二烯丙基二硫在制備生精細(xì)胞抗輻射損傷藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了二烯丙基二硫(DADS)在制備預(yù)防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明明確了DADS能降低輻射對小鼠精子活力的影響，能有效對抗輻射對精子的損傷反應(yīng)，能保護(hù)睪丸組織細(xì)胞中的部分蛋白質(zhì)免受輻射的損傷，能有效對抗輻射對睪丸組織細(xì)胞脂質(zhì)的損傷反應(yīng)，能有效降低輻射對睪丸組織細(xì)胞核酸的損傷反應(yīng)，對于預(yù)防和治療輻射對生殖系統(tǒng)的損傷具有顯著的意義。而且DADS低毒性，容易獲得，成本低，是脂溶性分子，易穿透血?腦屏障、血?睪屏障及血?氣屏障等生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達(dá)的生理部位發(fā)揮作用，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
二烯丙基二硫在制備生精細(xì)胞抗輻射損傷藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及二烯丙基二硫在制備生精細(xì)胞抗 輻射損傷藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著航天科技、核工業(yè)技術(shù)及核醫(yī)學(xué)的發(fā)展，相關(guān)職業(yè)人員、腫瘤病人及普通大眾 暴露于電離輻射的危險逐漸增大。電離輻射對機(jī)體造成的各種損傷反應(yīng)中以骨髓抑制、肺 損傷、消化系統(tǒng)損傷、免疫系統(tǒng)損傷及生殖系統(tǒng)損傷最為嚴(yán)重。因此，針對這些電離輻射損 傷而進(jìn)行的輻射防護(hù)研究變得越來越重要。除了影響受照射的本體以外，電離輻射通過對 生殖細(xì)胞的致畸作用還能影響其子代的生命活動。因此生殖系統(tǒng)輻射損傷的后期效應(yīng)遠(yuǎn)甚 于其他組織器官的輻射損傷。
[0003] 輻射防護(hù)劑是生物體受輻射前給予其某些化學(xué)藥物以減輕機(jī)體輻射損傷反應(yīng)并 促進(jìn)損傷組織恢復(fù)的藥物。輻射防護(hù)劑最常用于從事核工業(yè)技術(shù)的人員、航天工作者及腫 瘤放療的病人。盡管某些藥物具有輻射防護(hù)效果，但由于其毒性副作用的原因而并未用于 人體[Hall EJ. Radiobiology for Radiologist,4th ed.Philadelphia: Lippincott Co . 1994:165-190.]。在醫(yī)療領(lǐng)域，輻射防護(hù)劑積極用于腫瘤放療也并未受到足夠關(guān)注。因 此尋找毒性低、易被人們接受而具有輻射防護(hù)效應(yīng)的藥物顯得至為關(guān)鍵。
[0004] 含硫有機(jī)物二烯丙基二硫(DADS)是大蒜素中的一種活性物質(zhì)，淡黃色，溶于油而 不溶于水，分子式為C6H 1QS2,結(jié)構(gòu)式為.·~分子量146.28。經(jīng)研究表明，DADS對12C6+束 照射小鼠的肝臟組織具有輻射防護(hù)效應(yīng)[許帥，張紅，劉陽，等.二烯丙基二硫?qū)?12C6+離子束 輻照損傷小鼠的保護(hù)作用研究[J].原子核物理評論，2013,30(1) :79-83.]。大蒜是生活農(nóng) 副產(chǎn)品，自古就被人們使用于食品添加劑。因此DADS用于輻射防護(hù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)：低毒性， 已被無數(shù)勞動者生活實(shí)踐證實(shí)；極易生產(chǎn)獲取，使用者眾多；脂溶性分子，易穿透血-腦屏 障、血-睪屏障及血-氣屏障等生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達(dá)的生理部位發(fā)揮作用； 對于腫瘤放療病人最為重要的是，DADS對腫瘤具有輻射增敏效應(yīng)而沒有輻射防護(hù)作用[許 帥，張紅，劉陽，等.二烯丙基二硫?qū)蒘180肉瘤小鼠的輻射增敏效應(yīng)[J].激光生物學(xué)報， 2013，22(3): 60-65.]。作為食物療法，DADS在輻射防護(hù)中的應(yīng)用易被人們接受。
[0005] 但是，目前為止，關(guān)于DADS對睪丸組織的輻射防護(hù)效應(yīng)研究目前尚未見文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有睪丸組織的輻射防護(hù)技術(shù)的不足，基于生殖 系統(tǒng)輻射防護(hù)的重要性，建立動物輻射損傷模型，通過觀察睪丸組織、精子的活力及形態(tài)， 檢測蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及遺傳物質(zhì)的損傷指標(biāo)，探討DADS對雄性小鼠生精細(xì)胞的輻射防護(hù)作用。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供二烯丙基二硫(DADS)在制備生精細(xì)胞抗輻射損傷藥物中的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 二烯丙基二硫(DADS)在制備預(yù)防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應(yīng) 用。
[0010] 具體地，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠降低輻射對精子活力的影響的藥 物中的應(yīng)用。
[0011] 所述應(yīng)用是指二稀丙基二硫在制備能夠?qū)垢Ｉ鋵拥闹禄饔玫乃幬镏械?應(yīng)用。
[0012] 所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠保護(hù)睪丸組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)免受輻射 的損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠有效對抗輻射對睪丸組織細(xì)胞脂質(zhì)的損 傷的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠有效對抗輻射對睪丸組織細(xì)胞核酸的損 傷的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 另外，優(yōu)選地，所述輻射是指X射線輻射。
[0016] 優(yōu)選地，所述睪丸組織具體是指睪丸組織中的生精細(xì)胞和/或精子。
[0017] -種能夠預(yù)防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)，所述藥物包含有二烯丙基二硫(DADS)。
[0018] 優(yōu)選地，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，可制備成不同的劑型。
[0019] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明公開了二烯丙基二硫?qū)ΣG丸組織抗輻射損傷的應(yīng)用，對于輻射對生殖系統(tǒng) 的損傷具有顯著的預(yù)防和治療作用，具有很好的應(yīng)用前景和醫(yī)療意義。
[0021] 而且，DADS是大蒜素中的一種活性物質(zhì)，大蒜是生活農(nóng)副產(chǎn)品，自古就被人們使用 于食品添加劑，因此DADS用于輻射防護(hù)具有諸多優(yōu)點(diǎn):低毒性，已被無數(shù)勞動者生活實(shí)踐證 實(shí);極易生產(chǎn)獲取，使用者眾多；脂溶性分子，易穿透血-腦屏障、血-睪屏障及血-氣屏障等 生理性屏障，起到水溶性藥物難以到達(dá)的生理部位發(fā)揮作用。
【附圖說明】
[0022]圖1為DADS對輻照小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響;HE染色，放大倍數(shù):200倍；圖中，A 為對照組(溶劑+〇Gy)、B為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)、C為照射組(溶劑+4Gy)、D為低濃度 藥物+照射組（l〇mg/kg DADS+4Gy)、E為中濃度藥物+照射組（20mg/kg DADS+4Gy)、F為高濃 度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0024]除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0025] 實(shí)施例1 [0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1實(shí)驗(yàn)材料
[0028] DADS購自于 Sigma公司。
[0029] 丙二醛(MDA)試劑盒、總羰基試劑盒及8-羥基脫氧鳥苷(S-OHdG)試劑盒購自于碧 云天生物技術(shù)研究所。
[0030] BCA試劑盒購于Thermo公司。其余為分析純。
[0031] 1.2實(shí)驗(yàn)動物
[0032]健康雄性昆明小鼠，標(biāo)準(zhǔn)體重（18~22)g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號： SCXK(粵）2013-0002 )。
[0033]飼養(yǎng)環(huán)境溫度（18~25) °C。安靜環(huán)境飼養(yǎng)，動物自由飲食飲水，正常晝夜節(jié)律。飼 養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0034] 動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)學(xué)校倫理委員會批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。
[0035] 1.3照射條件
[0036]腫瘤放射治療儀器Elekta-Synergy提供X射線。照射參數(shù)：能量為6MV，源皮距照 射，深度1 · 5cm，射野28 X 18cm2，劑量4Gy，時間0 · 7min。照射方式為單次全身照射。
[0037] 1.4實(shí)驗(yàn)分組
[0038] (1)實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為以下6組，每組8只小鼠：
[0039] A組為對照組(溶劑+OGy)，
[0040] B組為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)，
[00411 C組為照射組(溶劑+4Gy)，
[0042] D組為低濃度藥物+照射組（10mg/kg DADS+4Gy)，
[0043] E組為中濃度藥物+照射組(20mg/kg DADS+4Gy)，
[0044] F組為高濃度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
[0045] (2)溶解稀釋DADS的溶劑為花生油。照射前Ih腹腔注射給藥。注射量控制為0.2ml/ 只。
[0046] 對照組與照射組分別注射0.2ml/只的溶劑。
[0047] 1.5病理組織切片
[0048] 照射后12h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出一側(cè)睪丸，剪切部分用福爾馬林固定后送 往肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院制作HE病理切片。
[0049] 1.6精子活力、精子畸形率檢測
[0050] 照射后12h，頸椎脫臼法處死小鼠，取出雙側(cè)附睪置于生理鹽水中，剪碎制成精子 懸液，35 °C孵育20min后注入35 °C預(yù)熱的血細(xì)胞計數(shù)板中，高倍鏡下觀察100個精子的活動 情況。精子的活動度分4級：I精子成直線快速游動，II精子不成直線游動而且速度較慢，III 精子原地活動，IV精子靜止。
[0051] 采用精子活力計算公式：（1+11+111)/(1+11+111+1￥)\100%[01&即（：，01611￥1'， Yeh SD，et al . Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice lacking the androgen receptor in Sertoli cells[J].Proc.Natl.Acad.Sci·2004,101:6876-81·]〇
[0052] 取制成的精子懸液制作涂片、甲醇固定自然晾干，I %伊紅染色lh，清水沖洗、干 燥。顯微鏡下觀察1000個精子計算精子畸形率，畸形率用百分比表示?；尉臃譃轭^、體 及尾形態(tài)畸形。頭畸形有雙頭、巨頭、無定型;體畸形有粗大、折裂、不完整;尾畸形有雙尾、 卷尾、缺尾。
[0053] 1.7蛋白質(zhì)總羰基含量、MDA及8-OHdG檢測
[0054] 取小鼠剩余的全部睪丸用生理鹽水制成10 %的組織勻漿，4°C下3500r/min離心 lOmin，取上清液分裝冷凍儲存?zhèn)溆谩Ｈ溆蒙锨逡簻y定蛋白質(zhì)總羰基含量(蛋白質(zhì)氧化損 傷指標(biāo)）、MDA(脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo))及S-OHdG(核酸氧化損傷指標(biāo))等損傷指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)操作方 法嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。蛋組織白質(zhì)濃度用BCA試劑盒測定。
[0055] 1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
[0056] SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有數(shù)值表示為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(means 土 SD )，各組 數(shù)據(jù)采用均值單因素檢驗(yàn)。取P〈〇.05代表顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
[0057] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0058] 2.1 DADS對輻照小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響如附圖1所示，HE染色，放大倍數(shù):200 倍。圖1中，A為對照組(溶劑+OGy)、B為藥物組(40mg/kg DADS+OGy)、C為照射組(溶劑+4Gy)、 D為低濃度藥物+照射組（10mg/kg DADS+4Gy)、E為中濃度藥物+照射組（20mg/kg DADS+ 4Gy)、F為高濃度藥物+照射組(40mg/kg DADS+4Gy)。
[0059] 睪丸組織生精小管由精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及精子等 5至6層細(xì)胞構(gòu)成。
[0060] 如圖1所示，與A組相比，C組生精小管細(xì)胞層次嚴(yán)重受損，表明X射線造成了生精小 管上皮細(xì)胞的大量丟失。與C組比，D組生精小管在形態(tài)學(xué)上細(xì)胞層次出現(xiàn)了增多，表明DADS 能降低X射線對小鼠生精小管上皮細(xì)胞的丟失。E組與F組生精小管上皮細(xì)胞層次增多更為 顯著。與A組相比，B組無形態(tài)學(xué)改變，說明40mg/kg DADS沒有造成小鼠生精小管上皮細(xì)胞丟 失。
[0061 ] 2.2 DADS對輻照小鼠精子活力的影響
[0062]如表1所示，與A組相比，C組精子活力顯著下降(p〈0.05)，顯示X射線嚴(yán)重?fù)p傷了精 子的活力。D組與C組比，精子活力顯著上升(ρ〈0·05)，表明DADS能降低X射線對小鼠精子活 力的影響，并且隨著藥物濃度增加輻射防護(hù)效果更好。E組與F組相比，精子活力無顯著性差 異(ρ>0.05)。與A組相比，B組精子活力并沒有下降，說明40mg/kg DADS沒有造成小鼠精子活 力下降。
[0063] 表1 DADS對福照小鼠精子活力的影響(n = 8,means土SD)
[0065] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0066] 2.3 DADS對輻照小鼠精子畸形率的影響
[0067]如表2所示，C組與A組比，精子畸形率顯著性增加 (p〈0.05)，表明X射線導(dǎo)致大量精 子畸形。與C組相比，D組精子畸形率顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS能有效對抗X射線對精 子的損傷反應(yīng)。E組與F組相比精子畸形率無差異性(p>0.05)』組與A組之間精子畸形率無 顯著性差異(P>〇.〇5)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠精子畸形率上升。
[0068] 表2 DADS對輻照小鼠精子畸形率的影響(n = 8，means土SD)
[0070] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0071] 2.4 DADS對輻照小鼠睪丸組織中蛋白質(zhì)羰基含量的影響
[0072]如表3所示，C組與A組比，蛋白質(zhì)羰基含量顯著性增加 (p〈0.05)，說明X射線損傷了 睪丸組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。與C組相比，D組蛋白質(zhì)羰基含量顯著性下降(p〈0.05)，表明DADS 能保護(hù)部分蛋白質(zhì)免受X射線的損傷。E組與F組相比蛋白質(zhì)羰基含量無差異性(p>0.05)』 組與A組之間蛋白質(zhì)羰基含量無顯著性差異(p>0.05)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸 組織蛋白質(zhì)羰基含量上升。
[0073] 表3 DADS對輻照小鼠睪丸組織蛋白質(zhì)羰基含量的影響(n = 8，means土SD)
[0075] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0076] 2.5 DADS對輻照小鼠睪丸組織中MDA含量的影響
[0077] 如表4所示，C組與A組比，MDA含量顯著性增加 (p〈0.05)，表明X射線對大量脂質(zhì)造 成了損傷。與C組相比，D組MDA含量顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS有效的對抗了 X射線對脂 質(zhì)的損傷反應(yīng);E組與F組相比MDA含量無差異性(p>0.05) 3組與A組之間MDA含量無顯著性 差異(p>0.05)，提示40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸組織MDA含量上升。
[0078] 表4 DADS對輻照小鼠睪丸組織MDA的影響（n = 8，means土SD)
[0080] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組
[0081] 2.6 DADS對輻照小鼠睪丸組織中8-OHdG含量的影響
[0082] 如表5所示，C組與A組比，8-OHdG含量顯著性增加(p〈0.05)，提示X射線對核酸造成 了損傷反應(yīng)。與C組相比，D組S-OHdG含量顯著性下降(p〈0.05)，說明DADS能有效降低X射線 對核酸的損傷反應(yīng)。E組與F組相比8-OHdG含量無差異性(p>0.05)。B組與A組之間8-OHdG含 量無顯著性差異(P>〇.〇5)，表明40mg/kg DADS未造成小鼠睪丸組織8-OHdG含量上升。
[0083] 表5 DADS對輻照小鼠睪丸組織8-OHdG的影響(n = 8，means土SD)
[0085] ap〈0.05vs A組；bp〈0.05vs C組。
【主權(quán)項】
1. 二烯丙基二硫在制備預(yù)防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠降 低輻射對精子活力的影響的藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠?qū)?抗輻射對精子的致畸作用的藥物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠保 護(hù)睪丸組織細(xì)胞中的蛋白質(zhì)免受輻射的損傷的藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠有 效對抗輻射對睪丸組織細(xì)胞脂質(zhì)的損傷的藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指二烯丙基二硫在制備能夠有 效對抗輻射對睪丸組織細(xì)胞核酸的損傷的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述輻射是指X射線輻射。8. 根據(jù)權(quán)利要求1、4~6任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述睪丸組織具體是指睪丸組 織中的生精細(xì)胞和/或精子。9. 一種能夠預(yù)防和/或治療輻射對睪丸組織的損傷的藥物，其特征在于，所述藥物包含 有一稀丙基一硫D
【文檔編號】A61P39/00GK106074467SQ201610614453
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月28日 公開號201610614453.2, CN 106074467 A, CN 106074467A, CN 201610614453, CN-A-106074467, CN106074467 A, CN106074467A, CN201610614453, CN201610614453.2
【發(fā)明人】許帥, 鄒錦慧, 廖偉雄, 李捷
【申請人】肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校