本發(fā)明屬于食品抗菌保鮮領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

肉桂精油屬于揮發(fā)性油，是一種黃色至紅褐色澄清液體。肉桂精油的主要成分為肉桂醛，其次為α-水芹烯、桂酸甲酯、樟腦、β-石竹烯、α-依蘭烯、α-松油醇、香葉醇等。肉桂精油具有促進(jìn)血液循環(huán)、清除膽固醇、降血糖及抗菌抗氧化等功能。目前，肉桂精油已被食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)為是一種安全無(wú)毒的食品添加劑。肉桂精油已被廣泛應(yīng)用于食品調(diào)味香辛料、臨床治療、醫(yī)療保健等領(lǐng)域。

D-氨基酸在20世紀(jì)70年代被科學(xué)家在人體中發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的研究證明D-氨基酸能分散金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌的生物膜，但其不能有效殺死游離細(xì)菌，利用其與精油協(xié)同作用，可以更好地破壞細(xì)菌生物膜，達(dá)到抗菌的效果。

而殼聚糖又稱作脫乙酰甲殼素，其作為一種來(lái)源于脫乙酰幾丁質(zhì)糖類的生物高分子產(chǎn)物，這種高分子物質(zhì)因其安全性、微生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。殼聚糖是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的天然堿性多糖，具有廣譜殺菌活性。納米粒子由于其粒徑小、表面曲率大而顯示出表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)等獨(dú)特的物理化學(xué)特性。殼聚糖帶有正電，利用此特點(diǎn)在液態(tài)介質(zhì)中與帶有負(fù)電荷的三聚磷酸鈉交聯(lián)制備殼聚糖納米粒子。在制備過(guò)程中添加肉桂精油及D-氨基酸，可提高其抑菌活性。

國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于殼聚糖納米粒子的專利申請(qǐng)：中國(guó)專利CN103355475A公開了一種包埋丁酸梭菌的殼聚糖納米粒子及其制備方法；中國(guó)專利CN102813931A公開了一種殼聚糖納米粒子及其制備方法和用途；中國(guó)專利CN1586488A公開了一種殼聚糖甘草酸納米粒子及其制備方法；中國(guó)專利CN101664111A公開了一種包埋α-半乳糖苷酶的殼聚糖那納米粒子及其制備方法；中國(guó)專利CN101838344A公開了一種具有熒光標(biāo)記性質(zhì)的殼聚糖納米粒子及其制備方法。

然而，殼聚糖納米粒子直接在食品表面噴灑時(shí)很容易出現(xiàn)聚集和下降現(xiàn)象，降低其封裝物質(zhì)的生物活性。因此可以將殼聚糖納米顆粒載入到納米纖維中，從而納米顆粒被固定在纖維膜上。靜電紡絲是目前可以連續(xù)制備納米纖維且操作方式較溫和的方式，靜電紡絲法可以高效制備納米纖維膜，其制備的納米纖維膜具有比表面積大、納米級(jí)孔隙及活性化合物的高封裝性等優(yōu)點(diǎn)。靜電紡絲工藝簡(jiǎn)單及操作溫和，可將很多功能性物質(zhì)加入到靜電紡絲溶液中，使得制備的納米材料具有廣泛的用途。

國(guó)內(nèi)有很多關(guān)于靜電紡絲的專利申請(qǐng)：中國(guó)專利CN105483938A公開了一種靜電紡絲法制備PBT/殼聚糖接枝物納米纖維膜的方法；中國(guó)專利CN103041714A公開了一種改性殼聚糖復(fù)合靜電紡絲納米纖維的復(fù)合超濾及其制備方法；中國(guó)專利CN103706335A公開了一種鐵/殼聚糖/聚氧化乙烯復(fù)合納米纖維膜除砷材料及其靜電紡絲制備方法；中國(guó)專利CN102776709A公開了一種靜電紡絲制備聚乙烯吡咯烷酮/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜。

將D-氨基酸/肉桂精油/殼聚糖納米粒子與靜電紡絲相結(jié)合，研究實(shí)驗(yàn)原料配方及其工藝參數(shù)，對(duì)于開發(fā)新型的食品活性包裝具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜的制備方法和用途，通過(guò)水包油(o/w)乳液的制備將精油溶于水，再通過(guò)三聚磷酸鈉與殼聚糖交聯(lián)制備得到自組裝的殼聚糖納米粒子，以減少肉桂精油使用過(guò)程中的揮發(fā)，提高其利用率。然后將D-氨基酸/肉桂精油/殼聚糖納米粒子添加到靜電紡絲溶液中制備成納米纖維膜，提高殼聚糖納米粒子的穩(wěn)定性，將抗菌膜用于抑制大豆產(chǎn)品上的金黃色葡萄球菌生物膜形成。

本發(fā)明由殼聚糖，D-脯氨酸，D-苯丙氨酸，吐溫80，肉桂精油，三聚磷酸鈉，聚環(huán)氧乙烯制成納米纖維抗菌膜。

納米纖維抗菌膜的制備方法，包括以下步驟：

(1)D-氨基酸/肉桂精油/殼聚糖納米粒子溶液的制備方法：將殼聚糖溶解在乙酸溶液中，常溫下攪拌均勻后，用去離子水將其稀釋，配制成殼聚糖溶液；隨后將D-脯氨酸溶液和D-苯丙氨酸溶液加入到上述殼聚糖溶液中，將混合物第二次常溫?cái)嚢韬螳@得均勻溶液；再將制備的精油-吐溫80混合物逐滴加到上述均勻溶液中，第三次常溫?cái)嚢韬髮⑴渲频娜哿姿徕c溶液逐滴加入到連續(xù)攪拌的上述溶液中繼續(xù)攪拌，攪拌完成后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7即可，通過(guò)離離心機(jī)心獲得自組裝的負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子，分散在與離心前使用的去離子水等體積的去離子水中，制得自組裝的負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子溶液，4℃保藏。

所述乙酸溶液中的乙酸的體積百分濃度為1％；稀釋后殼聚糖溶液的終濃度為2mg/mL。

所述D-脯氨酸與D-苯丙氨酸的質(zhì)量比為23:33；D-脯氨酸溶液的濃度為1.15mg/mL，D-苯丙氨酸溶液的濃度為1.65mg/mL。

所述精油-吐溫80混合物中精油與吐溫80的質(zhì)量比為1:1。

所述三聚磷酸鈉溶液的濃度為0.5mg/mL。

所述殼聚糖、D-脯氨酸、D-苯丙氨酸、吐溫80、三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為：80:46:66:200:20。

所述常溫下攪拌的時(shí)間為30min；第二次常溫?cái)嚢璧臅r(shí)間為1h；第三次常溫?cái)嚢璧臅r(shí)間為1h；離心機(jī)離心的時(shí)間為10min，轉(zhuǎn)速為10000rpm，溫度在25℃下。

(2)納米纖維抗菌膜的制備方法：在步驟(1)制得的自組裝的負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子溶液中加入聚環(huán)氧乙烯制備得到質(zhì)量百分濃度為8wt％(g/g)的聚環(huán)氧乙烯靜電紡絲溶液，常溫?cái)嚢柽^(guò)夜后超聲脫氣后得到紡絲前驅(qū)體溶液；注射器吸取紡絲前驅(qū)體溶液進(jìn)行靜電紡絲，采用平板收集法得到納米纖維抗菌膜。

所述超聲脫氣的時(shí)間為30min。

所述靜電紡絲電壓為5kV-30kV，推進(jìn)速率為0.1-3mL/h，接收距離為10-20cm，空氣濕度控制在35％以下。

(3)抗菌膜冷等離子體處理：抗菌膜干燥后放置于紫外燈下滅菌處理，冷等離子體處理后備用。

所述干燥指置于烘箱干燥4h，置于紫外燈下滅菌處理的時(shí)間為2h，冷等離子體500W處理4min。

(4)所制納米纖維抗菌膜的應(yīng)用，其用于豆制品的保鮮，將經(jīng)冷等離子體處理后的納米纖維抗菌膜包裹豆制品，有效抑制豆制品上的金黃色葡萄球菌生物膜形成，有效延長(zhǎng)其保質(zhì)期。

附圖說(shuō)明

表1負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子的表征。

圖1聚環(huán)氧乙烯纖維膜和負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的納米纖維抗菌膜。

圖2負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的納米纖維抗菌膜的抗菌效果圖。

圖3負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的納米纖維抗菌膜在豆腐皮的實(shí)際應(yīng)用。

圖4負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的納米纖維抗菌膜在豆腐干的實(shí)際應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

通過(guò)下面實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容，不僅局限于此。

實(shí)施例1 D-氨基酸/肉桂精油/殼聚糖納米粒子的表征

1實(shí)驗(yàn)材料

2實(shí)驗(yàn)方法

1)D-氨基酸/肉桂精油/殼聚糖納米粒子的制備

①吸取200μL乙酸加入去離子水配成體積百分濃度為1％(V/V)的乙酸溶液，磁力攪拌20min。

②稱取80mg殼聚糖加入到上述溶液中配制成4mg/mL的殼聚糖溶液，攪拌30min，然后加入20mL的去離子水稀釋成2mg/mL的終濃度。

③稱取含46mg脯氨酸的脯氨酸溶液和含66mg苯丙氨酸的苯丙氨酸溶液加入到上述溶液中，磁力攪拌1h。

④稱取200mg的吐溫80和200mg的肉桂精油混合，逐滴加到上述溶液中，繼續(xù)磁力攪拌1h。

⑤稱取20mg的三聚磷酸鈉溶解于40mL的去離子水中，等上述溶液攪拌1h后將三聚磷酸鈉溶液逐滴加入其中攪拌3h。

⑥攪拌完成后用2mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7。

⑦25℃下以10000rpm離心10min獲得自組裝的殼聚糖納米粒子并分散在79.8mL去離子水中，4℃保藏。

2)包封率的測(cè)定

用無(wú)水乙醇稀釋肉桂精油，稀釋成濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6和3.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，分別吸取1μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析，獲得對(duì)應(yīng)于不同精油濃度的檜烯(肉桂精油主要成分)峰面積，然后對(duì)峰面積進(jìn)行自動(dòng)積分，繪制檜烯峰面積-肉桂精油濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mL殼聚糖納米粒子離心時(shí)的上清液，用于GC-MS分析。對(duì)樣品上清液中的檜烯主成分的峰面積進(jìn)行自動(dòng)積分，再根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出其中的肉桂精油的含量。則：

使用氨基酸分析儀測(cè)定D-脯氨酸和D-苯丙氨酸的包封率，同樣的離心后收集上清液，通過(guò)氨基酸分析儀測(cè)量游離的氨基酸的量，隨后根據(jù)公式計(jì)算出兩種氨基酸的包封率。

3)粒徑與多分散系數(shù)的測(cè)定

用美國(guó)布魯克海文儀器公司產(chǎn)的，型號(hào)為BI-9000的高濃度激光粒度儀測(cè)定二氧化硅-肉桂精油脂質(zhì)體的粒徑和多分散系數(shù)(PDI)值，所測(cè)樣品放入樣品池直接測(cè)量即可。

表1負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子的表征

由表1可看出，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子精油的包封率為45.1％，D-脯氨酸和D-苯丙氨酸的包封率分別為38.5％和33.6％，包封效果較好。多分散系數(shù)(PDI)直接反映納米粒子的穩(wěn)定性，因此是主要參考指標(biāo)，PDI＜0.3較好，當(dāng)PDI>0.8時(shí)，不予考慮?？瞻讱ぞ厶羌{米粒子的粒徑為243.6nm、PDI為0.277，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油殼聚糖納米粒子的粒徑為335.7nm、PDI為0.267，粒徑明顯變大。Zeta電位也可以直接反映負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油殼聚糖納米粒子的穩(wěn)定性，因此也是主要參考指標(biāo)，Zeta電位的絕對(duì)值越大說(shuō)明脂質(zhì)體越穩(wěn)定性，Zeta電位的絕對(duì)值在0～30范圍內(nèi)屬于不穩(wěn)定，在大于30時(shí)脂質(zhì)體較穩(wěn)定性。負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子的Zeta電位為42.2mV，較穩(wěn)定。

實(shí)施例2負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維膜的表征

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯 SIGMA-ALDRICH

上述制備的殼聚糖納米粒子

2實(shí)驗(yàn)方法

1)負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維膜的制備

①稱取800mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.2g的負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的殼聚糖納米粒子溶液中攪拌過(guò)夜，制備得到8wt％(g/g)的靜電紡絲溶液。

②將靜電紡絲溶液超聲脫氣30min得到紡絲前驅(qū)體溶液。

③注射器吸取5mL紡絲前驅(qū)體溶液組裝好并開始紡絲，靜電紡絲電壓為20kV，推進(jìn)速率為0.6mL/h，接收距離為15.5cm，空氣濕度控制在35％以下，采用平板收集法，經(jīng)3h后得到納米纖維膜。

④按紡絲步驟，不加D-氨基酸，稱取200mg的吐溫80和200mg的肉桂精油混合，慢慢加入到79.8mL的去離子水中攪拌，稱取800mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.2g的肉桂精油溶液中攪拌過(guò)夜，然后紡絲可得到肉桂精油纖維膜；同樣稱取800mg的聚環(huán)氧乙烯慢慢加入到9.2g的去離子水中攪拌過(guò)夜，紡絲可得到聚環(huán)氧乙烯纖維膜。

⑤2)SEM觀察靜電紡絲纖維膜

使用JSM-7001F掃描電子顯微鏡檢查納米纖維膜的形態(tài)。在真空下用Au/Pd混合物濺射不同的樣品，且所有的SEM實(shí)驗(yàn)在30kV下進(jìn)行。

3)SEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果

掃描電鏡圖如圖1所示，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油的納米纖維膜因包裹D-氨基酸和肉桂精油而有結(jié)節(jié)，成絲性良好，斷絲不明顯。

實(shí)施例3負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜抑菌性能的測(cè)定

1實(shí)驗(yàn)材料

負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜，負(fù)載肉桂精油納米纖維膜(不加D-氨基酸)，聚環(huán)氧乙烯空白膜

金黃色葡萄球菌

2實(shí)驗(yàn)方法

1)制備菌液

接種金黃色葡萄球菌于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB),37℃搖床中振蕩培養(yǎng)48h，振蕩器混勻后用0.03mol/L磷酸鹽緩沖液10倍梯度稀釋1000倍(約為10⁵cfu/mL)。

2)靜電紡絲纖維膜處理

按照實(shí)施例1和2制備聚環(huán)氧乙烯纖維膜、負(fù)載肉桂精油納米纖維膜(不加D-氨基酸)和負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜，烘箱干燥4h。將膜切成2cm×2cm的規(guī)格并放置于紫外燈下滅菌處理2h以備用。

3)ASTM搖瓶法測(cè)定

將滅菌后的聚環(huán)氧乙烯纖維膜、負(fù)載肉桂精油納米纖維膜和負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜經(jīng)冷等離子體500W處理4min。50mL的離心管中加入15mL磷酸鹽緩沖液滅菌處理，將上述三種膜分別置于含有金黃色葡萄球菌(約為10⁵cfu/mL)的磷酸鹽緩沖液中，離心管置于空氣搖床中在37℃的條件下震蕩反應(yīng)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，分別在4h、8h、16h和24h時(shí)取適量培養(yǎng)液進(jìn)行十倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取100μL稀釋液滴到固體培養(yǎng)基上，涂布均勻之后放入37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。48h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，從而對(duì)抗菌膜的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一式三份，結(jié)果取平均值。

4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2清晰可知，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜的抗菌性對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性，且D-氨基酸與肉桂精油的協(xié)同殺菌作用很明顯。

實(shí)施例4負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜在大豆制品中的實(shí)際應(yīng)用

1實(shí)驗(yàn)材料

聚環(huán)氧乙烯纖維膜，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜

金黃色葡萄球菌、豆腐皮和豆腐干(切成5×5cm大小)

2實(shí)驗(yàn)方法

1)靜電紡絲纖維膜處理

按照實(shí)施例1和2制備負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜和聚環(huán)氧乙烯空白纖維膜，烘箱干燥4h，放置于紫外燈下滅菌處理1h以備用。

2)實(shí)驗(yàn)測(cè)定

將滅菌后的聚環(huán)氧乙烯空白膜和抗菌膜經(jīng)冷等離子體500W處理4min。將豆制品浸沒在金黃色葡萄球菌菌懸液(10⁴cfu/mL)中30min。然后用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液沖洗掉豆制品表面附著松散的細(xì)菌，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中并放置于層流室干燥15min。用空白膜和抗菌膜包裹豆制品，每隔24h后取出豆制品試樣后于無(wú)菌環(huán)境下晾干，再轉(zhuǎn)移到無(wú)菌均質(zhì)袋中，并向裝有試樣的無(wú)菌均質(zhì)袋中加入9倍的磷酸緩沖液均質(zhì)。吸取上清液測(cè)定試樣中的金黃色葡萄球菌，從而對(duì)抗菌膜的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)一式三份，結(jié)果取平均值。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3和圖4清晰可知，負(fù)載D-氨基酸/肉桂精油納米纖維抗菌膜對(duì)大豆制品中的金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性。