎo)劑是烷烴、原油、柴油、汽油、液態(tài)石蠟或多環(huán)芳烴。本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，經(jīng)過培養(yǎng)液培養(yǎng)后分離的到的菌體，可以用除去碳源的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液洗滌菌體，再離心分離，所得到的菌群可以直接加入到含誘導(dǎo)劑的無機鹽培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)劑的降解反應(yīng)。上述碳源是可溶性淀粉、甘油、葡萄糖。其中菌體在葡萄糖、甘油和可溶性淀粉中的生長旺盛。上述氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黃豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀。其中牛肉膏、牛肉浸取物、硝酸鈉或硫酸銨的存在下，菌體生長良好，在硝酸根離子單獨存在的情況下，菌體也可以良好生長。表明JZX-01具備氧化 高價氮元素的作用。蛋白胨由于其雙性電解的性質(zhì)，具備良好的緩沖作用，便于細菌吸收利 用，但是在使用時細胞生長緩慢。上述誘導(dǎo)劑是烷烴、原油、柴油、汽油、液態(tài)石蠟或多環(huán)芳烴。用烷烴、原油、柴油和汽油作為誘導(dǎo)劑時，JZX-01表現(xiàn)出良好的降解性能。其中以烷烴或柴油作為誘導(dǎo)劑時，JZX-01還能產(chǎn)生生物表面活性劑，降低菌液的表面張力，促進這些水不溶性物質(zhì)的乳化作用和降解作用。誘導(dǎo)劑是在波長為400-700的菌體初始OD值為O. 1-2的條件下加入的。誘導(dǎo)劑的量對菌體的生長有著先促進后抑制的作用，每升溶液的合適誘導(dǎo)劑為l_20g。上述微量元素是微量元素是錳、鋅、鈷、鎳、鎂、鐵、鈣、銅、鉻、硒、鑰、鈷或氟。微量元素溶液如，MnSO4 · 4H20, ZnSO4 · 7H20, Na2MoO4 · 2H20, CuSO4 · 5H20, FeSO4 · 7H20, CaCl2,NaSO4 或 H3BO3 等。本發(fā)明優(yōu)選的培養(yǎng)基成分是可溶性淀粉l_5g/L，牛肉浸取物l_5g/L，硝酸鈉l-5g/L, K2HP04 O. 5_5g/L，KH2P04 O. 5_5g/L，NaCl O. l_2g/L，微量元素溶液 1-20ML/L。本發(fā)明篩選得到的紅球菌JZX-Ol能夠降解石油污染物，降解范圍廣泛，可以將石油污染物內(nèi)的C38以內(nèi)的組分高效的降解掉。不僅如此，難以降解的支鏈成分，例如姥鮫烷和植烷都可以被大部分的降解。紅球菌JZX-Ol產(chǎn)生表面活性劑的能力又進一步的增加了石油降解的效率。經(jīng)過考察，紅球菌JZX-Ol可以將石油污染物高效、安全的降解，可以用于對石油污染物的生物處理。


圖I是紅球菌JZX-Ol與相關(guān)菌株的進化樹。JZX-Ol的16S rDNA是通過在美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI進行鑒定的并得到16S rDNA的序列號為JQ648650。采用N-J方法，自展值為1000的條件下得到JZX-Ol的系統(tǒng)進化樹。
具體實施例方式通過下面結(jié)合具體實例將有助于進一步理解本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不限制于此實施例I :紅球菌JZX-OI的篩選從環(huán)渤海地帶中受石油污染嚴(yán)重的區(qū)域取回被污染土壤，在收集土壤樣品的過程中，在不同的深度和位點進行土壤的取樣。取回的土壤樣品用將誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液中，并將土壤加入到培養(yǎng)液或者培養(yǎng)基，在搖床中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度是10-40°C，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速是100-300rpm。培養(yǎng)1_4天后，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中進行篩選。其中，所述的培養(yǎng)基成分是硫酸銨5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素混合溶液10mL/L、磷酸氫二鉀3g/L、磷酸二氫鉀3g/L加蒸餾水定容至1L。添加的誘導(dǎo)劑5mL/L，培養(yǎng)溫度是是30°C，PH值是7. 0，所述的誘導(dǎo)劑是柴油。上述的培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液均在121°C滅菌30分鐘。培養(yǎng)3天后，將菌液轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中，加入等量的誘導(dǎo)劑，重復(fù)操作3次。實施例2紅球菌JZX-Ol的純化將得到的菌液稀釋后在固體營養(yǎng)培養(yǎng)基中涂布，固體營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分是可溶性淀粉2g/L、硫酸銨5g/L、NaCl O. 5g/L、微量元素溶液10mL/L、瓊脂20g/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物3g/L、磷酸氫二鉀3g/L、磷酸二氫鉀3g/L加蒸餾水定容至1L。挑取 單菌落進行保藏。得到單菌落后，分別驗證每個菌株對柴油的降解能力，其中一株降解能力最好的菌株命名為JZX-Ol。實施例3碳源對紅球菌JZX-Ol生長的影響獲得的紅球菌JZX-Ol在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的碳源分別是可溶性淀粉2g/L、甘油2g/L、葡萄糖2g/L，氮源是硫酸銨5g/L，NaClO. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氫二鉀3g/L，磷酸二氫鉀3g/L加蒸餾水定容至1L。分別考察上述三種碳源對菌體生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加可溶性淀粉2g/L的培養(yǎng)基中，JZX-Ol的生長狀況最好。實施例4氮源對紅球菌JZX-Ol生長的影響獲得的紅球菌JZX-Ol在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的氮源分別是牛肉膏5g/L、牛肉浸取物5g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、黃豆粉浸液5g/L、L-谷氨酸氨5g/L、硫酸銨5g/L、氯化銨5g/L、硝酸鈉5g/L、硝酸鉀5g/L，碳源是可溶性淀粉2g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氫二鉀3g/L，磷酸二氫鉀3g/L加蒸餾水定容至1L。分別考察上述十種碳源對菌體生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加硫酸銨5g/L的培養(yǎng)基中，JZX-Ol的生長狀況最好。實施例5用于培養(yǎng)JZX-Ol的微量兀素混合液本發(fā)明的微量兀素是固體營養(yǎng)培養(yǎng)基、液體營養(yǎng)培養(yǎng)基和無機鹽培養(yǎng)基中必須添加的混合溶液，為紅球菌JZX-Ol生長提供必需的微量元素。微量元素混合液的成分是Na2EDTA · H2O I. 2g/L,固體 NaOH O. 6g/L, MnSO4 · 4H20 O. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 08g/L,98%濃硫酸 0. 06g/L, Na2M0O4 · 2H20 0. 2g/L, FeSO4 · 7H20 0. 03g/L, CuSO4 · 5H20 0. Olg/L, CaCl20. 3g/L 以及固體 NaSO4 0. 5g/L。實施例6不同誘導(dǎo)劑對紅球菌JZX-01生長的影響紅球菌JZX-01在無機鹽培養(yǎng)基中，使用不同的誘導(dǎo)劑進行生長，無機鹽培養(yǎng)基的誘導(dǎo)劑分別是體積比為1%的烷烴、原油、柴油、汽油、液態(tài)石蠟和多環(huán)芳烴，氮源是硫酸銨5g/L，NaCl O. 5g/L，微量元素溶液10mL/L，磷酸氫二鉀3g/L，磷酸二氫鉀3g/L加蒸餾水定容至1L。分別考察上述六種誘導(dǎo)劑對菌體生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加1%體積比的柴油培養(yǎng)基中，JZX-Ol的生長狀況最好。實施例7擴大培養(yǎng)后紅球菌JZX-Ol純菌體的獲得紅球菌JZX-Ol在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，300C，200rpm的搖床中生長3天后，吸取IOmL的培養(yǎng)液在，棄去上清液之后，用無菌無機鹽溶液進行在IOOOrpm的漩渦震蕩器中震蕩洗滌10分鐘，將混合均勻的溶液重新在8000rpm的離心機中離心10分鐘，重復(fù)上述過程3次，棄凈上清液，得到大量的紅球菌JZX-Ol。實施例8
上述紅球菌(Rhodococcus.Sp JZX-OI) CGMCC No. 5958 菌株 16SrDNA 基因的提取將JZX-Ol在培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，得到高濃度的細胞培養(yǎng)液。取I. 5mL的培養(yǎng)液，在SOOOrpm的轉(zhuǎn)速下進行離心，沉淀物中加入滅菌無機鹽培養(yǎng)基進行洗滌，再次離心棄上清，得到的沉淀加入IOOuL的破菌緩沖液，漩渦震蕩混勻。然后依次加入O. 4g石英砂，300uL苯酚氯仿異戊醇(比例為25 24 I)的混合液，再次漩渦震蕩三分鐘，進行細菌破壁處理。加入IOOuL的TE緩緩沖液后，漩渦震蕩混勻。之后在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取大約300uL的上清液。在上清液中加入30uL的3M NaAC和600uL的無水乙醇，混勻后室溫下靜置30分鐘以上。之后在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心8分鐘，棄凈上清。沉淀物中加入如70%的乙醇進行洗滌，12000rpm離心5分鐘，棄上清，自然風(fēng)干。烘干后的樣品中，加入50uL的EB緩沖液進行洗脫，洗脫后放置于-20°C的冰箱中保藏。至此，得到JZX-Ol基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，以購買于上海生物工程公司的通用引物27f和1492r為引物，加入上游引物27f 2uL，下游引物1492r 2uL，加入模板即紅球菌(Rhodococcus. Sp JZX-01) CGMCC No. 5958 菌株的基因組 DNA 3uL, plus master mix taqDNA合成酶25uL，補充雙蒸水18uL后，加入到PCR擴增儀之中。PCR擴增儀的升溫程序如下94°C加熱4分鐘，94°C進行變性I分鐘，溫度53 °C進行退火30秒，72 °C進行延伸2分鐘，將從53°C到72°C的循環(huán)進行30次，最后在72°C保持10分鐘，使反應(yīng)混合物充分?jǐn)U增，后轉(zhuǎn)到4°C終止擴增反應(yīng)，一段時間后從PCR擴增儀中拿出樣品，放置于4°C冰箱里進行短期保存或者-20°C下進行長期保存。擴增得到的16S rDNA產(chǎn)物取出5uL，在含0. 8%的瓊脂凝膠電泳中進行驗證，使用IOObp的基因標(biāo)記物進行標(biāo)記。含目的片段(1500bp)的PCR產(chǎn)物混合，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收，回收時更換新的電泳液，切膠純化，對電泳檢測驗證合格的PCR樣品進行測序。實施例9紅球菌JZX-OI的系統(tǒng)進化樹根據(jù)紅球菌的測序結(jié)果進行對比，紅球菌(Rhodococcus. sp) CGMCC No. 5958菌株的16 SrDNA基因序列長度為1376bp，核苷酸序列如下I tcgaacgatg aagcccagct tgctgggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg61 gtgatctgcc ctgcacttcg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc ggataggacc121 tcgggatgca tgttccgggg tggaaaggtt ttccggtgca ggatgggccc gcggcctatc
181 agcttgttgg tggggtaacg gcccaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg241 accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat301 attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg
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權(quán)利要求
1.一種紅球菌JZX-01，其特征是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏的登記號為CGMCC No. 5958的紅球菌；保藏日期2012年4月9日。
2.一種如權(quán)利要求I所述的紅球菌JZX-Ol的培養(yǎng)方法，其特征是步驟如下 (1)紅球菌JZX-Ol菌體或者孢子接到斜面上，在斜面上培養(yǎng)1-4天，所述的培養(yǎng)基成分是碳源l_20g/L，氮源l-5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素混合溶液溶液l_20mL/L、瓊脂l_30g/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l_5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物l-5g/L,加蒸懼水定容至1L。
(2)將菌體從斜面上取得后，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)液中培養(yǎng)1-4天，所述的培養(yǎng)液的成分是氮源l_5g/L、NaCl l_2g/L、微量元素溶液l_20mL/L、磷酸根的一價金屬離子或者其水合物l-5g/L、磷酸二氫的一價金屬鹽或其水合物l_5g/L,誘導(dǎo)劑1-10ML/L,加蒸懼水定容至1L,pH值是3-9，培養(yǎng)溫度是5°C -45 0C。
3.一種紅球菌JZX-OI，其特征是通過16S rDNA測序以及在NCBI上進行比對得到的，上游和下游引物都是通用引物，上游引物是27F，具體的序列是5’ -AGAGTT TGA TCC TGG CTCAG-3’，下游引物是 1492R，具體的序列是 5’ -GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的碳源是為可溶性淀粉、葡萄糖或者甘油。
5.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的氮源是牛肉膏、牛肉浸取物、蛋白胨、酵母提取物、黃豆粉浸液、L-谷氨酸氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉或硝酸鉀。
6.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的微量元素是錳、鋅、鈷、鎳、鎂、鐵、I丐、銅、鉻、硒、鑰、鈷或氟。
7.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的誘導(dǎo)劑添加到培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中作為JZX-Ol的唯一碳源進行培養(yǎng)，保證菌種只能利用此種碳源進行生長代謝；所述的誘導(dǎo)劑是烷烴、原油、柴油、汽油、液態(tài)石蠟或多環(huán)芳烴。
8.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)14天后的培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速lOOO-lOOOOrpm，溫度0_20°C下進行離心1-10分鐘。
9.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征是所述的離心后的到的菌體JZX-01用不含碳源的無機鹽培養(yǎng)基洗滌1-3次，除去培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，將純凈的JZX-01加入到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株降解石油污染物的紅球菌JZX-01及其培養(yǎng)方法；紅球菌的鑒定是通過16S rDNA測序以及在NCBI上進行比對得到的，所用的16S rDNA的上游引物是通用引物27F，具體的序列是5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3'，下游的通用引物是1492R，具體的序列是5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'。將誘導(dǎo)劑加入到培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液中，并將土壤加入到培養(yǎng)液或者培養(yǎng)基，在搖床中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度是10-40℃，培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速是100-300rpm。培養(yǎng)1-4天后，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中進行篩選。由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏的登記號為CGMCC No.5958的紅球菌；保藏日期2012年4月9日。紅球菌JZX-01產(chǎn)生表面活性劑的能力又進一步的增加了石油降解的效率?？梢杂糜趯κ臀廴疚锏纳锾幚?。
文檔編號A62D101/20GK102851234SQ201210198948
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者賈曉強, 周征西, 聞建平 申請人:天津大學(xué)