抗凝劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗凝劑成分。特別地，抗凝劑能夠有效地防止魚血凝結(jié)。抗凝劑包括氯化鉀、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸鹽緩沖液。
【專利說明】
抗凝劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于防止血凝結(jié)的成分。
【背景技術(shù)】
[0002]研究暖水硬骨魚種的免疫學(xué)的基本方法是有限的。相比于冷水魚種對(duì)熱帶暖水魚只有很少了解。(Lin等2005)。冷水魚和暖水魚之間的差異之一是血凝結(jié)的時(shí)間(Feeney等1972 ;Kawatsul986)，這在較暖水溫的魚中更迅速(Hussl993)。而且，暖水海洋魚相比于暖水淡水魚經(jīng)受的血凝結(jié)更迅速。由于病菌的傳播在較暖水系統(tǒng)中更劇烈，因此暖水魚需要進(jìn)化這種迅速血凝結(jié)機(jī)制以防止疾病通過打開的傷口感染。
[0003]因而至關(guān)重要的需要有效的抗凝劑，以防止血凝結(jié)、聚集以及最終降解。因?yàn)槟軌虮Ｗo(hù)血細(xì)胞的形態(tài)和功能，所以血的抗凝非常重要。這對(duì)許多水產(chǎn)研究是至關(guān)重要的，諸如性別確定分析、血清和健康分析、疾病識(shí)別、疫苗評(píng)估、細(xì)胞譜系標(biāo)記發(fā)展以及酶或者內(nèi)分泌測(cè)試。
[0004]對(duì)于人血來說，多個(gè)抗凝試劑已經(jīng)建立用于不同的應(yīng)用，這些應(yīng)用除了其他的以夕卜，包括診斷樣本的保存。肝素、檸檬酸鈉溶液以及乙二胺四乙酸(EDTA)在實(shí)驗(yàn)室設(shè)定中通常是可獲得的。EDTA已經(jīng)應(yīng)用為螯合劑以及抗凝劑，主要是為了診斷關(guān)于醫(yī)療和手術(shù)測(cè)量順序的血測(cè)試的目的。
[0005]存在許多報(bào)導(dǎo)抗凝劑的公開物。在授權(quán)的US專利US4090977中公開了一種用于保存全血的滲透平衡的抗凝劑混合物，其包括EDTA的游離酸形式的添加物，其升高紅細(xì)胞比容值，具有低于紅細(xì)胞比容值的對(duì)應(yīng)鹽量，優(yōu)選EDTA的堿金屬鹽，以這樣的比率，使得紅細(xì)胞比容值在抗凝劑濃度的較寬范圍內(nèi)相當(dāng)于鮮血或者肝素化血的紅細(xì)胞比容值。
[0006]在另一授權(quán)的US專利US6277556中公開了一種用于捐贈(zèng)者全血的新檸檬酸鹽基抗凝劑，其提供了良好的血小板產(chǎn)量以及細(xì)胞形態(tài)，顯著降低了血漿分離置換法程序期間捐贈(zèng)者皮膚感覺異常的風(fēng)險(xiǎn)。主要檸檬酸鹽抗凝劑成分包括的檸檬酸與檸檬酸鹽的比率大于大約30 %?？鼓齽┡c全血混合以提供抗凝血混合物，其包含的檸檬酸濃度大于大約5.0mM,總檸檬酸鹽濃度小于大約20mM，以及初始血pH小于大約6.75。血小板富集產(chǎn)品包括PRP以及從根據(jù)本發(fā)明收集的血制備的PC，呈現(xiàn)更好地血小板產(chǎn)量以及在存儲(chǔ)上更好的血小板形態(tài)。但是，關(guān)于抗凝劑的公開物種沒有一個(gè)報(bào)道了能夠防止血凝結(jié)在熱帶魚中。
[0007]因此，需要提供一種有效防止魚血凝結(jié)的抗凝劑成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方案，提供了一種抗凝劑成分，其包括氯化鉀、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸鹽緩沖液。
[0009]有利地，抗凝劑能夠有效地防止魚血凝結(jié)。
[0010]有利地，抗凝劑對(duì)魚血細(xì)胞生理學(xué)是等滲的。
【附圖說明】
[0011 ]圖1a示出了商用肝素血收集管和抗凝劑的抗凝血能力。
[0012]圖1b示出了用包含肝素以及EDTA的磷酸鹽緩沖液稀釋十倍的血的抗凝血能力。
[0013]圖2示出了血細(xì)胞的MGG染色法。
[0014]圖3a示出了白血球的活細(xì)胞的微觀視圖。
[0015]圖3b示出了經(jīng)過LPS刺激菌落的形成。
[0016]圖3c示出了經(jīng)過PHA刺激菌落的形成。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明涉及一種用于防止魚血凝結(jié)的抗凝劑成分?？鼓齽┏煞职然?、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸鹽緩沖液。
[0018]磷酸鹽緩沖液由鈉磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的組合制成。磷酸鹽緩沖液的量的范圍為0.008mM至0.012mM。鈉磷酸氫二鈉的量的范圍為9.0111]\1至10.51111，而磷酸二氫鉀的量的范圍為1.5mM至2.5mM。
[0019]氯化鉀的范圍為2.0mM至3.0mM。氯化鈉的范圍為130mM至140mM。EDTA的范圍為ImM至2mM。檸檬酸三鈉二水合物的范圍為0.1OmM至0.12mM。
[0020]抗凝劑的pH的范圍為pH7.2至pH7.5。成分的滲透壓度的范圍為280m0sm至320m0smo
[0021]EDTA和檸檬酸三鈉二水合物功能為螯合劑。螯合劑激活鈣離子，鈣離子是凝結(jié)過程的關(guān)鍵因素，因此防止血的凝結(jié)。此外，具有前述濃度的EDTA和檸檬酸三鈉二水合物在羅曼斯基染色法中將不創(chuàng)建制造物，并且能夠最小化血細(xì)胞的聚集或者退化。
[0022]有利地，抗凝劑等滲于血細(xì)胞生理學(xué)，并且還不干涉血細(xì)胞形態(tài)和功能。
[0023]有利地，抗凝劑不影響血細(xì)胞活性。
[0024]有利地，抗凝劑增強(qiáng)免疫血細(xì)胞的恢復(fù)。
[0025]抗凝劑還能夠用來防止人血、兩棲動(dòng)物血或者爬蟲類動(dòng)物血的凝結(jié)。
[0026]本發(fā)明還涉及用于防止血凝結(jié)的試劑盒(kit)。試劑盒包括抗凝劑和緩沖液?？鼓齽┌然洝⒙然c、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸鹽緩沖液。
[0027]本發(fā)明還進(jìn)一步涉及一種用于制備抗凝劑的方法。
[0028]方法包括:第一，溶解氯化鉀、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物、鈉磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀于去離子水中以形成混合物。第二，調(diào)節(jié)混合物的PH至預(yù)定pH，第三，消毒混合物。可替換地，能夠使用蒸餾水溶解氯化鉀、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物、鈉磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀。
[0029]通過下文的例子將更詳細(xì)解釋本發(fā)明。提出的例子僅圖示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[°03°]制備抗凝劑
[0031 ] EDTA、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、鈉磷酸氫二鈉和檸檬酸三鈉二水合物溶解于800mL的去離子水中。利用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，然后添加去離子水以獲得IL的總體積。在液體周期中通過高壓滅菌法以103421帕斯卡(1.05kg/cm2)消毒抗凝劑20min。
[0032]收集魚血
[0033]具有的體重范圍為750_1100g的八只褐點(diǎn)石斑魚(棕點(diǎn)石斑魚)和兩只鞍帶石斑魚雜交種獲取于馬來西亞Ketam島附近。用50mg/L的甲烷磺酸三卡因(MS222 ,Aldrich，USA)麻痹魚。用70 %酒精消毒魚的身體表面。擦掉多余粘液。在收集魚血之前用清水沖洗液沖洗蝶翼輸液器。針首先注入魚的尾靜脈。通過輕輕拉動(dòng)注射器的活塞抽吸血以創(chuàng)建壓力。抽吸的血的每個(gè)部分應(yīng)該立即用5倍的抗凝劑溶液稀釋。在時(shí)間間隔內(nèi)輕輕攪動(dòng)稀釋的血直到離心分咼。
[0034]正如從圖1a中看到的，在本研究(管2)中，在被開發(fā)的抗凝劑稀釋的石斑魚血中未觀察到血的凝結(jié)，而石斑魚血凝結(jié)在商用肝素血收集管(管I)中。正如在圖1b中看到的，利用十倍稀釋的肝素緩沖液(管3)或者EDTA緩沖液(管4)繼續(xù)凝結(jié)的石斑魚血。
[0035]經(jīng)由May-GriinwaId Giemsa(MGG)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)染色法以及活性測(cè)試
[0036]制作血涂片并且用甲醇固定，接著在May-Griinwald溶液中保溫5min并且在10%Giemsa溶液中保溫1min。在正置顯微鏡(BX51 ,Olympus)下滑動(dòng)檢查。使用彩色電親合照相機(jī)(U-CMAD-2;01ympus)從每次滑動(dòng)中從隨機(jī)區(qū)域中選取至少20個(gè)圖像。執(zhí)行臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)以確定細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞活性。
[0037]如圖2所示，利用MGG染色法能夠識(shí)別包括紅血球、淋巴細(xì)胞、血小板、單核白血球以及嗜中性白血球的石斑魚外周血細(xì)胞中的各種細(xì)胞類型。未觀察到細(xì)胞形態(tài)的制造物或者異常。紅血球是具有稍微染色或者不染色細(xì)胞質(zhì)的橢圓形。在石斑魚外周血中小以及大淋巴細(xì)胞在大量白血球中被發(fā)現(xiàn)，其特征在于大尺寸原子核以及較少細(xì)胞質(zhì)。利用其大原子核以及嗜堿性細(xì)胞質(zhì)單核白血球能夠區(qū)別于其他白血球。細(xì)胞質(zhì)與單核白血球的原子核的比率相對(duì)于淋巴細(xì)胞較大?；谄湫据S形狀和冷凝原子核能夠識(shí)別血小板。嗜中性白血球是另一大白血球，其特征在于其在外圍的偏心原子核。在抗凝血中細(xì)胞活性大于98%。
[0038]主要細(xì)胞培養(yǎng)
[0039]在Imin的紅血球的等滲裂解之后，獲得白血球。在包含Leibovitz-15培養(yǎng)基(Sigma,USA)、5(^1^-2-11161^&。1:061:11&1101(3丨81]1&，1]34)和10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)白血球(56°C加熱去活30min;Paa，Austria)。50萬白血球被添加至每96個(gè)微孔板中，在90PL培養(yǎng)介質(zhì)和1yL有絲分裂溶液中。在加濕室中以室溫保溫培養(yǎng)48h。有絲分裂溶液包含SOOygml—1的大腸桿菌，055:B5脂多糖(LPS;Sigma，USA)或者lOygml—1的植物凝血素(PHA-M;Sigma，USA)。使用完整的培養(yǎng)基而不是使用有絲分裂溶液作為控制。通過臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)確定活性細(xì)胞的數(shù)量。使用倒置相差顯微鏡(CK40 ,Olympus)觀察增殖細(xì)胞菌落。
[0040]正如在圖3a中看到的，來自單個(gè)抗凝血中的白血球成功維持在體外培養(yǎng)中。正如分別在圖3b和圖3c中看到的，經(jīng)過LPS或者PHA刺激，白血球增殖并且觀察到細(xì)胞菌落。
[0041]如上所述，很顯然，可以以許多方式改變本發(fā)明。這種變化將視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且所有這種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種抗凝劑成分，包括氯化鉀、氯化鈉、EDTA、檸檬酸三鈉二水合物以及磷酸鹽緩沖液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述磷酸鹽緩沖液鈉是磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述氯化鉀的量的范圍為2.0mM至3.0mM。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述氯化鈉的量的范圍為130mM至140mM。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述EDTA的量的范圍為ImM至2mM。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述檸檬酸三鈉二水合物的量的范圍為0.10mMS0.12mMo7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述磷酸鹽緩沖液的量的范圍為0.0OSmM至0.012mM。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述成分的pH的范圍為pH7.2至pH7.5。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗凝劑成分，其中，所述成分的滲透壓度的范圍為280m0sm至320m0smo
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK105899203SQ201480072604
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日
【發(fā)明人】馬哈·阿卜杜拉, 宗·朱·明, 瑪麗安娜·諾·沙姆斯丁, 法蒂瑪赫·邁德·尤索夫, 萊斯莉·坦·蒂安格·倫格
【申請(qǐng)人】馬來西亞博特拉大學(xué)