含有酸漿提取物的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】一種減少皮膚損傷和/或?yàn)槭茉囌咛峁┙】祷蛎廊菀嫣幍姆椒ǎㄏ蚴茉囌叩钠つw施用包含有效量酸漿(Physalis alkekengi)提取物的組合物。
【專利說明】含有酸漿提取物的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品
[00011本申請(qǐng)要求美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/915,300的優(yōu)先權(quán)，其申請(qǐng)日為2013年12月12日， 通過引用并入本文。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明一般涉及含有酸衆(zhòng)(Physalis alkekengi)提取物的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，更具體 地，涉及通過向個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品添加酸漿提取物，以防止皮膚由于暴露于紫外線輻射受到損 害，舒緩皮膚，改善皮膚狀態(tài)，減少皮膚老化的影響。
[0003] 肌膚不斷暴露于包括紫外線(UV)照射的環(huán)境侵害之中。這種暴露的結(jié)果可導(dǎo)致衰 老角質(zhì)細(xì)胞的積累。這些角質(zhì)細(xì)胞可對(duì)皮膚的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生負(fù)面影響。具體而言，施加于 皮膚上的UV輻射可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(R0S)的產(chǎn)生，它能夠引起DNA損傷。這種DNA損傷能夠 刺激誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。此過程的視覺結(jié)果就是皮膚老化。針對(duì)這種反應(yīng)的第一道防線是利用 那些我們身體中發(fā)現(xiàn)的由健康飲食提供的抗氧化劑。另一個(gè)減少這種暴露造成的影響的機(jī) 會(huì)是利用經(jīng)由個(gè)人護(hù)膚品施加于皮膚表面的抗氧化劑?？寡趸瘎┚哂性诃h(huán)境誘發(fā)的自由基 引起下游效應(yīng)之前將其猝滅的能力。
[0004] 皮膚對(duì)于每天不同類型的環(huán)境和物理壓力具有承受能力，包括暴露于刺激性化學(xué) 物質(zhì)或紫外線輻射。作為人體的自然反應(yīng)機(jī)制，表皮角化細(xì)胞能釋放大量細(xì)胞因子，如白細(xì) 胞介素6,8，1(1(11^-6，11^-8和11^-1€〇和腫瘤壞死因子(1(^即-€〇。這些細(xì)胞因子可作為人體對(duì) 抗環(huán)境暴露的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且與刺激性癥狀的發(fā)展有關(guān)。這些刺激性癥狀可導(dǎo)致皮膚 變得紅腫疼痛?？寡趸瘎┯兄谑婢徠つw受到的刺激。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 酸漿的提取物被發(fā)現(xiàn)具有對(duì)皮膚護(hù)理具有一定影響的抗氧化作用。其好處在于可 減少皮膚因暴露于紫外線輻射而產(chǎn)生的炎癥標(biāo)志物。向個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中加入酸漿提取物， 可向用戶提供一種對(duì)皮膚有益的護(hù)理方法，有益效果包括抗衰老作用。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種含有酸漿提取物的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，以為用戶提供有益 效果。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過提供含有酸漿提取物的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品降低用戶的皮 膚傷害風(fēng)險(xiǎn)。
[0008] 本發(fā)明的目的還包括提供一種減少受試者皮膚損傷的方法，其包括將含有有效劑 量酸漿提取物的組合物施用于受試者皮膚的方法。
[0009] 本發(fā)明的目的還包括提供一種降低受試者炎癥標(biāo)志物水平的方法，其包括將含有 有效劑量迷迭香(rosemary)提取物的組合物應(yīng)用于受試者皮膚的方法。
[0010] 本發(fā)明的目的還包括提供一種降低減少一種或兩種炎癥標(biāo)志物水平的方法，炎癥 標(biāo)志物包括 IL-6、IL-8、IL-I 和 TNFa。
[0011] 這些和本發(fā)明的其他目的將通過本說明書、相關(guān)附圖和所附的權(quán)利要求書的闡 述，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0012]圖1是實(shí)施例1中MTT比色結(jié)果。
[0013]圖2是實(shí)施例1中IL-6的測(cè)定結(jié)果。
[0014]圖3是實(shí)施例1中IL-8的測(cè)定結(jié)果。
[0015]圖4是實(shí)施例1中IL-Ia的測(cè)定結(jié)果。
[0016] 圖5是實(shí)施例1中TNFa的測(cè)定結(jié)果。
[0017] 圖6是0.05mg/mL水溶性維生素 E(Trolox)對(duì)DPPH的抑制作用（IC50 = 0.0010% )。
[0018] 圖7是0.05mg/mL LumiSalis SE對(duì)DPPH的抑制作用。
[0019] 詳細(xì)描述
[0020] 酸衆(zhòng)(Physalis alkekengi)是一種原產(chǎn)于亞洲的多年生草本植物，生產(chǎn)一種封閉 于亮橙紅色紙質(zhì)基底萼中的橙紅色果子。酸漿是一種流行的觀賞植物，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上用來作 為一種利尿、殺菌、正肝和鎮(zhèn)靜藥物。酸漿花萼含有高水平的抗氧化物，包括類胡蘿卜素。
[0021] 如本發(fā)明所述，"減少"是指治療，改善，減少不良外觀，降低嚴(yán)重程度，或減少不利 影響。
[0022] 如本發(fā)明所述，"炎癥標(biāo)志物"是指由身體產(chǎn)生的可以指示炎癥的發(fā)生或先于炎癥 產(chǎn)生的物質(zhì)，包括但不限于白介素-6(IL_6)、白介素-8(IL_8)、白細(xì)胞介素-la(IL-Ia)和腫 瘤壞死因子a(TNFa)。
[0023] 如本發(fā)明所述，"皮膚損傷"包括但不限于產(chǎn)生細(xì)紋或粗糙的皺紋，不規(guī)則的色素 沉著，被稱為著色斑的大雀斑樣斑點(diǎn)，膚色暗黃，皮膚質(zhì)感粗糙似皮革狀。皮膚損害還包括： (a)皮膚干燥，其中日光暴曬的皮膚會(huì)逐漸失去水分和油脂，使其顯得干燥，脫皮和/或過早 褶皺，甚至出現(xiàn)于年輕人群；（b)曬傷，對(duì)于皮膚暴露于UV輻射后立即出現(xiàn)的皮膚損害或傷 害的通用名稱，輕度曬傷僅引起皮膚疼痛發(fā)紅，但在更嚴(yán)重的病情可以產(chǎn)生微小的流體填 充腫塊(囊泡)或更大的水皰;和(c)光化性角化病，是一種細(xì)微的感覺像砂紙一樣的腫塊， 或由曬傷皮膚產(chǎn)生的細(xì)小鱗肩狀碎片，呈粉紅色、紅色、黃色或褐色;不像曬痕或曬傷，光化 性角化病通常不會(huì)自行消失，除非它被凍結(jié)、化學(xué)治療或由醫(yī)生清除;光化性角化病發(fā)病于 經(jīng)歷了多次或長(zhǎng)期陽(yáng)光紫外線暴曬的皮膚區(qū)域，是皮膚癌風(fēng)險(xiǎn)增加的警告標(biāo)志。
[0024] 如本發(fā)明所述，"有效治療劑量"是指本發(fā)明的化合物或組合物或其衍生物施用于 受試者時(shí)，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期治療效果的劑量。一次標(biāo)準(zhǔn)劑量的給藥并不一定產(chǎn)生完全的治療 效果，只有一系列標(biāo)準(zhǔn)劑量的給藥可能實(shí)現(xiàn)上述效果。因此，有效治療劑量可以分一次或多 次給藥。受試者所需要的精確有效劑量將取決于以下因素，例如受試者的體型、健康和年 齡，病情的性質(zhì)和程度，所選擇的治療方法或組合療法，以及給藥方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以容易地通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定給定情況的有效劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)按照說明使用時(shí)， 如本文所述的被加入到個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的酸漿提取物，將以有效治療劑量施用于皮膚。
[0025] 如本發(fā)明所述，"調(diào)理或治療"是指，試圖改變所治療個(gè)體、動(dòng)物或細(xì)胞的病情的干 預(yù)過程，并且可在預(yù)防或臨床病理階段進(jìn)行。預(yù)期效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩解癥 狀，消減疾病的任何直接或間接病理后果，降低疾病發(fā)展速度，改善或減輕疾病狀態(tài)，及提 高或改善預(yù)后。針對(duì)狀況或受試者進(jìn)行治療是指采取措施以獲得有益的或預(yù)期的結(jié)果，包 括臨床結(jié)果。有益的或預(yù)期的臨床結(jié)果包括但不限于減少、減輕或改善與皮膚損傷有關(guān)的 一種或多種癥狀。
[0026]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，酸漿提取物的劑量范圍為個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品重量的 0.001 %至10%，其包括之間的所有值，而不限于或剔除以下數(shù)值，例如0.002%，0.003%， 0.004 %,0.01%,0.03 %,0.06 %,0.09 %,0.1%,0.25 %,0.7%,1%,2%,3%,4%, 4.15%，6.63%，和9.87 %。換而言之，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，劑量可以取任何以 "ab. cde %重量"格式表示的值，其中a選自數(shù)字0和I，b、c、d和e各自獨(dú)立地選自數(shù)字0、1、2、 3、4、5、6、7、8和9,唯一例外是a，b，c，d和e不能全部為0。
[0027] 實(shí)施例1-成纖維細(xì)胞的IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa
[0028]目的：
[0029]本測(cè)試過程用于篩選材料的降低紫外線（280-315nm，通常被稱為UVB)誘導(dǎo)的兒- 6、IL_8、IL-Ia和TNFa增加的能力，采用培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>[0030] 測(cè)試材料的制備：
[0031] 新鮮的酸漿漿果冷凍干燥。將所得干漿果磨碎成粉末。粉末用于提取油狀物。采用 超臨界二氧化碳進(jìn)行提取。提取條件如下:溫度45°c，壓力300bar;C0 2流速為100g/分鐘；溶 劑與進(jìn)料之比為70。所得提取物為橙色油狀物。此油狀物（CLSC)將以濃度為0.01 %， 0.005 %，0.001 %的溶液形式，進(jìn)行以下生物測(cè)試分析。
[0032]測(cè)試方法概述：
[0033] 皮膚細(xì)胞暴露于UVB可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及相關(guān)炎癥標(biāo)志物的釋放，如IL-6，IL-8，IL-Ia和ΤΝα。這些炎癥介質(zhì)的釋放可能對(duì)皮膚的外觀和功能造成不利影響。因此，將可以防止 UVB誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的材料作為化妝品成分是有益的。
[0034]在本研究中，人皮膚成纖維細(xì)胞在UVB照射后培養(yǎng)并處理處理24小時(shí)。在培養(yǎng)期結(jié) 束時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基并采用ELISA方法測(cè)定其IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa含量。細(xì)胞活力的 變化采用MTT比色法進(jìn)行評(píng)估。
[0035] 材料和方法：
[0036] 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):
[0037] 人真皮成纖維細(xì)胞被接種到含有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(FGM)的24孔板中，培養(yǎng) 條件為37 ± 2 °C和5 ± 1 % CO2，視實(shí)際需求每48至72小時(shí)更換培養(yǎng)基。細(xì)胞匯合收集經(jīng)UVB照 射后需用測(cè)試材料進(jìn)行處理。在UVB照射前的24小時(shí)內(nèi)，僅使用DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處 理。為完成UVB照射，采用PBS代替細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞UVB照射的輻射劑量為40mJ/cm 2。采用在 DMEM中制備的測(cè)試材料對(duì)UVB照射后的細(xì)胞進(jìn)行處理。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)基并 測(cè)定IL-6，IL-8，IL-Ia和TNFa含量，而細(xì)胞活力的變化采用MTT比色法進(jìn)行測(cè)定。
[0038] MTT 比色法:
[0039] 在UVB培養(yǎng)后，將細(xì)胞培養(yǎng)基移除（見上文），成纖維細(xì)胞用PBS洗滌兩次以去除任 何殘余的測(cè)試材料。最后一次洗滌后，將500μ1添加有0.5mg/ml MTT的DMEM培養(yǎng)基加入到每 個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37±2°C和5±1%C02條件下培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，除去DMEM/MTT溶液并 將細(xì)胞用PBS再洗滌一次，然后將0.5ml異丙醇加入到孔中，以提取紫色福爾馬肼晶體。將 200μ1異丙醇提取物轉(zhuǎn)移到96孔板中，并將板在540nm波長(zhǎng)下讀取吸光值，以異丙醇作為空 白對(duì)照。
[0040] ELISA 測(cè)試板的制備（IL-6，IL-8, IL-Ia 和 INFa):
[0041 ]通過在PBS中稀釋適當(dāng)量的捕獲抗體制備ELISA測(cè)試板。接著，將100μΙ稀釋的捕捉 抗體加入96孔ELISA板的孔中，并且將板在室溫下培養(yǎng)過夜。在第二天，用300μ1洗滌緩沖液 (PBS中加入0.05%吐溫20)將板沖洗3次，并向每孔加入300μ1封閉緩沖液(PBS中加入1% BSA)進(jìn)行封閉。將板用封閉緩沖液孵育至少一個(gè)小時(shí)。孵育后，除去封閉緩沖液，并將板按 如上所述方法洗滌3次。
[0042] ELISA法測(cè)定步驟:
[0043] 制備一系列標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)孔加入100μΙ標(biāo)準(zhǔn)液，每種標(biāo)準(zhǔn)液在96孔板合適的位置分 配兩孔(作為副本）。接著，將100μΙ的每種樣品加入到附加的孔中，并將板在室溫下溫育兩 小時(shí)。溫育后，用如上所述方法將板洗滌三次。將最后一次洗滌的溶液除去后，加入100μΙ生 物素聯(lián)合檢測(cè)抗體。將板在室溫下孵育2小時(shí)后，用如上所述方法將板再次洗滌。然后將100 μL HRP標(biāo)記的鏈霉親和素加入每個(gè)孔中并將板在室溫下溫育20分鐘。將最后一次洗滌的溶 液除去后，將1〇〇μ1的底物溶液(過氧化氫+四甲基聯(lián)苯胺作為色原）加入到每個(gè)孔中。顯色 程度達(dá)到足夠水平時(shí)，將50μ1停止溶液(2Ν硫酸)加入到每個(gè)孔中，將板置于460nm波長(zhǎng)下讀 取吸光值。
[0044] 結(jié)果：
[0045] MTT的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。測(cè)定的值表示為平均生存能力土標(biāo)準(zhǔn)偏差。IL-6，IL-8，IL_la和TNFa的測(cè)定結(jié)果分別如圖2-5所示。這些測(cè)定的值均表示為平均濃度土標(biāo)準(zhǔn)偏 差。
[0046]討論：
[0047]本研究中，UVB照射成纖維細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致活細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，并伴隨有蛋白水解 作用和所有測(cè)得的炎癥標(biāo)志物的顯著增加。經(jīng)測(cè)試材料處理后，活細(xì)胞的數(shù)量的未出現(xiàn)任 何進(jìn)一步的下降。
[0048]當(dāng)CLSC在UVB照射后加入到成纖維細(xì)胞時(shí)，活細(xì)胞的數(shù)目沒有進(jìn)一步下降，并且觀 察到此材料可以顯著降低IL-6，IL-8，IL-I α和TNFa的釋放水平。
[0049] 實(shí)施例2-微量滴定板DPPH法表征酸漿提取物的抗氧化活性 [0050] 材料和方法：
[0051 ] 試劑：HPLC所用試劑純級(jí)乙醇購(gòu)自Fisher Scientific，目錄號(hào)六995-4。2,2_二苯 基1-苦基苯肼(DPPH)購(gòu)自Fisher Scientific，目錄號(hào)AA4415003。水溶性維生素 E購(gòu)自 Fisher Scientific，目錄號(hào)05-402-25。測(cè)試材料按實(shí)施例1所述方法制備獲得 (LumiSalisiwSE 批次 59214沙5,59214沙8 和 59214沙9)。
[0052]設(shè)備：吸光度米用Molecular Devices SpectraMax M5e型酶標(biāo)儀(KH51-001)進(jìn)行 測(cè)量，酶標(biāo)儀配有一個(gè)清晰的平底96孔板，96孔板購(gòu)自Advangene Life Science Plasticware，目錄號(hào)CC plate-PS-96S-F-C_S。質(zhì)量米用Mettler Toledo分析天平（型號(hào) XS204)測(cè)量。本測(cè)試中使用了多通道自動(dòng)移液器（100μΙ ;Fisher Scientific公司目錄號(hào) FBE800300)，單通道移液器（200μ1，1000μ1 和5000μ1 !Thermo Scientif ic 目錄號(hào)分別為 4642080,4642090和FBE 0500)。
[0053] 實(shí)驗(yàn)過程:實(shí)驗(yàn)過程如下。簡(jiǎn)而言之，制備乙醇DPPH工作溶液(0.075mg/mL)。制備6 種濃度范圍0-0.006 %的水溶性維生素 E溶液(作為對(duì)照）。通過在乙醇中溶解LumiSal iS SE 制備樣品溶液，并將其稀釋到濃度范圍〇-〇. 35 %的6個(gè)不同的濃度，每種樣品溶液一式三 份。對(duì)于樣品的背景分析，將75μ1的樣品溶液移入一個(gè)清晰的平底96孔板中?？瞻讟?biāo)準(zhǔn)試劑 純級(jí)乙醇(75μ1)同樣需要加入板中。每個(gè)空白孔和樣品孔均加入150μ1試劑純級(jí)乙醇。對(duì)于 樣品分析，將75μ1的樣品溶液移入一個(gè)清晰的平底96孔板中?？瞻讟?biāo)準(zhǔn)試劑純級(jí)乙醇（75μ 1)同樣需要加入板中。每個(gè)空白孔和樣品孔均加入150μ1 DPPH溶液。對(duì)照孔和樣品孔均以 一式三份添加，結(jié)果采用平均吸光度值計(jì)算。搖振平板并在酶標(biāo)儀內(nèi)25°C下溫育5分鐘。在 517nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。
[0054]計(jì)算:針對(duì)樣品濃度(X軸)和其各自對(duì)應(yīng)的517nm相對(duì)平均吸光度值(實(shí)測(cè)平均吸 光度減去背景平均吸光度）(y軸)作圖并計(jì)算最佳擬合線（多項(xiàng)式擬合）?；诙囗?xiàng)式回歸直 線方程計(jì)算每個(gè)對(duì)照和樣品的IC50(50%受到抑制）。
[0055]結(jié)果：
[0056] DPPH法測(cè)定的水溶性維生素 E的抗氧化活性如圖6所示。DPPH測(cè)試中計(jì)算的水溶性 維生素 E的IC50為0.0010%。三批LumiSalis SE的DPPH法測(cè)試結(jié)果如圖7所示。這三批的回 歸方程和IC50見于表1。這些結(jié)果表明，在DPPH中LumiSalis SE具有抗氧化活性，其IC50為 0.14±0.02%。
[0057]表1 .DPPH法中LumiSalis SE的IC50的計(jì)算
[0059]討論：
[0060] DPPH分析的結(jié)果表明，LumiSalis(CLSC)是一種有效的抗氧化劑，當(dāng)其加入個(gè)人護(hù) 理產(chǎn)品中并施加到使用者的皮膚上時(shí)，預(yù)期其能夠帶來抗氧化劑施加到皮膚上時(shí)通?？梢?的益處，如幫助防止曬傷和皮膚癌，以及逆轉(zhuǎn)某些與皮膚老化有關(guān)的變色和皺紋。預(yù)期 LumiSalis能夠加速皮膚的自然修復(fù)系統(tǒng)，抑制進(jìn)一步的損害發(fā)生。
[0061]前面的描述和附圖包括了本發(fā)明的說明性實(shí)施例。前述實(shí)施例和本發(fā)明描述的方 法可以基于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力、經(jīng)驗(yàn)和偏好做出改變。僅僅按一定的順序列出所述方 法的步驟，并不對(duì)所述方法步驟的順序構(gòu)成任何限制。前面的描述和附圖僅僅用于解釋和 闡述本發(fā)明，并且本發(fā)明不限于此，除非權(quán)利要求有如此限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公 開之前對(duì)其作出的修改和變化并不脫離本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種減少受試者皮膚損傷的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿 (Physalis alkekengi)提取物的組合物。2. -種降低受試者炎癥標(biāo)志物水平的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿 提取物的組合物。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述炎癥標(biāo)志物選自：IL-6、IL-8、IL-la和TNFa。4. 一種治療受試者皮膚損傷的方法，包括向受試者的皮膚施用包含有效量酸漿提取物 的組合物。
【文檔編號(hào)】A61K36/81GK105979955SQ201480067899
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年12月12日
【發(fā)明人】韋書婷, M·溫特斯, S·納亞克
【申請(qǐng)人】凱敏工業(yè)公司