一種hbv感染小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型的建立方法。本發(fā)明采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV單拷貝線狀基因組，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染Huh7、HepG2以及293T細(xì)胞，以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)；用尾靜脈高壓水動力法將PCR產(chǎn)物注射C57BL/6J小鼠，以免疫組化檢測小鼠肝組織中的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，ELISA檢測小鼠血清中的HBsAg、HBeAg。本發(fā)明建立了一種新的HBV感染小鼠模型，該模型制備方法簡單，并且肝組織內(nèi)存在與HBV cccDNA類似的HBV基因組。為研究HBV cccDNA降解機(jī)制、藥物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生物學(xué)特性等提供一種新的工具。
【專利說明】
一種HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用HBV基因組PCR產(chǎn)物注射小鼠建立一種 HBV感染小鼠模型，以及該模型的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)是嚴(yán)重危害人類健康的病原體，目前全球約有3億人為慢性 HBV感染者。HBV感染不僅可引起急性、慢性肝炎，并且是發(fā)展中國家人群發(fā)生肝硬化、肝癌 的重要原因。雖然接種乙肝疫苗能有效預(yù)防HBV感染，但對于慢性HBV感染，目前的藥物僅能 抑制病毒復(fù)制，然而并不能作用于存在于肝細(xì)胞核內(nèi)的HBV共價閉合環(huán)狀DNA( CCCDNA)，這 是抗HBV藥物研發(fā)面臨的巨大挑戰(zhàn)（參見文獻(xiàn):Baltayiannis G,Karayiannis P·Treatment options beyond IFNaand NUCs for chronic HBV infection: expectations for tomorrow.J Viral Hepat.2014；21(11):753-61.；Nassal M.HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B.Gut.2015；64(12):1972-84.)〇
[0003] 建立能模擬人類感染HBV狀態(tài)的小動物模型對于HBV感染、致病機(jī)制研究以及抗 HBV藥物研發(fā)極為重要。目前這類小動物模型主要有鴨乙型肝炎模型(DHBV)、土拔鼠肝炎模 型(W H V )、H B V轉(zhuǎn)基因小鼠模型、H B V質(zhì)粒水動力注射小鼠模型等（參見文獻(xiàn):A11 w e i s s L， Dandri M.Experimental in vitro and in vivo models for the study of human hepatitis B virus infection .J Hepatol·2016;64(ISuppl):S17-31·;Dandri M, Lutgehetmann M1Volz T,Petersen J. Small animal model systems for studying hepatitis B virus replication and pathogenesis . Semin Liver Dis.2006；26(2): 181-91.) AHBVJHV雖然都能引起慢性感染，但與人HBV的基因結(jié)構(gòu)以及致病性方面存在不 同；HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在染色體中整合HBV基因組，對HBV免疫耐受，且不能產(chǎn)生cccDNA;高 壓水動力注射HBV基因組質(zhì)粒的小鼠能較長時間產(chǎn)生HBV抗原及病毒顆粒，并發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn) 換，但該模型中的HBV基因組存在的形式不同于cccDNA，且持續(xù)時間有限。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的在于建立一種在肝組織中存在HBV基因組雙鏈環(huán)狀DNA的HBV感染小 鼠模型，為研究HBV cccDNA降解機(jī)制、藥物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生物學(xué)特性 等提供一種新的工具。
[0005] 本發(fā)明將線狀單拷貝HBV基因組DNA高壓水動力法尾靜脈注射小鼠，隨后在小鼠肝 細(xì)胞內(nèi)檢測到HBcAg，血清中檢測到HBsAg和HBeAg，代表了一種新的HBV小鼠感染模型。本模 型的建立方法簡單，尤其適合針對臨床HBV血清標(biāo)本快速建立小鼠感染模型，且該模型中的 HBV基因理論上能形成閉合雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，類似于cccDNA，因而在研究cccDNA降解機(jī)制、藥 物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生物學(xué)特性、藥物篩選等方面具有重要用途。
[0006] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明用HBV基因組PCR產(chǎn)物注射小鼠建立一種HBV感染小鼠模型。
[0008]本發(fā)明提供了一種HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，是用線狀單拷貝HBV基因組注射 小鼠而制備成功。
[0009]本發(fā)明注射小鼠的線狀單拷貝HBV基因組可通過PCR擴(kuò)增獲得，制備方法簡單。 [0010]本發(fā)明構(gòu)建的HBV感染小鼠模型，肝組織內(nèi)存在與HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA) 類似的HBV基因組。
[0011 ]本發(fā)明采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV單拷貝線狀基因組，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染Huh7、 HepG2以及293T細(xì)胞，以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中的乙型肝炎表面抗 原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg);用尾靜脈高壓水動力法將PCR產(chǎn)物注射C57BL/6J小 鼠，以免疫組化檢測小鼠肝組織中的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，ELISA檢測小鼠血清中的 HBsAg、HBeAg。
[0012]細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均用質(zhì)粒pAAV-HBVl. 2作為陽性對照。
[0013] 結(jié)果顯示：HBV基因組PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染Huh7、HepG2以及293T細(xì)胞均可分泌表達(dá)HBsAg 和HBeAg; PCR產(chǎn)物注射小鼠后，肝組織中檢測到HBcAg，血清中檢測到HBsAg和HBeAg，HBsAg 和HBeAg最長持續(xù)時間分別為59和38天，血清中HBsAg和HBeAg水平以及持續(xù)時間與質(zhì)粒 pAAV-HBVl. 2注射的小鼠總體相似。本發(fā)明建立了一種新的HBV感染小鼠模型，該模型制備 方法簡單，并且肝組織內(nèi)存在與HBV cccDNA類似的雙鏈環(huán)狀HBV基因組。
[0014] 本發(fā)明為研究HBV cccDNA降解機(jī)制、藥物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生 物學(xué)特性、藥物篩選等提供了新的模型。
【附圖說明】：
[0015] 圖1:擴(kuò)增HBV全基因組的策略（Primer Pl，Primer P2以及Pl、P2gp引物P1、引物 P2，DR1 為HBV基因組中的direct repeat 1)〇
[0016]圖2:質(zhì)粒pMD18T-HBV1.0酶切以及HBV基因組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析;其中 I: 1000 Obp DNA Marker;2:pMD18T-HBVl ·0酶切（KpnI/HindllI);3:HBV基因組PCR產(chǎn)物。 [0017] 圖3: ELISA檢測不同形式的HBV DNA轉(zhuǎn)染Huh7、HepG2、293T細(xì)胞后培養(yǎng)上清中的
[0018] 圖4: ELI SA檢測小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;其中A:小鼠血清中HBsAg水平的動態(tài) 變化;B:小鼠血清中HBeAgAg水平的動態(tài)變化(*P〈0.05，PCR與pAAV-HBVl. 2組相比）。
[0019 ]圖5:免疫組化檢測小鼠肝組織中HBcAg的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 一、材料
[0023] 1.細(xì)胞與質(zhì)粒
[0024] 人肝癌細(xì)胞Huh7、HepG2以及人胚腎(HEK)293T細(xì)胞系由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教 研室保存(也可直接購自中科院細(xì)胞所）；pMD-18T克隆載體以及質(zhì)粒pUC18為Takara產(chǎn)品。
[0025] 2.質(zhì)粒
[0026] 含1.2拷貝HBV基因組的腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-HBVl .2由臺灣大學(xué)陳培哲教授 饋贈（也可根據(jù)以下文獻(xiàn)方法制備得到：Huang LR，Wu HL，Chen PJ，Chen DS.An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A.2006; 103(47) :17862-7.);基因克隆載體 PMD-18T為Takara公司產(chǎn)品。
[0027] 3.引物
[0028]擴(kuò)增HBV完整基因組的引物由Takara公司合成，上、下游引物序列分別為：
[0029] Pl：57-TTTTTCACCTCTGCCTAATCA-37(SEQ ID NO:1)；
[0030] P2：5/-GTTGCATGGTGCTGGTGCGC-3/(SEQ ID N0:2)〇
[0031] 4.試劑
[0032] PrimeSTAR Max DNA聚合酶預(yù)混液(含有PCR反應(yīng)中除了模板和引物以外的各種成 分)購自Takara公司。
[0033] DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基，含10 %胎牛血清、100IU/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素，調(diào)pH 至7.4。配置培養(yǎng)液的各種組分均購自Invitrogen公司。
[0034] 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自于Invitrogen公司；HBsAg、 HBcAg ELISA試劑盒購自上海科華生物工程股份公司。
[0035] 5.實(shí)驗(yàn)動物
[0036] C57BL/6J小鼠購自西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。
[0037] 二、實(shí)驗(yàn)方法：
[0038] (一)HBV基因組PCR擴(kuò)增與質(zhì)粒構(gòu)建
[0039] 1、以質(zhì)粒pAAV-HBVl. 2為模板，用引物Pl、P2擴(kuò)增HBV全長基因組，PCR擴(kuò)增反應(yīng)組 分包括：1)質(zhì)粒pAAV-HBVl · 21μ1 (0 · Iyg); 2)引物Pl、P2各ΙμL (IOpmol); 3)PrimeSTAR Max DNA聚合酶預(yù)混液10μ1;4)滅菌重蒸水38μ1。將上述混合物置于一個微量離心管內(nèi)，充分混 勻，于PCR儀上進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)：先94°C30sec充分變性;然后94°C IOsec，60°C IOsec，72°C 3min，共30個循環(huán);最后降溫到4°C。引物Pl、P2位于HBV基因組高度保守的preC基因起始處， 也正好在HBV基因組負(fù)鏈的5'和3'的末端（圖1)。
[0040] 2、PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠中回收擴(kuò)增出的HBV基因組，將回收的HBV 基因組與pMD-18T克隆載體連接，得到含有單拷貝HBV基因組的質(zhì)粒pMD 18T-HBV1.0，用限制 性內(nèi)切酶KpnI/HindlΠ 酶切鑒定（圖2)，再進(jìn)行DNA測序確認(rèn)。所用方法均參照分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南第三版(科學(xué)出版社，2002年第一版）。
[0041 ] 3、用質(zhì)粒pMD18T-HBVl. 0為模板，PCR擴(kuò)增HBV基因組，方法同上所述，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，回收以后用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和小鼠尾靜脈注射。
[0042](二)細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與細(xì)胞上清中的HBsAg、HBcAg檢測
[0043] l、Huh7、HepG2以及HEK293T用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C、5%⑶2孵箱中。將 處于對數(shù)生長期的上述三種細(xì)胞傳代接種于24孔板內(nèi)，每孔個50000細(xì)胞，培養(yǎng)基500μ1，置 于37 °C 5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。
[0044] 2、用Lipofectamine 3000試劑將質(zhì)粒pAAV-HBV1.2、pMD18T-HBV1.0、pUC18(作為 陰性對照用）以及HBV基因組PCR產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)染接種于24孔板、過夜培養(yǎng)的Huh7、HepG2以及 HEK293T細(xì)胞，質(zhì)粒以及PCR產(chǎn)物用量均為0.5yg，操作按照試劑使用說明進(jìn)行。將細(xì)胞培養(yǎng) 板置于孵箱內(nèi)，6h后吸除細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入500μ1完全DMEM培養(yǎng)基，置于孵箱內(nèi)，48h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用商品化ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBcAg。檢測方法參 照試劑盒使用說明。
[0045] HBV基因組為環(huán)狀，聚合酶基因與S、C、X基因重疊，C基因和X基因之間也有部分重 疊。pAAV-HBV 1.2質(zhì)粒含完整的線狀HBV基因組，可以表達(dá)HBV全部蛋白；pMD 18T-HBV1.0中， HBV基因組在C基因起始密碼子后斷開，故在細(xì)胞內(nèi)僅表達(dá)HBsAg，不能表達(dá)HBeAg及HBcAg; HBV基因組PCR產(chǎn)物末端在C基因的起始部分
[0046] (GCGCACCAGCACCATGCAAC|TTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCT(SEQ ID NO:3)，ATG為C 基因起始密碼子，丨為斷點(diǎn)位置，即HBV基因組PCR產(chǎn)物的末端位置），PCR產(chǎn)物如果不連接為 環(huán)狀結(jié)構(gòu)，則不能表達(dá)出HBeAg及HBcAg。
[0047] 結(jié)果如圖3所示，pAAV-HBVl .2、pMD18T-HBVl .0以及HBV基因組PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 上清中均可檢測到HBsAg，質(zhì)粒pAAV-HBVl. 2和HBV基因組PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中可檢測 到HBeAg，表明線狀HBV基因組在細(xì)胞內(nèi)連接環(huán)化。與預(yù)想一致，pMD18T-HBV1.0轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 上清中未檢測到HBeAg。
[0048](三)小鼠注射與小鼠血清中HBsAg和HBcAg的檢測
[0049] 將質(zhì)粒pAAV-HBVl .2、HBV基因組PCR產(chǎn)物溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)，分別高壓水 動力法尾靜脈注射4周齡、16g左右的雄性C57BL/6J小鼠，體積2ml，質(zhì)粒以及PCR產(chǎn)物分別用 4yg，5-7秒完成注射，以注射2ml PBS為陰性對照。從尾靜脈注射后第3天開始，每隔7天從小 鼠眼眶取血，用商品化ELISA試劑盒檢測小鼠血清中的HBsAg和HBcAg。每組6只小鼠。結(jié)果如 圖4所示：與注射pAAV-HBVl. 2質(zhì)粒的小鼠相似，HBV基因組PCR產(chǎn)物直接注射的小鼠血清中 也產(chǎn)生HBsAg和HBeAg。兩組小鼠血清中HBsAg持續(xù)時間最長均為59天，在HBsAg陽性的九個 時間點(diǎn)中，兩組小鼠血清HBsAg水平在六個時間點(diǎn)無顯著性差異（第10、17、24、45、52、59 天）；與HBsAg相比，血清中HBeAg降低的速度快，持續(xù)時間短，pAAV-HBVl. 2與HBV基因組PCR 產(chǎn)物注射組的HBeAg持續(xù)時間最長分別為45和38天。除第10天，其他時間點(diǎn)兩組小鼠血清中 HBeAg水平無顯著性差異。
[0050](四）免疫組化檢測小鼠肝組織內(nèi)HBcAg
[0051] 在小鼠尾靜脈注射HBV DNA后第1天、第4天和第7天取肝組織，用免疫組化檢測其 肝細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，由谷歌生物完成。結(jié)果如圖5所示，在注射1、4、7天后，pAAV-HBVl. 2 與HBV基因組PCR產(chǎn)物注射小鼠的肝細(xì)胞中均可檢測到HBcAg的表達(dá)。
[0052]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBV基因組PCR產(chǎn)物無論在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，還是在小鼠肝 組織中，都能連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表達(dá)出HBeAg。
[0053]本模型的建立方法簡單，尤其適合針對臨床HBV血清標(biāo)本快速建立小鼠感染模型， 且該模型中的HBV基因能形成閉合雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，類似于cccDNA，因而未研究HBV cccDNA降 解機(jī)制、藥物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生物學(xué)特性等提供了新的模型。
[0054]以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于是用線狀單拷貝HBV基因組注射小 ￡32. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的線狀單拷 貝HBV基因組是通過PCR擴(kuò)增獲得的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，通過PCR擴(kuò)增HBV 基因組的引物如下： Pl:57-TTTTTCACCTCTGCCTAATCA-37(SEQ ID NO:1); P2：57-GTTGCATGGTGCTGGTGCGC-37(SEQ ID NO:2)〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的線狀單拷 貝HBV基因組用高壓水動力法尾靜脈注射小鼠。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建的HBV感染小 鼠模型，肝組織內(nèi)存在與HBV共價閉合環(huán)狀DNA類似的HBV基因組。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV感染小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的構(gòu)建方法 包括： 采用PCR擴(kuò)增HBV單拷貝線狀基因組，引物如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示； 將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染Huh7、HepG2以及293T細(xì)胞，以ELISA檢測到培養(yǎng)細(xì)胞上清中的乙型肝炎 表面抗原和乙型肝炎e抗原； 用高壓水動力法將PCR產(chǎn)物尾靜脈注射小鼠。7. 如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的HB V感染小鼠模型在研究HB V cccDNA降解機(jī)制、藥物清除以及乙肝患者血清樣本中的HBV生物學(xué)特性、藥物篩選中的應(yīng) 用。
【文檔編號】A61K49/00GK105943560SQ201610390186
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】趙平, 張龍嚴(yán), 狄弘瑋, 王世杰, 張衛(wèi)
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)