一種毛囊移植液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種毛囊移植液及其制備方法，屬于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)美容和毛發(fā)移植領(lǐng)域。本發(fā)明在人毛囊干細(xì)胞提取物中加入20～50ug/ml中藥提取物制備得到；所述的人毛囊干細(xì)胞提取物中含有人干細(xì)胞活性成分為0.001％～90％；所述中藥提取物中活性成分的質(zhì)量百分比含量在50％以上；所述的中藥提取物中的活性成分包括甙、酸、多酚、多糖、萜類、黃酮和生物堿中的一種以上。本發(fā)明采用過濾法結(jié)合低溫運(yùn)輸、保存等相關(guān)技術(shù)手段，工藝簡單、反應(yīng)溫和，保證了產(chǎn)品中活性物質(zhì)的生物活性和產(chǎn)品效果的穩(wěn)定性；本發(fā)明的毛囊移植液產(chǎn)品的制備方法完全脫離化工工藝，不含重金屬殘留、防腐劑等有毒有害物質(zhì)，生物安全性高，市場推廣和應(yīng)用前景好。
【專利說明】
一種毛囊移植液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種毛囊移植液及其制備方法，屬于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)美發(fā)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是人體最大的器官，而毛囊又是皮膚的重要附屬器，其呈周期性、有規(guī)律地自我再生，在人體內(nèi)終生不斷，是調(diào)控毛發(fā)周期生長的重要結(jié)構(gòu)。健康成人頭發(fā)總數(shù)平均有5-15萬根，由于人們生活節(jié)奏加快，工作壓力增大，生活作息不規(guī)律等諸多因素，雄源性禿發(fā)、癱痕性禿發(fā)等脫發(fā)患者呈逐年增多趨勢，我國男性脫發(fā)的發(fā)病率達(dá)到了 19.9%，脫發(fā)患者已超過I億。而且，近年來脫發(fā)呈現(xiàn)年輕化趨勢，中青年成了脫發(fā)人群中的主力軍。因此，尋找有效治療脫發(fā)的方法刻不容緩，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也越來越重視對脫發(fā)的研究。
[0003]傳統(tǒng)的脫發(fā)治療方法包括禿發(fā)頭皮縮減、皮瓣外科及頭皮自體移植術(shù)等，但這些修復(fù)方法大多數(shù)存在毛發(fā)移植成活率低、疤痕明顯、外觀不自然等缺陷。自體頭發(fā)移植術(shù)因具有簡單易行、安全、快速、有效且隱蔽等特點(diǎn)，而得以廣泛開展及受到患者的歡迎。但傳統(tǒng)的毛發(fā)移植如:環(huán)鉆鉆孔移植、激光打孔移植、狹縫移植法等，每個(gè)移植物含有的毛發(fā)數(shù)目也是由4?12根不等，這些方法都可以修復(fù)毛發(fā)缺失，但是存在的問題是毛發(fā)移植物較大，因而產(chǎn)生術(shù)后毛發(fā)方向和密度分布不自然、受區(qū)損傷大、存活率低、影響美觀等缺點(diǎn)。近年來發(fā)展起來的以自然毛囊單位為基礎(chǔ)的毛發(fā)移植，使得毛發(fā)移植技術(shù)更趨于成熟。自體毛囊移植技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)毛囊單位在禿發(fā)區(qū)域的再分布從而獲得良好的外觀，因由具有手術(shù)創(chuàng)傷小、療效確切的優(yōu)點(diǎn)而成為目前修復(fù)毛發(fā)缺失最有效的治療手段之一。
[0004]目前，自體毛囊移植技術(shù)在臨床上還存在以下不足:首先，技術(shù)要求高，需要專業(yè)人員操作。單位毛囊體積比較小，生命力比較脆弱，影響其存活的因素較多；其中直接損傷是對移植物的機(jī)械性損傷如夾傷;還有間接損傷，如熱損傷及干燥損傷;在手術(shù)的過程中需要格外小心，減少直接夾持損傷，同時(shí)盡可能在最短的時(shí)間內(nèi)植入，減少暴露的時(shí)間。其次，毛發(fā)移植中毛發(fā)的供區(qū)有限，不可再生，毛發(fā)移植的原理是通過手術(shù)使毛囊重新分布，不是毛發(fā)的再生，因而單位毛囊移植也不能夠解決目前毛發(fā)供區(qū)不足的問題。而且單位毛囊在切割獲取過程中的損失率比較高，技術(shù)要求高。另外，對于需大面積移植的患者仍然容易產(chǎn)生術(shù)后毛發(fā)密度較小、不自然的情況。由于手術(shù)時(shí)間長，容易使患者不耐受手術(shù)。
[0005]總之，自體毛囊移植術(shù)本質(zhì)上不產(chǎn)生新的毛囊，因此如何有效利用有限的自體毛囊，保證毛發(fā)移植術(shù)過程中毛囊的活性，提高毛囊成活率，是提高自體毛囊移植術(shù)毛發(fā)移植效果的核心和關(guān)鍵。
[0006]目前，為了提高毛發(fā)移植術(shù)過程中毛囊的活性，人們已經(jīng)發(fā)明了很多有效的方法。例如，(I)一種虎口毛囊移植物保濕儲備器(CN202365929U)，發(fā)明了一種虎口毛囊移植物保濕儲備器，能夠保持毛囊單位在整個(gè)毛發(fā)移植的手術(shù)操作過程中的濕度，減少夾持毛囊單位的時(shí)間，從而增加手術(shù)的成功率；(2)毛囊移植器(CN202821458U)，該實(shí)用新型公開了一種毛囊移植器，包括U型槽以及與U型槽前端相連的針尖，所述U型槽的長度為l-3cm，所述U型槽后端連接把手。該實(shí)用新型克服了現(xiàn)有技術(shù)中植發(fā)手術(shù)過程繁瑣的技術(shù)缺陷，提供一種能夠簡化植發(fā)手術(shù)的毛囊移植器。(3)—種無痕植發(fā)方法(CN104224249A)，本發(fā)明提供一種無痕植發(fā)方法，是通過以下的步驟實(shí)現(xiàn)的:I)毛囊檢測:高清毛發(fā)專項(xiàng)檢測系統(tǒng)，精確檢測出毛發(fā)、毛囊質(zhì)量和指標(biāo);2)角度定制:設(shè)計(jì)合理種植方案;3)植發(fā)體位:載體在提取毛囊時(shí)采用俯臥位，毛發(fā)植入采用平臥位;4)毛囊提取:采用毛囊提取儀選擇不同的鉆頭進(jìn)行毛囊提取;5)分離毛囊:顯微鏡分離毛囊;6)培育毛囊:將毛囊取下后放入冷凍的乳酸培植液中培植;7)大孔:對毛囊進(jìn)行打孔;8)納米種植:納米級毛囊移植器械種植;9)洗滌與護(hù)理。本發(fā)明植入過程時(shí)間短，成活率高，植入精確，易于恢復(fù)。(4)高密式單體毛囊移植器(CN201279174Y)，該實(shí)用新型涉及一種高密式單體毛囊移植器，它屬于一種用于毛囊移植的外科手術(shù)器械。該實(shí)用新型主要是解決現(xiàn)有方法存在的術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長、移植效果差和損傷毛囊的技術(shù)難點(diǎn)。該實(shí)用新型為解決上述技術(shù)難點(diǎn)而采用的技術(shù)方案是:高密式單體毛囊移植器，它包括毛囊移植手術(shù)刀、夾持刀架、調(diào)節(jié)固定套和刀柄，毛囊移植手術(shù)刀設(shè)在夾持刀架的中央，夾持刀架的中上部裝在調(diào)節(jié)固定套中且通過調(diào)節(jié)固定套與刀柄連接。該實(shí)用新型具有移植效果好、不損傷毛囊和恢復(fù)快的優(yōu)點(diǎn)。(5)毛囊移植針(PTT-B3)CN301113834用于人體毛發(fā)移植。(6)手動(dòng)無痕取發(fā)器CN201171699Y該實(shí)用新型公開了一種手動(dòng)無痕取發(fā)器，該取發(fā)器由柄體I)、管狀刀2)組成，在柄體I)的前端安裝管狀刀2)連成整體。使用時(shí)，手握取發(fā)器的柄體I)將管狀刀2)插入枕部供區(qū)挑取毛囊，去除結(jié)締組織和真皮層后的毛囊植入到易脫發(fā)區(qū)。該實(shí)用新型結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，速度快捷，采用該取發(fā)器挑取優(yōu)良毛囊移植，不開刀，不縫合，無疤痕，失血少，零感染，手術(shù)時(shí)間和術(shù)后恢復(fù)時(shí)間短，病人痛苦小。(7)毛囊移植器CN2889182Y該實(shí)用新型所述的毛囊移植器包括空心針頭、手術(shù)針、推入針裝置與針管體;空心針頭、手術(shù)針與推入裝置均設(shè)于針管體中，手術(shù)針設(shè)于推入裝置一端并伸入空心針頭I中，推入裝置控制手術(shù)針在空心針頭中移動(dòng)。在使用過程中，在手術(shù)針前端空心針頭的內(nèi)孔的容納管中放入毛囊，將空心針頭插入需要植入的部位，按住按鈕推動(dòng)推入針裝置，控制手術(shù)針向前移動(dòng)，同時(shí)空心針頭I后移動(dòng)，將毛囊留在需要植入的部位;拔出空心針頭，完成毛囊移植過程。能夠使創(chuàng)口非常小，術(shù)后恢復(fù)時(shí)間短，降低對人體的傷害;方向精確密度好，可以提高植發(fā)的密度與植發(fā)方向的精確度；可實(shí)現(xiàn)單根毛囊移植;可用于眉毛，睫毛部位的毛發(fā)移植;器械不接觸毛囊，降低了人為損傷毛囊的機(jī)率。
[0007]從上述專利申請情況不難看出，專利多為實(shí)用新型專利，多為毛囊移植器件的改進(jìn)或改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種毛囊移植液及其制備方法，所述的毛囊移植液可以用作毛囊移植時(shí)毛囊保存液，確保植發(fā)前、植發(fā)中、植發(fā)后的毛囊活性，合理調(diào)控毛囊生長過程，誘導(dǎo)和刺激移植毛胚迅速茁壯成長，激活萎縮毛囊煥發(fā)新生活力，將植發(fā)效果達(dá)到最大化。
[0009]本發(fā)明提供的毛囊移植液的制備方法，包括如下步驟，
[0010]第一步，獲取單個(gè)或者多個(gè)毛囊組織，利用分離酶對離體的毛囊進(jìn)行消化；
[0011]第二步，在顯微鏡下切取第一步中得到的毛囊的毛囊隆突部；
[0012]第三步，利用胰酶對第二步中所得的毛囊隆突部進(jìn)行消化，消化溫度為37°C，消化時(shí)間為1min左右，得到消化液；
[0013]第四步，對第三步獲得的消化液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心8-10分鐘；
[0014]第五步，將第四步中離心后獲得的細(xì)胞層重懸于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度為37 °C，CO2濃度為5%;
[0015]第六步，待細(xì)胞融合度達(dá)到質(zhì)量百分含量80%時(shí)，按貼壁面積1:3比例進(jìn)行傳代；
[0016]第七步，收集傳代前的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，得到細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0017]第八步，收集的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過過濾系統(tǒng)，濾去細(xì)胞碎片及微生物，得到過濾液；
[0018]第九步，過濾液置于超濾管中低溫高速離心，濾去上清液，得到濃縮液;所述低溫高速離心的溫度為4°C，離心速率為2750rpm;所述的濃縮液中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001%?90%，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水；
[0019]第十步，所得濃縮液與中藥提取物混合，所述的濃縮液中加入20?50ug/ml的中藥提取物;置于_20°C條件下儲存，S卩得到所述的毛囊移植液。
[0020]上述方法制備得到的毛囊移植液，通過人毛囊干細(xì)胞提取物中加入20?50ug/ml的中藥提取物組成。所述的人毛囊干細(xì)胞提取物中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001%?90%，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水。所述的中藥提取物為松針提取物、何首烏提取物、桑椹提取物和黑芝麻提取物中的兩種以上組分，任意兩種各組分重量相同。所述中藥提取物中活性成分的質(zhì)量百分比含量在50%以上;所述的中藥提取物中的活性成分包括甙、酸、多酚、多糖、萜類、黃酮和生物堿中的一種以上。
[0021 ]毛囊移植液用作毛囊移植時(shí)的毛囊保存液，或者在毛囊移植時(shí)一同植入使用。
[0022]本發(fā)明采用過濾法結(jié)合低溫運(yùn)輸、保存等相關(guān)技術(shù)手段，工藝簡單、反應(yīng)溫和，保證了產(chǎn)品中活性物質(zhì)的生物活性和產(chǎn)品效果的穩(wěn)定性。本發(fā)明的毛囊移植液的制備方法完全脫離化工工藝，不含重金屬殘留、防腐劑等有毒有害物質(zhì)，生物安全性高，市場推廣和應(yīng)用前景好。
【附圖說明】
[0023]圖1A和IB分別為實(shí)施例中受試者A在術(shù)前和術(shù)后90天的毛發(fā)生長情況。
[0024]圖2A?2C分別為實(shí)施例中受試者B在術(shù)前和術(shù)后一個(gè)月、四個(gè)月的毛發(fā)生長情況。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026]本發(fā)明提供一種基于毛囊干細(xì)胞的毛囊移植液及其制備方法，本發(fā)明中所述的毛囊移植液，含有人毛囊干細(xì)胞活性成分和中藥提取物。人毛囊干細(xì)胞具有很高的增殖潛能，在體外培養(yǎng)時(shí)呈克隆性生長，可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等細(xì)胞，而植入體內(nèi)則可分化形成神經(jīng)元、黑色素細(xì)胞和角化細(xì)胞等。人毛囊干細(xì)胞活性成分包含細(xì)胞生長因子(cell growth factor，CGF)等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以促進(jìn)表皮干細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞增殖，調(diào)控毛囊生長過程，誘導(dǎo)和刺激移植毛胚迅速茁壯成長，激活萎縮毛囊煥發(fā)新生活力。添加的中藥提取物一方面可以滋養(yǎng)毛囊干細(xì)胞和毛囊組織，另外也可穩(wěn)定毛囊干細(xì)胞活性成分，使其更好的發(fā)揮作用。
[0027]本發(fā)明提供的毛囊移植液，將人毛囊干細(xì)胞活性成分與中藥提取物配伍，所述的毛囊移植液為人毛囊干細(xì)胞提取物中加入20?50ug/ml的中藥提取物;所述的人毛囊干細(xì)胞提取物中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001 %?90 %，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水。
[0028]所述的中藥提取物為松針提取物、何首烏提取物、桑椹提取物和黑芝麻提取物中的兩種以上組分，任意兩種組分的重量比滿足1:1。所述中藥提取物中活性成分的質(zhì)量百分比含量在50%以上。所述的中藥提取物中的活性成分包括甙、酸、多酚、多糖、萜類、黃酮和生物堿中的一種以上。
[0029]上述的毛囊移植液用作毛囊移植時(shí)的毛囊保存液，也可以在毛囊移植時(shí)一同植入使用。
[0030]本發(fā)明還提供一種毛囊移植液的制備方法，包括以下步驟:
[0031](I)獲取單個(gè)或者多個(gè)毛囊組織，利用分離酶對離體的毛囊進(jìn)行消化。
[0032]所述分離酶為2.5g/L的DISPASE酶，消化溫度為4°C，消化時(shí)間為25-30分鐘。
[0033](2)在顯微鏡下切取步驟(I)中得到的毛囊的毛囊隆突部；
[0034](3)利用胰酶對步驟(2)中所得的毛囊隆突部進(jìn)行消化，消化溫度為37°C，消化時(shí)間為1min左右，得到消化液。
[0035](4)對步驟(3)獲得的消化液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心8-10分鐘。
[0036](5)將步驟(4)中離心后獲得的細(xì)胞層重懸于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度為37 °C，5 % CO2 (體積濃度)ο所述的完全培養(yǎng)基，成分為DMEM+10 % hAB血清+1 Oug/LEGF+1ug/LbFGFο
[0037](6)待細(xì)胞融合度達(dá)到80% (質(zhì)量百分含量)時(shí)，按貼壁面積1:3比例進(jìn)行傳代；
[0038](7)收集傳代前的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，得到細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0039](8)收集的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過過濾系統(tǒng)，濾去細(xì)胞碎片及微生物，得到過濾液；
[0040](9)過濾液置于5K的超濾管中低溫高速離心，濾去上清液，得到濃縮液;所述低溫高速離心的溫度為4°C，離心速率為2750rpm。所述的濃縮液中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001%?90%，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水。
[0041 ] (10)所得濃縮液與中藥提取物混合，所述的濃縮液中加入20?50ug/ml的中藥提取物;置于_20°C條件下儲存，S卩得到所述的毛囊移植液。
[0042]本發(fā)明提供的毛囊移植液富含細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)常溫下穩(wěn)定性較差，易變性失活，嚴(yán)重影響其生物利用度，甚至失去作用；另一方面，這些活性物質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)很容易受到微生物的污染。因此，本發(fā)明所述的毛囊移植液產(chǎn)品對生產(chǎn)工藝的要求較高:既要保證產(chǎn)品的生物活性成分的生物功能，又要避免產(chǎn)品的污染變質(zhì)。本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的高溫高壓、化學(xué)滅菌方式，采用過濾法結(jié)合低溫運(yùn)輸、保存等相關(guān)技術(shù)手段，工藝簡單、反應(yīng)溫和，保證了產(chǎn)品中活性物質(zhì)的生物活性和產(chǎn)品效果的穩(wěn)定性。
[0043]本發(fā)明的毛囊移植液的制備方法完全脫離化工工藝，不含重金屬殘留、防腐劑等有毒有害物質(zhì)，生物安全性高，市場推廣和應(yīng)用前景好。
[0044]實(shí)施例
[0045]應(yīng)用本發(fā)明提供的毛囊移植液，對受試者A進(jìn)行重塑發(fā)際線手術(shù)，對受試者B進(jìn)行雄禿毛發(fā)移植手術(shù)。受試者行毛發(fā)移植時(shí)，將拔取的毛囊置于本發(fā)明的毛囊移植液中保存，之后移植區(qū)域每周涂抹本產(chǎn)品I次，周期為2個(gè)月，如圖1A和1B，以及圖2A?2C所示，結(jié)果非常理想。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種毛囊移植液的制備方法，其特征在于:所述的制備方法包括如下步驟， 第一步，獲取單個(gè)或者多個(gè)毛囊組織，利用分離酶對離體的毛囊進(jìn)行消化； 第二步，在顯微鏡下切取第一步中得到的毛囊的毛囊隆突部； 第三步，利用胰酶對第二步中所得的毛囊隆突部進(jìn)行消化，消化溫度為37°c，消化時(shí)間為1min左右，得到消化液； 第四步，對第三步獲得的消化液以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心8-10分鐘； 第五步，將第四步中離心后獲得的細(xì)胞層重懸于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:溫度為37 °C，CO2濃度為5%; 第六步，待細(xì)胞融合度達(dá)到質(zhì)量百分含量80 %時(shí)，按貼壁面積1:3比例進(jìn)行傳代； 第七步，收集傳代前的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，得到細(xì)胞培養(yǎng)液； 第八步，收集的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過過濾系統(tǒng)，濾去細(xì)胞碎片及微生物，得到過濾液； 第九步，過濾液置于超濾管中低溫高速離心，濾去上清液，得到濃縮液;所述低溫高速離心的溫度為4°C，離心速率為2750rpm;所述的濃縮液中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001 %?90%，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水； 第十步，所得濃縮液與中藥提取物混合，所述的濃縮液中加入20?50ug/ml的中藥提取物;置于_20°C條件下儲存，即得到所述的毛囊移植液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛囊移植液的制備方法，其特征在于:第一步中，所述分離酶為2.5g/L的DISPASE酶，消化溫度為4°C，消化時(shí)間為25-30分鐘。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種毛囊移植液的制備方法，其特征在于:所述的完全培養(yǎng)基，成分為DMEM+10 % hAB血清+1 Oug/LEGF+1 Oug/LbFGF。4.一種毛囊移植液，其特征在于:將人毛囊干細(xì)胞活性成分與中藥提取物配伍，所述的毛囊移植液為人毛囊干細(xì)胞提取物中加入20?50ug/ml的中藥提取物;所述的人毛囊干細(xì)胞提取物中含有人毛囊干細(xì)胞活性成分質(zhì)量百分含量為0.001 %?90 %，其余為人毛囊干細(xì)胞活性成分正常代謝所需要的糖分、蛋白、維生素和水。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種毛囊移植液，其特征在于:所述的中藥提取物為松針提取物、何首烏提取物、桑椹提取物和黑芝麻提取物中的兩種以上組分，任意兩種各組分重量相同。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種毛囊移植液，其特征在于:所述中藥提取物中活性成分的質(zhì)量百分比含量在50%以上;所述的中藥提取物中的活性成分包括甙、酸、多酚、多糖、萜類、黃酮和生物堿中的一種以上。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種毛囊移植液，其特征在于:毛囊移植液用作毛囊移植時(shí)的毛囊保存液，或者在毛囊移植時(shí)一同植入使用。
【文檔編號】A61K8/97GK105919923SQ201610293013
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】王朝剛, 周文然, 宋亞成, 馬強(qiáng)
【申請人】北京博士園科技發(fā)展有限公司