一種添加劑及包含該添加劑的化妝品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種積雪草提取物，其中包括質(zhì)量百分比為20％?99％的羥基積雪草苷。本發(fā)明還提供了一種積雪草提取物的制備方法以及在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。該積雪草提取物采用改進(jìn)提取工藝，添加的溶劑無毒或易揮發(fā)，減少了純化步驟的工作量；增加了純化步驟，得到的積雪草提取物中羥基積雪草的含量更高。本發(fā)明提供的積雪草提取物，具有優(yōu)異的抗衰老性能，以及修復(fù)受損細(xì)胞的能力，此外，還具有優(yōu)良的保濕性能和細(xì)胞抗炎癥能力，可以作為優(yōu)良的復(fù)合型添加劑加入到化妝品中。
【專利說明】
一種添加劑及包含該添加劑的化妝品
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種添加劑及其制備方法和包含該添加劑的化妝 品，尤其涉及一種積雪草提取物及其制備方法和在化妝品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 積雪草為傘形科植物積雪草(Centella asiatica L.Urban)的干燥全草或帶根全 草。性寒，味苦、辛，具有清熱利濕、解毒消腫之功效，臨床上用于跌打損傷、流行性腦脊髓膜 炎、傳染性肝炎等。積雪草屬(Centel la)植物，全世界約有20種，主要分布于南北半球熱帶 和亞熱帶地區(qū)，我國僅產(chǎn)積雪草1中，廣布于華東、華南、中南及西南諸省區(qū)，從其生長(zhǎng)環(huán)境 看，積雪草喜生長(zhǎng)于陰濕的草地或水溝邊。
[0003] 積雪草成分多為三萜類化合物，其中積雪草苷(Asiaticoside)及羥基積雪草苷 (Madecassoside)的藥理活性豐富，臨床作用廣泛，為積雪草中的主要活性成分，一般也將 該兩者的含量作為積雪草質(zhì)量的指標(biāo)。
[0004] 盧茂芳等(積雪草提取純化工藝的研究，湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007年第27卷第1 期第16-19頁)采用2次水提法對(duì)積雪草的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，第一次加10倍量水提取2h，第 二次加8倍量水提取1.5h。使用該方法可以節(jié)省原料，縮短工時(shí)，降低成本，利于工業(yè)化大生 產(chǎn)。韓偉等（酶法提取積雪草苷，南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009年第31卷第3期第 18-22頁)采用酶提法提取積雪草中的積雪草苷，篩選出酶解的最優(yōu)工藝參數(shù)為:纖維素酶 與底物積雪草質(zhì)量比未1:50，積雪草與溶劑水的質(zhì)量比為1:25，在pH = 6.0，酶解溫度為40 °C的條件下酶解1.5h。酶解法提取速率快，工藝條件溫和，且活性組分的得率高。
[0005] 此外，高效液相色譜法也能分離得到高純度的積雪草苷和羥基積雪草苷。雖然現(xiàn) 有的積雪草的提取方法較多，但其主要用于醫(yī)藥用途，在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用還比較少，而且 也未見到高純度羥基積雪草苷提取工藝的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種積雪草提取物，并研究了該提取物在 化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面在于提供一種積雪草提取物，所述積雪草提取物中所述羥基 積雪草苷的質(zhì)量百分含量為20%-99%，優(yōu)選為40-90%，如50%、80%等。
[0008] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述積雪草提取物中還包括積雪草苷、積雪草酸 和羥基積雪草酸中的任意一種或其組合。
[0009] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述積雪草苷的含量為0-20%，優(yōu)選為0.5%-15%，如 2%、10% 等。
[0010] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述積雪草提取物中還可以包括左施松樟酮 (pinocamphone)，左旋薄荷酮(menthone)，胡薄荷酮（pulelgone)，α-薇?。é?pinene)，β_薇 稀(β-pinene)，棕檬?。↖imonene)，1-8-桉葉素（I，8_cineole)，對(duì)-聚傘花素(p-cymene)， 異薄荷酮（i somenthone)，異松棒酮（i sopinocamphone)，芳棒醇（Iinalool)，薄荷醇 (mentholk)及α-松油醇(α-terpineol)中的任意一種或幾種組合。
[0011] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述積雪草提取物可以是水提物、醇提物、油提 物、超臨界CO2提取物中的任意一種或幾種的組合。
[0012] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述積雪草原料中重金屬的含量小于lOOppm，優(yōu) 選為小于50ppm，如30ppm，更優(yōu)選為小于lOppm。
[0013] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述醇提物優(yōu)選為乙醇提取物、水提取物、臨界 CO2提取物中的一種或幾種組合。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)方面在于提供一種積雪草提取物的制備方法，所述方法包括如下 步驟：
[0015] 步驟1、取清洗后的積雪草粉末，向其中加入5-30體積倍量的溶劑浸提至少2次，每 次0.5h_3.5h，混合每次浸提得到的提取液，得到混合提取液；
[0016] 步驟2、將步驟1得到的混合提取液濃縮，得到濃縮液，所述濃縮液即為所述積雪草 提取物。
[0017] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中將所述混合提取液在I -20kPa、20-60 °C條 件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至所述積雪草粉末的1-10倍體積。
[0018] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中還可以包括將所述濃縮液純化、干燥步驟 中的任意一個(gè)或其組合。
[0019] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中還可以包括將濃縮液以500-300r/min轉(zhuǎn) 速離心2-20min，取上清液，得到所述積雪草提取物。
[0020] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟2中還可以包括將所述濃縮液流過層析柱進(jìn) 行純化，所述層析柱為大孔吸附樹脂、液相色譜柱中的任意一種或幾種組合。
[0021] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述大孔吸附樹脂純化過程的條件為pH值= 3-6， 溫度為25°C_50°C，優(yōu)選為30°C_40°C，洗脫劑的流速為2-4BV/h。
[0022] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述大孔吸附樹脂的型號(hào)為AB-8型、D-101、ADS-5 中的任意一種或幾種。
[0023] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述液相色譜柱純化過程的條件為pH值= 3-6,溫 度為25°C_50°C，優(yōu)選為30°C_40°C，洗脫劑的流速為2-4BV/h。
[0024] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述液相色譜柱為C18柱。
[0025]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述洗脫過程中，以20%_80%的乙醇水溶液作為 洗脫劑，所述洗脫劑的流速為2_4BV/h，洗脫溫度為30°C-50°C。
[0026] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中所述的浸提工藝中的溶劑為水、體積含量 為30%-90%乙醇、超臨界CO2等中的任意一種或幾種組合，優(yōu)選為水和/或乙醇及其組合。
[0027] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中，所述積雪草提取物每次的浸提條件為： 浸泡2-5h，在50 °C-120 °C，提取 1 · 5-3h。
[0028] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，步驟1中，所述積雪草在0.8-1.3MPa壓力下提取， 優(yōu)選為 1 · 0-1 · 2MPa，如 1 · IMPa。
[0029] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述干燥的方法為電加熱干燥、噴霧干燥、熱空氣 干燥中的任意一種或幾種組合，優(yōu)選為噴霧干燥。
[0030] 本發(fā)明的第三個(gè)方面在于提供上述任意一種積雪草提取物的應(yīng)用。
[0031] 所述積雪草提取物優(yōu)選為施用于皮膚外表面，更優(yōu)選為應(yīng)用于制備涂覆于皮膚外 表面的制品。
[0032] 其中，本發(fā)明所述積雪草提取物應(yīng)用于制備日化用品，優(yōu)選為應(yīng)用于制備化妝品 和/或護(hù)膚品。
[0033] 本發(fā)明的第四個(gè)方面在于提供一種包含上述任意一種積雪草提取物的日化用品， 優(yōu)選為包含上述任意一種積雪草提取物的化妝品和/或護(hù)膚品，更優(yōu)選為所述化妝品和/或 護(hù)膚品中，還可以包括營養(yǎng)性添加劑。
[0034] 其中，所述營養(yǎng)性添加劑可以是選自如下組分中的一種或幾種組合:尿酸、乳清 酸、蘆薈苷、壬二酸、松香酸、松蘿酸、殼聚糖、絲肽、絲素、卵磷脂、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、珍珠 粉、膠原蛋白、膠原水解物、透明質(zhì)酸及其鹽、蛋膜素、植物留醇、氯化溶菌酶、硫酸軟骨素 鈉、蜂乳、蜂膠、蜂蜜、甘草酸、甘草次酸、 γ -亞麻酸、曲酸及其酯、赤霉酸、甘氨酸、L-天冬氨 酸及其鹽、L-胱氨酸及其鹽、DL-丙氨酸、L-絲氨酸、DL-絲氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸、L-賴 氨酸鹽酸鹽、L-蘇氨酸、肌醇、麥芽醇、泛酸鹽、D-泛醇、視黃醇醋酸酯、尿囊素、吡哆醇鹽酸 鹽、可的松、煙酰胺、維生素、胸腺素、茜草素、檸檬烯、黃芩黃素、脫氧膽酸、愈瘡木萸、橙皮 素、鞣酸、二硫化硒、茶皂苷、檸檬酸三乙酯、丁基羥基甲苯、植酸、聚氯化二甲基二烯丙基 銨。
[0035]作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品和/或護(hù)膚品中，所述積雪草提取物的 含量為0.001%-60%，如0.003%，40%，優(yōu)選為0.005%-30%，如 10%、20%等。
[0036] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品選自以下形式中的任意一種或幾種組 合:霜?jiǎng)⑷閯?、溶液劑、膜劑、氣霧或噴霧劑等。
[0037] 作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述化妝品中還包括輔料，所述輔料選自：溶劑、 增溶劑、防腐劑、抗氧劑、PH調(diào)節(jié)劑、促滲劑、脂質(zhì)體、保濕劑、增稠劑、螯合劑、膚感調(diào)節(jié)劑、 表面活性劑、乳化劑、推進(jìn)/拋射劑、香精、色素等中的任意一種或幾種組合。
[0038] 本發(fā)明提供的積雪草提取物，采用改進(jìn)提取工藝，添加的溶劑無毒或易揮發(fā)，減少 了純化步驟的工作量;增加了純化步驟，得到的積雪草提取物中羥基積雪草的含量更高。本 發(fā)明提供的積雪草提取物，具有優(yōu)異的抗衰老性能，以及修復(fù)受損細(xì)胞的能力，此外，還具 有優(yōu)良的保濕性能和細(xì)胞抗炎癥能力，可以作為復(fù)合型添加劑加入到化妝品中。
【附圖說明】
[0039] 圖1為自然狀態(tài)下積雪草提取物對(duì)I型膠原蛋白分泌的影響；
[0040] 圖2為過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞存活率的影響；
[0041 ]圖3為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響；
[0042] 圖4為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響；
[0043] 圖5為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-I含量的影響；
[0044] 圖6為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HaCat細(xì)胞LOR含量的影響；
[0045] 圖7為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HAS3含量的影響；
[0046] 圖8為積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞HA含量的影響；
[0047]圖9為不同種類細(xì)菌比例對(duì)THP-I細(xì)胞IL-Ιβ濃度的影響；
[0048] 圖10為積雪草提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌損傷的THP-I細(xì)胞中IL-Ιβ含量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 積雪草提取物的制備
[0050] 實(shí)施例一
[00511取重金屬含量為5ppm的積雪草原料10kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到煎鍋中，然后向煎鍋中加入去離子水100L，浸泡2h，加熱煮沸，并保持 微沸2h，提取結(jié)束后，再加入100L去離子水，浸泡2h，加熱煮沸，并保持微沸2h，提取結(jié)束后， 混合兩次的提取液，得到混合提取液。于45 °C、5kPa條件下旋蒸濃縮混合提取液至5kg，得到 積雪草提取物。
[0052] 使用(：18液相色譜柱，以體積比乙腈:2_31/1^環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)口!1 = 4)=24:76為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為20%，積雪草苷的質(zhì)量含量為 2.5%，積雪草總苷的含量為30%。
[0053]該積雪草提取物中鉛的含量為0.2 2 p p m，鎘的含量為0.31 p p m，砷的含量為 0.23ppm，銅的含量為1.85ppm，汞的含量未檢出。
[0054] 實(shí)施例二
[0055]取重金屬含量為IOppm的積雪草原料8kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到煎鍋中，然后向煎鍋中加入去離子水80L，浸泡1.5h，加熱煮沸，并保持 微沸2.5h，提取結(jié)束后，再次加入64L去離子水，浸泡2h，加熱煮沸，并保持微沸2h，提取結(jié)束 后混合兩次的提取液，于5kPa、微沸條件下旋蒸濃縮至5kg，離心，得到上清液，將上清液經(jīng) 過DlOl大孔吸附樹脂純化，調(diào)節(jié)濃縮液pH值=4,在15°C吸附3h，吸附飽和，然后于35°C，無 水乙醇、95 %乙醇水溶液、80 %乙醇水溶液梯度洗脫，其中無水乙醇優(yōu)選為食品級(jí)乙醇，食 品級(jí)乙醇的用量為上清液的2倍體積。
[0056]向純化后的上清液中加入IOg市售羥基積雪草苷，于常壓、(TC下靜置結(jié)晶12h，過 濾得濾餅，濾餅經(jīng)熱空氣干燥至恒重，得到半成品，該半成品經(jīng)內(nèi)包裝、外包裝后得到積雪 草提取物。
[0057] 使用(：18液相色譜柱，以體積比乙腈:2_31/1^環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)口!1 = 4)=24:76為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為80%，積雪草苷的質(zhì)量含量為 6.5%，積雪草總苷的含量為95%。
[0058]該積雪草提取物中鉛的含量為0.28ppm，鎘的含量為0.26ppm，砷的含量為 0.2]^口111，銅的含量為1.63口口111，萊的含量未檢出。
[0059] 實(shí)施例三
[0060] 取重金屬含量為Sppm的積雪草原料20kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到密封煎鍋中，然后向煎鍋中加入去離子水200L，浸泡2.5h，將密封煎鍋 升壓至1.2MPa，加熱煮沸，并保持微沸2h，調(diào)節(jié)系統(tǒng)壓力至l.OIMPa，過濾，得到一次濾液和 一次濾渣。向?yàn)V渣中再次加入180L去離子水，浸泡2h，將密封煎鍋升壓至1.2MPa，加熱煮沸， 并保持微沸2.5h，調(diào)節(jié)系統(tǒng)壓力至1.0 lMPa，過濾，得到二次濾液和二次濾渣。
[0061] 重復(fù)上述提取方法2次，混合每次的提取液，于50°C、8kPa條件下旋蒸濃縮至5kg， 離心，得到上清液，將上清液經(jīng)過色譜柱純化，純化過程的工藝條件為：30°C、乙醇為洗脫 劑、pH值=5，其中乙醇優(yōu)選為食品級(jí)乙醇，食品級(jí)乙醇的用量為上清液的2倍體積。
[0062]向純化后的上清液中加入IOg市售羥基積雪草苷，于常壓、-4 °C下靜置結(jié)晶12h，過 濾得濾餅，濾餅經(jīng)80°C熱空氣干燥至恒重，得到積雪草提取物。
[0063 ] 使用C18液相色譜柱，以體積比乙腈:2mmo I /U環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)pH = 4 )= 24:7 6為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為60%，積雪草苷的質(zhì)量含量為10%， 積雪草總苷的含量為85%。
[0064] 該積雪草提取物中鉛的含量為0.28ppm，鎘的含量為0.23ppm，砷的含量為 0.24ppm，銅的含量為1.23ppm，汞的含量未檢出。
[0065] 實(shí)施例四
[0066]取重金屬含量為5ppm的積雪草原料20kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到煎鍋中，然后向煎鍋中加入70%的乙醇水溶液150L，浸泡2h，于I. IMPa 壓力下，加熱煮沸，并保持微沸2h，過濾，得到一次濾液和一次濾渣，向?yàn)V渣中加入200L去離 子水，浸泡2h，于I. IMPa壓力下，加熱煮沸，并保持微沸2.5h，過濾，得到二次濾液和二次濾 渣。
[0067]將二次濾液和一次濾液混合后，于40 °C、5kPa條件下旋蒸濃縮至5kg，離心，得到上 清液，將上清液經(jīng)過色譜柱純化，純化過程的工藝條件為:30°C、乙醇為洗脫劑、pH值=5，其 中乙醇優(yōu)選為食品級(jí)乙醇，食品級(jí)乙醇的用量為上清液的2倍體積。
[0068]向純化后的上清液中加入IOg市售羥基積雪草苷，于常壓、4°C下靜置結(jié)晶12h，過 濾得濾餅，濾餅經(jīng)熱空氣干燥至恒重，得到半成品，該半成品經(jīng)內(nèi)包裝、外包裝后得到積雪 草提取物。
[0069] 使用(：18液相色譜柱，以體積比乙腈:21111]1〇1/1^環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)口!1 = 4)=24:76為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為70%，積雪草苷的質(zhì)量含量為3%， 積雪草總苷的含量為85%。
[0070]該積雪草提取物中鉛的含量為0.20ppm，鎘的含量為0. lOppm，砷的含量為 0.2]^口111，銅的含量為1.63口口111，萊的含量未檢出。
[0071] 實(shí)施例五
[0072]取重金屬含量為5ppm的積雪草原料20kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到煎鍋中，調(diào)節(jié)溫度、壓力至CO2的超臨界條件，向煎鍋中注入200L的CO2， 提取2h，過濾，得到一次濾液和一次濾渣。重復(fù)提取一次，過濾，得到二次濾液和二次濾渣。 [0073]將二次濾液和一次濾液混合后，于45°C、5kPa條件下旋蒸濃縮至5kg，離心，得到上 清液，將上清液經(jīng)過色譜柱純化，純化過程的工藝條件為:30°C、乙醇為洗脫劑、pH值=5，其 中乙醇優(yōu)選為食品級(jí)乙醇，食品級(jí)乙醇的用量為上清液的2倍體積。于I OkPa、25 °C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 純化后的溶液30min，除去其中的乙醇，得到積雪草提取物。
[0074] 使用(：18液相色譜柱，以體積比乙腈:21111]1〇1/1^環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)口!1 = 4)=24:76為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為30%，積雪草苷的質(zhì)量含量為 1.5%，積雪草總苷的含量為35%。
[0075]該積雪草提取物中鉛的含量為0.20ppm，鎘的含量為0.13ppm，砷的含量未檢出，銅 的含量未檢出，萊的含量未檢出。
[0076] 實(shí)施例六
[0077]取重金屬含量為Sppm的積雪草原料10kg，使用去離子水清洗2遍后粉碎，將粉碎后 的積雪草原料加入到煎鍋中，然后向煎鍋中加入無水乙醇l〇〇kg，常溫浸泡2h，加熱煮沸，并 保持微沸2h，過濾，得到一次濾液和一次濾渣，向?yàn)V渣中再次加入80kg無水乙醇，浸泡2h，加 熱煮沸，并保持微沸1.5h，過濾，得到二次濾液和二次濾渣。
[0078] 將二次濾液和一次濾液混合后，70°C濃縮后離心，取上清液，以殼聚糖用量0.4mL/ g，將藥液濃縮為原來濃度的1.2倍，絮凝溫度為70°C，然后經(jīng)干燥后得半成品，該半成品經(jīng) 內(nèi)包裝、外包裝后得到積雪草提取物。
[0079] 使用(：18液相色譜柱，以體積比乙腈:21111]1〇1/1^環(huán)糊精(磷酸調(diào)節(jié)口!1 = 4)=24:76為 流動(dòng)相，該積雪草提取物中羥基積雪草苷的質(zhì)量含量為30%，積雪草苷的質(zhì)量含量為10%， 積雪草總苷的含量為50%。
[0080] 該積雪草提取物中鉛的含量為〇.33ppm，鎘的含量為1.36ppm，砷的含量0.36ppm， 銅的含量3.84ppm，，萊的含量3.67ppm，。
[00811 積雪草提取物對(duì)HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響
[0082] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為IO5個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞或HaCat細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞液i〇〇yL。最終所鋪的細(xì)胞孔數(shù)取決于樣品數(shù)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 [0083]將96孔板置于37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0084] 將本發(fā)明提供的終濃度為lmg/mL、0 · lmg/mL和0 · 0lmg/mL的積雪草提取物加入到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，向空白組中加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。于37 °C、包含5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng) 箱中孵育48h。
[0085] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑 暗條件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMSO，震蕩以570nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，630nm為參照波 長(zhǎng)，檢測(cè)吸光度。
[0086]計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果如表1所示：
[0087] 表1，積雪草提取物對(duì)人HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞存活率的影響
[0089]以細(xì)胞存活率高于80%為對(duì)人HDF細(xì)胞和HaCat細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，由表1可知，本發(fā) 明提供的積雪草提取物對(duì)人HDF細(xì)胞無毒的最高濃度為0.1mg/mL，本發(fā)明提供的積雪草提 取物對(duì)人HaCat細(xì)胞無毒的最高濃度為0. lmg/mL，因此，確定積雪草提取物的濃度0. lmg/mL 為后續(xù)的試驗(yàn)濃度。
[0090] 積雪草提取物的抗衰老性能
[0091] 自然狀態(tài)下積雪草提取物對(duì)HDF細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響
[0092] 為了考察本發(fā)明提供的積雪草提取物對(duì)HDF細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響，本實(shí)施例 將試驗(yàn)分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0093]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為IO5個(gè)/mL細(xì)胞，每孔IOOyU于37°C、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度離心10min，取上清液。
[0094]向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入IOyL上清液和40yL本發(fā)明提供的積 雪草提取物的稀釋液，向?qū)φ赵囼?yàn)組加入對(duì)比實(shí)施例制備的積雪草提取物，空白組中不加 樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次，每組樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0095]向四組樣品中分別加入生物素標(biāo)記的抗-IgG抗體50yL，于37°C溫育30min，洗滌5 次。
[0096]向四組樣品中分別加入5 0 μ L的鏈霉素和素 -HR P，輕輕震蕩混勻，于3 7 °C溫育 30min，洗滌5次。
[0097] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，輕輕震蕩混勻，于37°C避光孵 育30min，向四組樣品中加入終止液50yL。
[0098] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光度，結(jié)果如表 2和圖1所示。
[0099] 表2,積雪草提取物對(duì)HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0101] 膠原蛋白主要包括I型膠原和III型膠原，外界誘導(dǎo)促使真皮細(xì)胞中氧化水平提高 是細(xì)胞損傷的主要因素，氧化水平提高的直接結(jié)果是降低了 I型膠原蛋白的表達(dá)及I型膠原 蛋白被基質(zhì)金屬蛋白酶MPP-I降解，兩種情況造成的結(jié)果均為I型膠原蛋白在皮膚中的含量 減少，而I型膠原蛋白含量減少是皮膚形成皺紋的主要原因。
[0102] 由表2可知，向HDF細(xì)胞中添加本發(fā)明提供的積雪草提取物后，皮膚中的I型膠原蛋 白含量為原來的125.19%，而向HDF細(xì)胞中加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物后，I型 膠原蛋白的含量為105.28%，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪 草提取物，更能夠顯著促進(jìn)I型膠原蛋白的表達(dá)，可以作為潛在的抗老化添加劑。
[0103] 過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞存活率的影響
[0104] 選取不同濃度的過氧化氫，如50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 與HDF細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，如3h、6h和9h等，采用MTT法檢測(cè)不同濃度的過氧化氫對(duì)HDF 細(xì)胞存活率的影響。
[0105] 取培養(yǎng)至濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h，每板做復(fù)孔3個(gè)。
[0106]使用不同濃度的過氧化氫分別孵育造模3h、6h和9h;向每個(gè)樣品孔中加入濃度為 0.5mg/mL的MTT IOOyU于37°C、含有CO2的培養(yǎng)箱中，黑暗條件下孵育4h。
[0107] 去除上清液，向樣品中加入150yL DMS0,震蕩，以570nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，630nm為參照 波長(zhǎng)，檢測(cè)每個(gè)樣品的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0108] 測(cè)試結(jié)果如圖2所示，人HDF細(xì)胞于濃度為50-800μΜ的過氧化氫共孵育3-9h后，人 HDF細(xì)胞的存活率明顯下降，當(dāng)孵育濃度超過400μΜ時(shí)，細(xì)胞存活率低于50% dOOyM過氧化 氫作用6h后，細(xì)胞存活率降到70 %。
[0109] 積雪草提取物對(duì)經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0110] 本試驗(yàn)分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和對(duì)照試驗(yàn)組。
[0111] 取培養(yǎng)至密度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于96孔板，每孔100yL，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 于37°C，含有CO 2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0112] 空白組中不加入樣品，實(shí)驗(yàn)組中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組加 入對(duì)照試驗(yàn)制備的積雪草提取物，陽性對(duì)照組中加入維甲酸。
[0113] 實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和對(duì)照實(shí)驗(yàn)組利用過氧化氫損傷建模。
[0114] 向四組試驗(yàn)中的每孔加入0.5mg/mL的MTT IOOyU于37°C、5%C02的黑暗條件下孵 育4h。去除上清液，加入DMSO 150yL，震蕩檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率采用如 下計(jì)算公式： 衾'篇益聲'繪
[0115] 麵壞莽衝率：《1骱％
[0116] 其中，空白組既未加入過氧化氫，也未加入積雪草提取物。
[0117]表3，積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞存活率的影響
[0119] 由圖2、圖3可知，經(jīng)過過氧化氫損傷后，HDF細(xì)胞的存活率降低至70%以下，而向經(jīng) 過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入維甲酸后，HDF細(xì)胞的存活率提高至89%，如表3中陽性對(duì) 照組所述。向經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物后，人HDF細(xì) 胞的存活率達(dá)到83%，向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取 物后，人HDF細(xì)胞的存活率為75%，即本發(fā)明提供的積雪草提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的積 雪草提取物，其修復(fù)受損肌膚的能力與維甲酸接近，能夠顯著修復(fù)過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞造成 的損傷。
[0120] 積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0121] 本試驗(yàn)分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。
[0122] 取培養(yǎng)至密度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔ImU每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。于37 °C，含有CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)6h。
[0123] 空白組、陰性對(duì)照組中不加入樣品，實(shí)驗(yàn)組1中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物， 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組加入采用對(duì)比實(shí)施例制備的積雪草提取物，向陽性對(duì)照組中加入維甲酸。
[0124] 實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和對(duì)照實(shí)驗(yàn)組利用過氧化氫損傷建模。
[0125] 向每孔中加入0.5mg/mL的MTT IOOyL，于37 °C、5 % CO2的黑暗條件下孵育4h。去除 上清液，加入DMSO 150yL，震蕩檢測(cè)吸光度，計(jì)算膠原蛋白含量，結(jié)果如表4和圖3所示：
[0126] 表4,積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌的影響
[0128]由表4和圖4可知，經(jīng)過過氧化氫損傷后，HDF細(xì)胞I型膠原蛋白分泌量變?yōu)槲磽p傷 時(shí)的73.67%，如陰性對(duì)照組所示。而向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF細(xì)胞中加入維甲酸后，HDF 細(xì)胞中I型膠原蛋白的分泌量提高至94%，如陽性對(duì)照組所述。向經(jīng)過氧化氫損傷過的HDF 細(xì)胞中加入現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物后，人HDF細(xì)胞中I型膠原蛋白的含量為78%。向 經(jīng)過過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物后，人HDF細(xì)胞中I型膠原 蛋白的含量達(dá)到80.25 %，稍高于加入現(xiàn)有技術(shù)提供的積雪草提取物后人HDF細(xì)胞中I型膠 原蛋白的含量，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物具有優(yōu)良的修復(fù)細(xì)胞損傷的能力，能夠顯 著修復(fù)過氧化氫對(duì)HDF細(xì)胞造成的損傷，是優(yōu)良的抗衰老化妝品添加劑。
[0129] 積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-I)的影響
[0130] 材料與試劑
[0131]細(xì)胞培養(yǎng)液24孔細(xì)胞培養(yǎng)板
[0132] 細(xì)胞培養(yǎng)箱過氧化氫
[0133] 離心機(jī) ELISA試劑盒
[0134] 測(cè)試步驟
[0135] 本測(cè)試分為標(biāo)準(zhǔn)組、空白組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
[0136] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL，于37 °C，含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0137] 向?qū)嶒?yàn)組中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物，向標(biāo)準(zhǔn)組加入標(biāo)準(zhǔn)物，空白組中不 添加樣品。
[0138] 誘導(dǎo)建立過氧化氫損傷模型。小心吸取上清液培養(yǎng)基，離心，按照試劑盒說明書， 取IOyL細(xì)胞懸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以空白孔調(diào)零，在反應(yīng)終止后15min內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的 吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的MMP-I的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方 程，再根據(jù)樣本的吸光度值，在回歸方程上計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組中MMP-I的濃度。
[0139] 表5,積雪草提取物對(duì)過氧化氫損傷的HDF細(xì)胞MMP-I含量的影響
[0141] 由表5和圖5可知，人HDF細(xì)胞經(jīng)過過氧化氫刺激后，HDF細(xì)胞中的MMP-I水平顯著上 升至167%，如陰性對(duì)照組所示。加入維甲酸后，MMP-I的值有所降低，如表5中的陽性對(duì)照組 所示。而向過氧化氫刺激過的HDF細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的積雪草提取物后，MMP-I的含量 降低至158%，而向過氧化氫刺激過的HDF細(xì)胞中加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物 后，HDF細(xì)胞中MMP-I的含量為166 %，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備 的積雪草提取物具有更明顯的抑制MMP-I的能力。這說明，在氧化應(yīng)激條件下，本發(fā)明提供 的積雪草提取物具有抑制MMP-I表達(dá)的能力。
[0142] 積雪草提取物的保濕性能
[0143] 皮膚內(nèi)水分的含量的多少，直接影響皮膚的彈性、光澤度等，皮膚的表皮、真皮、皮 下組織均對(duì)皮膚維持水分起著不同的作用。在皮膚保濕過程中，主要有兩種機(jī)制影響皮膚 對(duì)水的維持作用：
[0144] 1)皮膚作為天然屏障，避免水分流失；
[0145] 皮膚表皮是人的天然屏障，其中透明層、顆粒層和角質(zhì)層對(duì)皮膚鎖水能力起到重 要作用。透明層含有磷脂類物質(zhì)和角質(zhì)蛋白，能夠防止水分及電解質(zhì)等透過皮膚。顆粒層的 細(xì)胞排列致密，對(duì)貯存水分、防止水分滲透具有重要的作用。角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)的堅(jiān) 韌、有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。
[0146] 2)皮膚中存在許多保濕因子，吸收和鎖住水分。
[0147] 積雪草提取物對(duì)HaCat細(xì)胞兜甲蛋白表達(dá)的影響
[0148] 角質(zhì)層是由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的堅(jiān)韌有彈性的板層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)充滿了角蛋白。 角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化學(xué)物質(zhì)內(nèi)滲和體液外滲的作用，其中含量最高的角 蛋白叫做兜甲蛋白，約占角蛋白的80 %，兜甲蛋白的含量會(huì)直接影響皮膚水分的流失狀況。
[0149] 本試驗(yàn)通過考察HaCat細(xì)胞兜甲蛋白（LOR)的表達(dá)來考察本發(fā)明提供的積雪草提 取物的保濕性能。
[0150] 本測(cè)試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0151]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為IO5個(gè)/mL的HaCat細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0152] 向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的積雪草提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入 一定量采用對(duì)照試驗(yàn)制備的積雪草提取物，標(biāo)準(zhǔn)組和空白組中不加入樣品，置于37°C、含有 5%C0 2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0153] 棄除上清液，用預(yù)冷I3BS沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解細(xì) 胞IOmin，收集細(xì)胞裂解液，以13000rpm離心10min，取上清液備用。
[0154] 按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；
[0155] 利用BCA試劑盒檢測(cè)不同組別蛋白質(zhì)含量，各組LOR表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果 如表6和圖6所不。
[0156] 表6，積雪草提取物對(duì)LOR表達(dá)的影響
[0159]由表6可知，添加本發(fā)明提供的積雪草提取物后，人HaCat細(xì)胞中LOR含量能比不添 加本發(fā)明提供的積雪草提取物和添加現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物均高，LOR含量為空白 試驗(yàn)的1.11倍，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物保濕性比現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物的 保濕性好。
[Ο·] 積雪草提取物對(duì)HDF細(xì)胞透明質(zhì)酸合成酶(HAS3)表達(dá)量的影響 [0161] 正常皮膚中，HA主要由HAS合成，HAS主要包括三種，分別為說31、說32、說33，其中 HAS3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保濕能力最強(qiáng) 的物質(zhì)，因此，皮膚中HAS3的含量提高能夠間接促進(jìn)皮膚的保濕能力。
[0162 ] 本測(cè)試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0163] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、濃度為IO5個(gè)/mL的HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔 細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0164] 向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的積雪草提取物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組細(xì)胞液 中加入一定量采用對(duì)照試驗(yàn)制備的積雪草提取物，置于37°C、含有飽和濕度的細(xì) 胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0165] 棄除上清液，用預(yù)冷I3BS沖洗細(xì)胞兩次，在培養(yǎng)孔中加入IOOyL裂解液，冰上裂解細(xì) 胞IOmin，收集細(xì)胞裂解液，以13000rpm離心10min，取上清液備用。
[0166] 按照ELISA試劑盒說明書，取細(xì)胞裂解液進(jìn)行試驗(yàn)；
[0167] 利用BCA試劑盒檢測(cè)不同組別蛋白質(zhì)含量，各組HAs3表達(dá)量采用蛋白量矯正，結(jié)果 如表7和圖7所示。
[0168] 表7，積雪草提取物對(duì)HAS3表達(dá)的影響
[0170]由表7和圖7可知，添加本發(fā)明提供的積雪草提取物后，人HaCat細(xì)胞中HAS3含量比 不加入積雪草提取物時(shí)的含量提高了接近60%，比加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物 時(shí)的含量提高了近25%，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物能夠顯著提高了細(xì)胞的保濕性 能，可以作為添加劑加入到化妝品中。
[0171] 積雪草提取物對(duì)透明質(zhì)酸分泌的影響
[0172]在皮膚真皮層中，透明質(zhì)酸(HA)是含量較多的氨基多糖，HA粘稠度極高且能高比 例地結(jié)合水分子，HA的含量直接影響皮膚中水分的含量。作為皮膚內(nèi)重要的保濕成分，它對(duì) 皮膚細(xì)胞的增殖、分化有顯著作用，對(duì)維持皮膚細(xì)胞的正常新陳代謝至關(guān)重要。
[0173 ] 本測(cè)試分為空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組。
[0174] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的濃度為IO5個(gè)/mL的人HDF細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞接種于24孔板中，每 孔細(xì)胞液ImU于37°C、含有CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。
[0175] 向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞液中加入一定量本發(fā)明提供的積雪草提取物，置于37°C、含有5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h;
[0176] 小心收集上清培養(yǎng)基，離心后得到上清液，備用。
[0177] 向標(biāo)準(zhǔn)組中加入50yL標(biāo)準(zhǔn)液，向?qū)嶒?yàn)組中加入IOyL上清液和40yL本發(fā)明提供的積 雪草提取物的稀釋液，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組中加入IOyL上清液和40yL采用現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草 提取物的稀釋液，空白組中不加樣品，分別于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0178] 向四組樣品中分別加入顯色劑A和顯色劑B各50yL，于37°C避光孵育30min，向四組 樣品中加入終止液50yL。
[0179] 以空白組調(diào)零，在終止反應(yīng)后15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各組的吸光光度值，并根 據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞液中HA的含量，結(jié)果如表8和圖8所示。
[0180]表8,積雪草提取物對(duì)HA分泌的影響
L〇182」由表8和圖8可知，添加本發(fā)明提供的枳雪草提取物后，人HDF細(xì)胞中HA含量比未加 入積雪草提取物時(shí)，提高了近32 %，比加入采用現(xiàn)有技術(shù)提取的積雪草提取物時(shí)，提高了 25.6%，說明本發(fā)明提供的積雪草提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)得到的積雪草提取物，能夠明顯 促進(jìn)HDF細(xì)胞分泌HA，有效保持細(xì)胞中水分，并進(jìn)而起到保濕的作用。
[0183] 積雪草提取物的抗炎性能
[0184] 性激素紊亂、皮脂腺痤瘡丙酸桿菌的大量繁殖、皮脂腺導(dǎo)管的異常角化、皮脂的大 量分泌、炎癥等反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致痤瘡的發(fā)生。祛痘化妝品也一般以抑制痤瘡的發(fā)病為因素為目 標(biāo)。
[0185] 炎癥因子白介素-liHlL-Ιβ)是一種促炎性細(xì)胞因子，由單核-巨噬細(xì)胞在攝取抗 原抗體復(fù)合物或者抗原呈遞過程中產(chǎn)生。大量分泌時(shí)，主要通過刺激使T細(xì)胞和B細(xì)胞活化， 同時(shí)誘導(dǎo)環(huán)氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合成酶、粘附分子等效應(yīng)蛋白的表達(dá)，參與炎性反 應(yīng)。同時(shí)，在多種細(xì)胞中，IL-8和TNF-α皆可由外源IL-Ιβ誘導(dǎo)產(chǎn)生。
[0186] 痤瘡丙酸桿菌在毛囊內(nèi)定植及侵襲后，機(jī)體的免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞，可能通過其 模式識(shí)別受體，如Toll樣受體等，對(duì)痤瘡丙酸桿菌識(shí)別后，通過激活多種信號(hào)途徑，誘導(dǎo)一 系列天然及獲得性免疫應(yīng)答來抵抗其入侵。通過釋放多種促炎因子及趨化因子，如IL-Ιβ、 IL-8、TNF_a等，招募各種免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，聚集于入侵的 局部，來殺滅致病性的痤瘡丙酸桿菌，導(dǎo)致受累毛囊炎癥的發(fā)生。
[0187] 建立抗炎祛痘模型
[0188] 將人單核細(xì)胞THP-I細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %胎牛血清、100單位/mL青霉素和lOOyg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 °C、含有5 %CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2-3天傳 代一次。
[0189] 取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為I X IO6個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng) 板中，取厭氧條件下培養(yǎng)72h的痤瘡丙酸桿菌，離心，用PBS溶液清洗3-4次，在80°C水浴條件 下加熱30min制成活菌懸液或熱滅活菌懸液。按細(xì)菌:細(xì)胞分別為1:1、10:1和100:1的比例 將制備的活菌懸液或熱滅活菌懸液加入96孔板中，以不加藥物孵育為陰性對(duì)照，以只加 PBS 溶液為空白對(duì)照。置于37 °C恒溫，5 % CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。采用ELI SA法測(cè)細(xì)胞 上清中IL-I邱勺含量變化。
[0190] ELISA法檢測(cè)IL-Ιβ含量的步驟如下：
[0191] (1)確定本次檢測(cè)所需的已包被抗體的酶標(biāo)板孔數(shù)目，并增加1孔作為TMB空白顯 色孔。
[0192] (2)將1000pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12·5pg/mL、6·25pg/mL、3·12pg/mL 和1.56pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 mL依次加入一排7孔中，I孔只加積雪草提取物稀釋液的作為零 孔。向培養(yǎng)孔中加入IOOyL已用積雪草提取物稀釋液稀釋的積雪草提取物，于37°C反應(yīng) 90min〇
[0193] (3)除去酶標(biāo)板內(nèi)的液體，將準(zhǔn)備好的抗人IL-Ιβ抗體工作液按每孔0.1 mL依次加 入，TMB空白顯色孔除外，于37°C反應(yīng)60min。
[0194] (4)除去酶標(biāo)板內(nèi)的液體，使用PBS洗滌3次，每次浸泡Imin左右。
[0195] (5)將準(zhǔn)備好的ABC工作液按每孔0.1 mL依次加入，TMB空白顯色孔內(nèi)不加 ABC工作 液，于37°C反應(yīng)30min。
[0196] (6)除去酶標(biāo)板內(nèi)液體，PBS洗滌5次，每次浸泡I -2min左右。
[0197] (7)按每孔90yL依次加入已在37°C平衡30min的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)25min。
[0198] (8)按每孔0.1 mL依次加入TMB終止液。
[0199] (9)用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值。
[0200] (10)根據(jù)各孔的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的IL-I邱勺濃度。
[0201] 采用不同濃度的P.acnes(熱滅活菌和活菌)刺激THP-I細(xì)胞不同時(shí)間時(shí)，測(cè)得細(xì)胞 上清液中IL-Ιβ的含量如圖9所示，當(dāng)細(xì)菌濃度較低或是熱滅活時(shí)，IL-Ιβ的分泌量較少，當(dāng) 選擇活菌，菌濃度較高時(shí)，細(xì)胞上清液中IL-Ιβ含量較多，變化顯著。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用 活細(xì)菌:細(xì)胞= 100:1，孵育24h。
[0202] 積雪草提取物對(duì)THP-I細(xì)胞存活率的影響
[0203]本發(fā)明采用噻唑蘭(MTT)法檢測(cè)積雪草對(duì)THP-I細(xì)胞增殖的影響。
[0204]將本發(fā)明提供的積雪草提取物用DMSO配制成100mg/mL的母液凍存，備用。
[0205]測(cè)試開始前，取配制好的母液20yL，向母液中加入980yL細(xì)胞培養(yǎng)液，配制成2mg/ mL的儲(chǔ)備加藥濃度。
[0206] 取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2 X IO4個(gè)/mL，將培養(yǎng)后的細(xì)胞接 種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0207] 向檢測(cè)組的培養(yǎng)孔中加入不同終濃度的本發(fā)明提供的積雪草提取物，使每孔中積 雪草提取物的終濃度分別為lmg/mL、0. lmg/mL和0.Olmg/mL，孵育48h，對(duì)照組的培養(yǎng)孔中不 加樣品，孵育48h。
[0208] 向每孔中加入20yL濃度為5mg/mL的MTT，保證每孔內(nèi)MTT的終濃度為0.5mg/mL，將 培養(yǎng)板置于含有CO 2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，以3000rpm/min轉(zhuǎn)速離心后，小心吸除培養(yǎng)孔 內(nèi)的上清液，向每孔中加入IOOyLDMSO，震蕩IOmin，使結(jié)晶物完全溶解后，放置于酶標(biāo)儀上， 選取570nm為測(cè)量波長(zhǎng)，630nm為參照波長(zhǎng)測(cè)量每孔樣品的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì) 胞存活率的計(jì)算公式如下：
[0209] __存活率=X 1CID% 對(duì)P辟H吸光度+均值
[0210] 采用MTT法測(cè)試了藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，其目的在于找出一個(gè)合適的安全劑量 范圍，測(cè)試結(jié)果如表8所示。
[0211] 表9，積雪草提取物對(duì)THP-I細(xì)胞的存活率的
[0213]以THP-I細(xì)胞存活率高于80%為對(duì)人THP-I細(xì)胞無毒的標(biāo)準(zhǔn)，由表7可知，本發(fā)明提 供的積雪草提取物對(duì)人THP-I細(xì)胞無毒的最高濃度為lmg/mL，因此，確定積雪草提取物的最 高濃度lmg/mL為后續(xù)的試驗(yàn)濃度。
[0214] 積雪草提取物對(duì)炎癥因子IL-W的影響
[0215]當(dāng)THP-I細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，會(huì)特異性產(chǎn)生IL-Ιβ，因此，可以用IL-Ιβ的含量間 接反映 THP-I細(xì)胞發(fā)生炎癥的程度。
[0216]具體測(cè)試方法如下：
[0217] 將THP-I細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、含5%C0 2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。
[0218]取指數(shù)生長(zhǎng)期的THP-I細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至IX 106/mL，接種于96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，向?qū)嶒?yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入終濃度為〇. Uig/mL的本發(fā)明提供的積雪草提取 物，向?qū)φ諏?shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入終濃度為〇.lμg/ml、對(duì)照試驗(yàn)中制備的積雪草提取 物，孵育4h。
[0219] 取厭氧培養(yǎng)72h的痤瘡丙酸桿菌，離心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌懸液，按細(xì) 菌:細(xì)胞= 100:1的比例加入96孔板中，以不加痤瘡丙酸桿菌為陰性對(duì)照組，以只加 PBS溶液 為空白組。置于37°C、5%⑶2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用ELISA法測(cè)細(xì)胞上清中 IL-W的含量變化，IL-W的抑制率采用如下公式計(jì)算： 「.…I w w物糾嗬附[生對(duì)殿組Lip量-實(shí)驗(yàn)組MP量浦財(cái)
[0220] 隊(duì)―_贈(zèng)=---------------------IIifiIlHipI----------------------x 廳
[0221] 結(jié)果如表10所示：
[0222] 表10,積雪草提取物對(duì)IL-Ιβ分泌的影響
[0224] 以對(duì)IL-Ιβ的抑制率在60%以上作為抗炎效果明顯的標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)抗炎藥物可以有 效降低由痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)上調(diào)的炎癥因子的釋放，減弱痤瘡周圍T、B細(xì)胞等的活化以及 中性粒細(xì)胞等的聚集，減少由于抗原入侵導(dǎo)致的局部發(fā)熱、腫脹，從而達(dá)到減輕炎癥甚至消 炎的目的。
[0225] 由表10可知，向正常的人THP-I細(xì)胞中加入痤瘡丙酸桿菌后，IL-Ιβ的含量增高至 原來的760.38 %，向經(jīng)過痤瘡丙酸桿菌刺激的THP-I細(xì)胞中加入本發(fā)明提供的積雪草提取 物后IL-Ιβ的含量降低至265.14%，即本發(fā)明提供的積雪草提取物對(duì)IL-Ιβ的抑制率為 65.76%。向經(jīng)過痤瘡丙酸桿菌刺激的THP-I細(xì)胞中加入采用現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物 后IL-Ιβ的含量降低至431.28%，即現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物對(duì)IL-Ιβ的抑制率為 43.28%。說明本發(fā)明提供的積雪草提取物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制備的積雪草提取物，具有更明 顯的炎癥抑制作用。
[0226]綜上所述，本發(fā)明提供的積雪草提取物具有明顯的抗氧化性、保濕性和抗炎性，可 以作為添加劑應(yīng)用到化妝品中，此外，該積雪草提取物還可以作為保健品、藥品等應(yīng)用在相 應(yīng)領(lǐng)域。
[0227]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述積雪草提取物的質(zhì)量含量為0.001 %-50% 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化妝品和/或護(hù)膚品，其特征在于，所述積雪草提取物包含羥 基積雪草苷，所述積雪草提取物中所述羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為20%-99%。3. -種積雪草提取物，其特征在于，所述積雪草提取物中所述羥基積雪草苷的質(zhì)量百 分含量為20 %-99 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的積雪草提取物，其特征在于，所述積雪草提取物中還包括積雪 草苷、積雪草酸和羥基積雪草酸中的任意一種或其組合，所述積雪草苷的質(zhì)量含量為0-20% 〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的積雪草提取物，其特征在于，所述積雪草提取物中重金屬 的含量小于lOOppm。6. -種如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的積雪草提取物的制備方法，其特征在于，所述方法 包括如下步驟： 步驟1、取清洗后的積雪草粉末，向其中加入5-30體積倍量的溶劑浸提至少2次，每次 0.5h-3.5h，混合每次浸提得到的提取液，得到混合提取液； 步驟2、將步驟1得到的混合提取液濃縮，得到濃縮液，所述濃縮液即為所述積雪草提取 物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2中還包括將濃縮液以500-300r/ min轉(zhuǎn)速離心2-20min，取上清液，得到所述積雪草提取物。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟2中還可以包括將所述濃縮液流 過大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，所述大孔吸附樹脂純化過程的條件為pH值= 3-6,溫度為25°C-50 °C洗脫劑的流速為2-4BV/h。9. 一種如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的積雪草提取物的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備涂 覆于皮膚外表面的制品。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的積雪草提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述制品為化妝品和/或 護(hù)膚品。
【文檔編號(hào)】A61K8/97GK106074264SQ201610520361
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月5日
【發(fā)明人】洪民華, 劉丹, 張營, 洪奇, 呂智, 盧艷花, 何浩, 郭苗苗
【申請(qǐng)人】上海相宜本草化妝品股份有限公司, 華東理工大學(xué)