處理纖維素材料的新穎蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了新穎多肽和包含它們的酶制劑，所述多肽和酶制劑即使在升高的溫度下也增強纖維素降解的效率。所述多肽通過重組技術制造，并且描述了它們的制備的方法。新穎多肽在處理生物質、和在生物燃料、淀粉、紡織品、清潔劑、紙漿和紙、食物、飼料或飲料工業(yè)中是有用的。它們也可以用在例如清潔洗碗機機器的內部或用于生物整理或生物打磨。新穎多肽在動物飼料中也是有用的。
DSM25498
20111215

DSM25499
20111215

DSM25497
20111215

DSM25496
20111215

DSM25494
20111215

CBS116240
20040920

CBS132099
20120302

DSM25495
20111215
【專利說明】處理纖維轟材料的新穎蛋白
[0001] 導致本發(fā)明的工作已經收到來自歐盟第走框架計劃FP7/2007-2-13在授予協(xié)議 號碼239341下提供的資金。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及新穎多膚和包含它們的酶制劑，所述多膚和酶制劑即使在升高的溫度 下也增強纖維素降解的效率。本發(fā)明也涉及多核巧酸、載體和包含所述多核巧酸的宿主細 胞W及制造所述多膚的方法。另外，本發(fā)明涉及用所述新穎多膚或酶制劑處理纖維素材料 的方法，其中纖維素材料的水解得到增強。所述新穎多膚在處理纖維素材料中是有用的。此 夕F，所述新穎多膚可用在清潔劑組合物中、用在機器洗碗應用中或用于改進動物飼料的質 量。

【背景技術】
[0003] 礦物燃料的有限資源和從它們釋放的增加的C02的量和引起溫室現(xiàn)象已經提出 了使用生物質作為可再生的和清潔的能量源的需要。生物質資源可大體上分為基于農業(yè)的 或基于林業(yè)的，包括來源于農業(yè)和木材工業(yè)的二級來源、廢物來源和城市固體廢物。一種有 前途的可選技術是從木質纖維素材料生成生物燃料即（生物）己醇。
[0004] 在植物中的多數(shù)碳水化合物是木質纖維素的形式，木質纖維素基本上由纖維素、 半纖維素和木質素組成。木質纖維素可W通過水解為可發(fā)酵的糖然后發(fā)酵而轉化為生物己 醇和其他的化學產物。在傳統(tǒng)的木質纖維素到己醇的方法中，木質纖維素材料首先化學地 或物理地進行預處理W制造更加易于水解的纖維素級分。所述纖維素級分然后被水解W得 到糖，所述糖可被酵母菌或其他發(fā)酵微生物發(fā)酵成己醇，并且蒸觸W得到純的己醇。木質素 作為主要的共產物獲得，可用作固體燃料。
[0005] 從纖維素生物質和木質纖維素生物質制造生物燃料的一個障礙是細胞壁的堅固 性和糖單體W難W接近的聚合物的形式存在，該需要大量的處理W使得糖單體能夠被通常 用于通過發(fā)酵制造己醇的微生物所利用。酶水解被認為是用于將纖維素生物質轉化成可發(fā) 酵的糖的最有前途的技術。但是，酶水解僅僅用到在工業(yè)規(guī)模的有限的量，并且尤其當使 用強木質化的材料例如木材或農業(yè)廢物時該技術不盡理想。酶催化步驟的成本是該方法 的一個主要的經濟學因素。已經做出努力W改進纖維素材料的酶催化水解的效率炬adger 2002)O
[0006] 除了改進關于各個纖維素水解酶的性質外，通過影響纖維素酶對木質纖維素的活 性W改進纖維素材料的酶催化降解也是有利的。優(yōu)化纖維素酶混合物中組分和補充其他的 協(xié)同性作用的酶將改進水解效率。
[0007]W02005074647 和W02011035027 公開 了從太瑞斯梭抱殼霉（Thielavia terrestris)分離的具有纖維素水解增強活性的多膚和其多核巧酸。W02005074656公開 了從金黃色嗜熱子囊菌（Thermoascusaurantiacus)分離的具有纖維素水解增強活性的 多膚及其多核巧酸。W02007089290公開了從里氏木霉（Trichodermareesei)分離的具有 纖維素水解增強活性的多膚和其多核巧酸。W02008140749涉及用纖維素水解酶組合物降 解或轉化含纖維素的材料的組合物和方法，所述纖維素水解酶組合物包括具有纖維素水解 增強活性的里氏木霉多膚和選自具有內切葡聚糖酶活性或纖維二糖水解酶活性的CEL7、 CEL12和CEL45多膚的一或多種組分。W02009085868涉及從嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermo地ila)分離的具有纖維素水解增強活性的多膚和其多核巧酸。W02009033071涉 及來自QiiTsosporiumlucknowense(現(xiàn)在重新鑒定為嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermo地ile) ;Visser等2011)的真菌酶，和涉及在多種其他過程中使用該酶和該樣的酶 的組合物的方法，所述過程包括洗衣服、清潔過程、生物精煉、脫墨和紙和紙漿的生物漂白、 和廢物流的處理。
[0008] 然而，仍然存在對降解纖維素底物尤其是木質纖維素底物的新的有效的方法、和 對能相當?shù)馗倪M纖維素酶混合物的水解效率并降低需要的酶劑量的新的纖維素酶增強因 子的不斷需要。也存在對多用途的和能給出更多靈活的方法構造的設計的方法的需要。此 夕F，存在對既能在中等溫度運作又能在高溫運作的方法的需要，高溫運作因此增加了反應 速率并且使高的生物質一致性的使用能夠產生高的糖和己醇濃度。該個方法在能量和投資 花費上可產生顯著的節(jié)省。高溫也降低了在水解期間污染的風險。本發(fā)明旨在滿足該些需 要的至少部分。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目標是提供新穎多膚和包含它們的酶制劑，所述多膚和酶制劑即使在升 高的溫度下也增強纖維素降解的效率。本發(fā)明的目標尤其是提供多膚W改進木質纖維素底 物的水解W制造己醇。本發(fā)明的另一個目標是提供處理纖維素材料的方法，其中纖維素材 料的水解得到增強，并且其中多用途的方法構造在各種條件下是可能的。
[0010] 本發(fā)明的目標由從嗜熱枝頂抱菌（Acremonium thermo地ilium)或白馬蘭諾菌 (Melanoca巧US a化omyces)獲得的GH家族61的新穎多膚實現(xiàn)。
[OOU] 本發(fā)明提供了G冊1多膚，所述多膚包含與SEQIDN0:23具有至少75%序列同 一性的氨基酸序列、與SEQIDN0:24具有至少78%序列同一性的氨基酸序列或與SEQID N0:25具有至少79%序列同一性的氨基酸序列、或其能夠增強纖維素材料水解的片段或變 體。
[0012] 本發(fā)明也涉及選自如下的分離的多核巧酸：
[001引a)包括如在SEQIDNO:20、21或22所示的編碼序列的多核巧酸；
[0014]b)編碼權利要求1的多膚的多核巧酸；
[0015] C)編碼由a)或b)的多核巧酸編碼的多膚的片段的多核巧酸，其中所述片段能夠 增強纖維素材料的水解；和
[0016]d)包含與a)或b)的多核巧酸的核巧酸序列簡并的核巧酸序列的多核巧酸；
[0017] 或者該樣的多核巧酸的互補鏈。
[0018] 本發(fā)明也涉及載體，所述載體包含所述多核巧酸和包含所述載體的宿主細胞。具 有保藏編號DSM25497、DSM25495和DSM25499的大腸桿菌巧scherichiacoli)菌株也 包括在本發(fā)明內。
[0019] 本發(fā)明的另一目標是提供制造所述G冊1多膚的方法，所述方法包括步驟；用編碼 所述多膚的表達載體轉化宿主細胞，和在允許所述多膚表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞， 和任選地回收和純化所述多膚。
[0020] 本發(fā)明的其他目標是包含至少一種新穎多膚的酶制劑和所述酶制劑和多膚用于 生物質加工的用途、和在生物燃料、淀粉、紡織品、清潔劑、紙漿和紙、食物、飼料或飲料工業(yè) 中的用途。在本發(fā)明的一個方面，所述多膚和包含所述多膚的酶制劑用于清潔洗碗機的內 部。在另一個方面，本發(fā)明提供包含所述新穎多膚的動物飼料。
[0021] 本發(fā)明也提供了用G冊1多膚或包含所述多膚的酶制劑處理纖維素材料的方法， 其中所述方法包括將纖維的材料/纖維素材料與所述多膚或包含所述多膚酶制劑反應。在 本發(fā)明的優(yōu)選方面，本發(fā)明的方法包括清潔洗碗機的內部。
[0022] 本發(fā)明也提供了包含G冊1多膚的清潔劑組合物。本發(fā)明還涉及用于改進清潔劑 組合物的織物護理性質或紡織品清潔效果的方法，所述方法包括在清潔劑組合物中添加本 發(fā)明的多膚。
[0023] 本發(fā)明的特定的實施方案在從屬權利要求中闡述。從接下來的附圖、詳細的描述 和實施例中，本發(fā)明的其他目標、細節(jié)和優(yōu)點將變得顯而易見。
[0024] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述新穎GH61多膚和本發(fā)明的方法提供了相當大的潛能W增加纖維素酶混合物的總的性能并且降低實現(xiàn)有效的木質纖維素底物水解所需要的蛋白 裝載。所述新穎GH61多膚可用于水解不同的纖維素材料，尤其與用于各種纖維素材料或木 質纖維素材料的水解的酶組合使用。
[0025] 本發(fā)明的發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)所述新穎G冊1多膚在寬廣的溫度范圍是非常有效的，并 且盡管它們在標準水解溫度下具有高的纖維素水解增強活性，但它們在高溫下也是非常有 效的。該使它們對于在傳統(tǒng)溫度和升高的溫度下實施的變化的纖維素底物水解方法是極其 適合的。在傳統(tǒng)的分步水解發(fā)酵法（SH巧中，酶水解的溫度通常高于發(fā)酵的溫度。在水解 中使用熱穩(wěn)定酶提供了潛在的好處，例如在升高的溫度下的較高的反應速率、由于酶的高 的特異活性和穩(wěn)定性而導致的酶裝載的降低、關于方法構造的增加的靈活性和降低的污染 風險。與嗜常溫的酶相比，熱穩(wěn)定酶通常的穩(wěn)健性也增加了工業(yè)方法中酶的可回收性。
[0026] 另外，本發(fā)明的發(fā)明人梅訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新穎G冊1多膚在減少通常于洗碗機 的過濾器中發(fā)現(xiàn)的纖維性纖維/纖維素纖維是有效的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 接下來本發(fā)明將通過優(yōu)選的實施方案參照附圖更詳細地加W描述。
[0028] 圖1示意性地顯示了在里氏木霉中用于表達cel61基因的盒。cel61基因受里氏 木霉cbhl/cel7A啟動子（cbhl啟動子）控制并且通過使用里氏木霉cbhl/cel7A終止子序 列（Cbhl終止子）保證轉錄的終止。amdS基因作為轉化標記物被包含在里面。
[0029] 圖2顯示了蒸氣爆破的硬木用包含本發(fā)明的G冊1蛋白的酶混合物進行水解的結 果。具有12%干物質的硬木底物在37C、45C、5(TC和55C下用不同的酶混合物在2mg蛋 白每克總固體的劑量進行水解。使用了包含G冊1蛋白太瑞斯梭抱殼霉Tt_GTOlE(混合物 1_TT)、嗜熱枝頂抱菌At_GTOl(混合物1_AT)和白馬蘭諾菌Ma_GTOlA(混合物1_MA)的酶 混合物。酶混合物混合物1的詳細的組成和包含測試的G冊1蛋白的組合物在實施例5中 加W描述。水解72小時后，從副本試管中采樣并且通過HPLC定量，其中確定了葡萄糖的濃 度。
[0030] 圖3顯示了研磨的蘋果/橘子/小麥纖維混合物用包含本發(fā)明的G冊I蛋白的酶 混合物進行水解的結果。測試在稀釋的PH4.0的巧樣酸緩沖液中進行，所述巧樣酸緩沖液 包含約0.5% (w/w)的丙二醇和等量的每一種纖維，具有4g每升的最終固體濃度。在25mg 蛋白每克總固體的劑量添加酶到500ml的搖瓶中?；A的里氏木霉纖維素酶混合物（Roal Oy)用作對照。空白沒有包含任何添加的酶。對于對照、含有72% (w/w)的里氏木霉纖維 素酶混合物和28% (w/w)的G冊1蛋白At_GTOl或Ma_GTOlA的混合物，展示它們在5(TC水 解60分鐘后的纖維素重量的百分比。在圖內包含了標準偏差。
[0031] 序列表
[003引SEQIDNO: 1來自嗜熱枝頂抱菌ALK04245At_GTOl蛋白的膜蛋白酶膚1669, 824的 序列。
[003引SEQIDN0:2來自嗜熱枝頂抱菌ALK04245At_G冊l蛋白的膜蛋白酶膚1763,938的 序列。
[0034]SEQIDN0:3來自嗜熱枝頂抱菌ALK04245At_GTOl蛋白的膜蛋白酶膚431. 7752的 序列。
[003引 SEQIDN0:4來自嗜熱枝頂抱菌ALK04245At_G冊l蛋白的膜蛋白酶膚882.9711 的 序列。
[0036]SEQIDN0:5來自嗜熱枝頂抱菌ALK04245At_GTOl蛋白的膜蛋白酶膚855. 9166的 序列。
[0037]SEQIDN0:6來自白馬蘭諾菌ALK04237Ma_GTOlB蛋白的氨基末端膚#4349的序 列。
[0038]SEQIDN0:7來自白馬蘭諾菌ALK04237Ma_GWlB蛋白的膜蛋白酶膚2130, 813的 序列。
[0039]SEQIDN0:8來自白馬蘭諾菌ALK04237Ma_GWlB蛋白的膜蛋白酶膚1283, 527的 序列。
[0040]SEQIDN0:9來自白馬蘭諾菌ALK04237Ma_GWlB蛋白的膜蛋白酶膚2131，948的 序列。
[0041] SEQIDN0:10來自白馬蘭諾菌ALK04237Ma_G冊lB蛋白的膜蛋白酶膚4466，106的 序列。
[0042]SEQIDNO: 11衍生自膚SEQIDNO: 5的寡核巧酸引物FIB54的序列。
[004引 SEQIDNO: 12衍生自膚SEQIDNO: 1的寡核巧酸引物FIB57的序列。
[0044]SEQIDNO: 13衍生自膚SEQIDNO:6的寡核巧酸引物FIB99的序列。
[0045]SEQIDNO: 14衍生自膚SEQIDN0:9的寡核巧酸引物FIBlOl的序列。
[004引 SEQIDNO: 15寡核巧酸引物FIB35的序列。
[0047]SEQIDNO: 16寡核巧酸引物FIB38的序列。
[0048] 569 10側：17使用引物尸1854669 10側：11)和尸1857(569 10側：12)和嗜熱枝 頂抱菌ALK04245基因組DNA作為模板獲得的PCR片段的序列。
[0049] 569 10側：18使用引物尸1899 669 10側：13)和尸18101669 10側：14)和白馬 蘭諾菌ALK04237基因組DNA作為模板獲得的PCR片段的序列。
[0050] 569 10側：19使用引物尸1835 669 10側：15)和尸1838 669 10側：16)和白馬蘭 諾菌ALK04237基因組DNA作為模板獲得的PCR片段的序列。
[0051]SEQIDN0:20全長嗜熱枝頂抱菌ALK04245cel61基因At_cel61的核巧酸序列。
[0052]SEQIDN0:21全長白馬蘭諾菌ALK04237cel61基因Ma_cel61a的核巧酸序列。
[0053]SEQIDN0:22全長白馬蘭諾菌ALK04237cel61基因Ma_cel6化的核巧酸序列。
[0054] 569 10^:23從全長嗜熱枝頂抱菌4〇(042456冊1蛋白（41_6冊1)推導的氨基酸 序列，包括從Metl到Gln328的氨基酸。
[00巧]SEQIDN0:24從全長白馬蘭諾菌ALK04237G冊l蛋白（Ma_G冊lA)推導的氨基酸序 列，包括從Metl到切S246的氨基酸。
[0056] SEQIDN0:25從全長白馬蘭諾菌ALK04237G冊l蛋白（Ma_G冊lB)推導的氨基酸序 列，包括從Metl到切S225的氨基酸。保藏
[0057] 嗜熱枝頂抱菌ALK04245于2004年9月20號保藏在化salalaan8， 3584CT,化recht,Netherlands的荷蘭微生物菌種保藏中也（Centraa化ureauVoor Schimmelcultures)并且指定保藏編號CBS116240。
[0058]白馬蘭諾菌ALK04237 于 2012 年 3 月 2 號保藏在化salalaan8,3584CT，化recht, Netherlands的荷蘭微生物菌種保藏中也并且指定保藏編號CBS132099。ALK04237菌株之 前于1995年也已經保藏在Oosterstraat1, 3740AGBAARN,Netherlands的荷蘭微生物菌 種保藏中也，保藏編號CBS685. 95。
[0059] 包含質粒PALK2992的大腸桿菌菌株RF9002于2011年12月15號保藏在Inho ffenstrasse7B,D-38124化aunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值eutsche SsmmlungvonMikroorganismenundZeHkulturenGmbh(DSMZ))并且指定保藏編號 DSM25494。
[0060] 包含質粒PALK2993的大腸桿菌菌株RF9091于2011年12月15號保藏在Inhoffe nstrasse7B,D-38124化aunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值SMZ)并且指定 保藏編號DSM25495。
[0061] 包含質粒PALK3374的大腸桿菌菌株RF9150于2011年12月15號保藏在Inhoffe nstrasse7B,D-38124E5raunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值SMZ)并且指定 保藏編號DSM25496。
[0062] 包含質粒PALK3375的大腸桿菌菌株RF9319于2011年12月15號保藏在Inhoffe nstrasse7B,D-38124化aunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值SMZ)并且指定 保藏編號DSM25497。
[0063] 包含質粒PALK3378的大腸桿菌菌株RF9537于2011年12月15號保藏在Inhoffe nstrasse7B,D-38124E5raunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值SMZ)并且指定 保藏編號DSM25498。
[0064] 包含質粒PALK3379的大腸桿菌菌株RF9696于2011年12月15號保藏在Inhoffe nstrasse7B,D-38124化aunschweig,Germany的德國微生物菌種保藏中也值SMZ)并且指定 保藏編號DSM25499。
[0065] 本發(fā)明的詳細描述
[0066] 纖維素是高等植物的主要結構成分。它為植物細胞提供了高抗張強度，幫助它們 抵抗機械壓力和滲透壓。纖維素是目-1，4-葡聚糖，由通過目-1，4-糖巧鍵連接的萄萄糖 殘基的線性鏈組成。纖維二糖是纖維素的最小重復單元。纖維素在細胞壁中堆疊成不同方 向的片層，其嵌入纖維素和木質素的基體中。半纖維素是碳水化合物聚合物的異質性類型， 其主要包含不同的葡聚糖、木聚糖和甘露聚糖。半纖維素由線性骨架組成，其中目-1,4-連 接殘基被通常包含己醜基、葡萄糖酵酸基、阿拉伯糖基及半乳糖基的短側鏈取代。半纖維素 可W與木質素化學交聯(lián)。木質素是各種取代的對輕苯基丙焼單位的復雜交聯(lián)聚合物，其為 細胞壁提供強度W承受機械壓力，同時可保護纖維素不受酶水解。
[0067] 在此使用的"纖維素"或"纖維素材料"涉及包含纖維素、半纖維素和/或木質纖 維素作為顯著組分的任何材料。纖維素通常例如在植物的莖、葉、殼、芙、穗或樹木的葉、分 枝和木材中發(fā)現(xiàn)。纖維素材料可W是但不限于草本材料、農業(yè)殘渣、林業(yè)殘渣、城市固體廢 物、廢紙、和紙漿和紙廠殘渣。纖維素材料的實例包括來自例如棉、亞麻、大麻、黃麻的紡織 纖維和人造紡織纖維如莫代爾纖維、纖維膠和萊賽爾纖維。纖維素材料的實例也包括纖維 性或纖維質類型的殘渣如在自動洗碗機的過濾器中發(fā)現(xiàn)的±。
[0068]"木質纖維素"是纖維素、半纖維素和木質素的組合。其物理性質堅硬、致密且不 易受影響，是生物圈最豐富的生物化學材料。"木質纖維素材料"指包含木質纖維素的任何 材料。該樣的材料是例如；硬木和軟木屑、木漿、銀末、及林業(yè)和木業(yè)廢物；農業(yè)生物質如谷 草、甜菜渣、玉米纖維、玉米枯桿和穗、甘藏渣、莖、葉、殼、芙等；廢品如城市固體廢物、報紙 和辦公室廢紙、例如谷物的研磨廢物；專用能源作物（例如楊柳、楊樹、柳枝稷或草蘆等）。 優(yōu)選實例是玉米纖維、玉米枯桿、柳枝稷、谷草、甘藏渣和木材衍生材料。
[0069]纖維素材料在自然界被很多不同的生物體包括細菌和真菌降解，所述細菌和真菌 制造能夠水解碳水化合物聚合物的酶。降解通常需要不同的纖維素酶按順序作用或同時作 用。包含底物的更復雜的纖維素的降解需要廣泛的各種酶。對于降解過程，纖維素材料可 W被直接使用或經過預處理之后，使用本領域已知的常規(guī)方法進行。
[0070]"纖維素水解酶"或"纖維素酶"是具有"纖維素水解活性"的酶，該表示它們能夠 將有纖維質的底物或其衍生物水解為較小的糖。因此纖維素水解酶包括纖維素酶和半纖維 素酶二者。半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶是水解半纖維素的酶。在此使用的纖維素 酶包括（1)切割內部的目-1，4-糖巧鍵的內切葡聚糖酶巧G、EC3. 2. 1. 4) ; (2)從結晶的纖 維素聚合物鏈的還原端或非還原端切割二糖纖維二糖的外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶 (CBH、EC3. 2. 1. 176,EC3. 2. 1. 91) ; (3)將纖維二糖和其他短的纖維低聚糖水解為葡萄糖 的目-1，4-葡萄糖巧酶炬G、EC3. 2. 1. 21)。CAZY(碳水化合物活性酶）分類系統(tǒng)根據已經 顯示反映共同結構特征的序列相似性將糖基水解酶（GH)酶整理成家族。除此之外，纖維素 酶可W根據它們的一級序列分類到不同的糖基水解酶家族，該通過分析家族的一些成員的 H維結構而得到支持化enrissat1991，Henrissat和Bairoch1993,1996)。
[0071]G冊1多膚具有纖維素水解增強活性，指它們通過具有纖維素水解活性的酶的 催化而"增強纖維素材料的水解"。換而言之，在G冊1多膚存在下用纖維素水解酶糖化 纖維素材料與在僅僅纖維素水解酶存在下相比，增加了纖維素材料的降解。纖維素材料 可W是包含纖維素的任何材料。術語"家族61糖巧水解酶"或"家族G冊1"或"G冊1多 膚"指根據HenrissatB., 1991,Biochem.J. 280:309-316,和HenrissatB.,和Bairoch A.，1996,Biochem.J. 316:695-696落在糖巧水解酶家族6UEC3. 2. 1. 4)的多膚。G冊1蛋白 也指作CEL61蛋白。
[0072] G冊1蛋白包含不具有傳統(tǒng)糖巧水解酶活性位點的核也結構域。此外，G冊1蛋白可 包含糖類結合模塊/結構域，也稱作纖維素結合結構域（CBM/CBD)，其可W位于核也結構域 的N-或C-端。一般來講，CBM介導了蛋白與晶體纖維素的結合，但是對功能活性具有很少 影響或不具有影響。該兩個結構域通常通過柔初的和高度糖巧化的連接區(qū)連接。
[0073] 本發(fā)明基于試圖發(fā)現(xiàn)新穎GH61家族多膚的研究，所述多膚能增強纖維質底物的 水解效率，并且所述多膚即使在升高的溫度下也能夠用于多用途的應用。得到了指作At_ G冊l、Ma_GTOlA和Ma_GTOlB的H種新穎的細61家族多膚（表1)。
[0074] 表1.本發(fā)明的G冊1基因和多膚
[00巧]

【權利要求】
1. GH61多肽，其包含與SEQIDN0:23具有至少75%序列同一性的氨基酸序列、與SEQ IDNO:24具有至少78%序列同一性的氨基酸序列、或與SEQIDNO:25具有至少79%序列 同一性的氨基酸序列、或其能夠增強纖維素材料水解的片段或變體。
2. 權利要求1的GH61多肽，其中所述多肽與SEQIDN0:23、SEQIDN0:24或SEQID NO: 25或其能夠增強纖維素材料水解的片段具有至少90%同一性、優(yōu)選地具有至少95%同 一性、更加優(yōu)選地具有至少98%同一性。
3. 權利要求1的GH61多肽，其中所述多肽能夠從嗜熱枝頂孢菌（Acremonium thermophilum)或白馬蘭諾菌（Melanocarpusalbomyces)獲得、優(yōu)選地能夠從嗜熱枝頂孢 菌CBS116240或白馬蘭諾菌CBS132099獲得。
4. 分離的多核苷酸，其選自： a) 包含如在SEQIDNO:20、21或22中所示的編碼序列的多核苷酸； b) 編碼權利要求1的多肽的多核苷酸； c) 編碼由a)或b)的多核苷酸編碼的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段能增強纖 維素材料的水解；和 d) 包含與a)或b)的多核苷酸序列的核苷酸序列簡并的核苷酸序列的多核苷酸； 或這樣的多核苷酸的互補鏈。
5. 權利要求4的多核苷酸，其包含在具有選自DSM25497、DSM25495和DSM25499的 保藏編號的微生物中所含有的基因。
6. 載體，其包含權利要求4或5的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接到能夠指導權 利要求1的GH61多肽表達的調控序列上。
7. 包含權利要求6的載體的宿主細胞。
8. 制備權利要求1的GH61多肽的方法，所述方法包括步驟： 用編碼所述多肽的表達載體轉化宿主細胞， 在允許所述多肽表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞，和 任選地回收和純化所述多肽。
9. 包含權利要求1至3任一項的GH61多肽的酶制劑。
10. 權利要求9的酶制劑，其還包括至少一種酶，所述酶選自：纖維二糖水解酶；內切葡 聚糖酶；3 -葡糖苷酶；3 -葡聚糖酶；木葡聚糖酶；木聚糖酶；3 -木糖苷酶；纖維二糖脫氫 酶；甘露聚糖酶邛_甘露糖苷酶；a_葡糖苷酸酶；乙酰木聚糖酯酶；a_阿拉伯呋喃糖苷 酶；a-半乳糖苷酶；果膠酶；包括內切和外切-a-L-阿拉伯糖酶、內切和外切-半乳糖醛 酶、內切果膠酶、果膠酸裂解酶、和果膠酯酶；酚酯酶；包括木質素過氧化物酶的木質素酶； 錳依賴性過氧化物酶；過氧化氫生成酶；昆布多糖酶；殼聚糖酶；阿魏酸酯酶和具有或不具 有介體的漆酶。
11. 處理纖維素材料的方法，其中所述方法包括將纖維素材料與權利要求1至3任一項 的GH61多肽或權利要求9或10的酶制劑反應。
12. 權利要求11的方法，其中所述方法包括通過用權利要求1至3任一項的多肽或權 利要求9或10的酶制劑與洗碗機內部的至少部分接觸而清潔洗碗機的內部。
13. 權利要求11的方法，其中所述纖維素材料是紡織材料、在動物飼料中使用的植物、 或來自木材的紙漿或二級纖維。
14. 權利要求1至3任一項的多肽或權利要求9或10的酶制劑用于處理生物質、和在 生物燃料、淀粉、紡織品、清潔劑、紙漿和紙、食物、飼料或飲料工業(yè)中的應用。
15. 權利要求14的應用，用于紡織材料例如織物或衣服或紗線的生物整理。
16. 權利要求14的應用，用于牛仔布的生物打磨。
17. 權利要求14的應用，用于清潔洗碗機機器的內部。
18. 具有保藏編號 DSM 25497、DSM 25495 或 DSM 25499 的大腸桿菌（Escherichia coli)菌株。
19. 清潔劑組合物，所述組合物包括權利要求1至3任一項的多肽或權利要求9或10 的酶制劑。
20. 權利要求19的清潔劑組合物，其中所述組合物是清潔洗碗機機器的組合物。
21. 用于改進清潔劑組合物的織物護理性質或紡織品清潔效果的方法，所述方法包括 在所述清潔劑組合物中添加權利要求1至3任一項的多肽或權利要求9或10的酶制劑。
22. 動物飼料，其包括權利要求1至3任一項的多肽或權利要求9或10的酶制劑。
【文檔編號】C11D3/386GK104379736SQ201380029931
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年5月24日 優(yōu)先權日:2012年6月7日
【發(fā)明者】蘇珊娜·梅基寧, 卡里·云圖寧, 亞歷山大·科曼德, 基姆·朗費爾德, 亞里·韋赫曼佩雷, 泰爾?！て绽瓕? 申請人:羅爾公司