一種易保存生物羊膜的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種易保存生物羊膜的制備方法，屬于生物羊膜制備領(lǐng)域。本發(fā)明將羊膜清洗酶解，過濾后加入甘油浸泡，并用生理鹽水沖洗，得粗生物羊膜，之后取殼聚糖和無菌水，混合加入磷酸溶液，茶多酚、酪蛋白以及過硫酸銨，再次混合加熱并加入甲殼素，得混合液，隨后將得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通過微波反應(yīng)，沖洗過濾，置于無菌凈化間自然晾干，從而得到易保存生物羊膜的制備方法。實例證明，本發(fā)明操作工藝簡便，無需特殊儀器，不僅克服了現(xiàn)有羊膜材料較薄，機(jī)械強(qiáng)度較差，易撕裂的缺陷，而且制得的生物羊膜無生物學(xué)毒性，具有較好的相容組織性，可在常溫下長期保存，保存時間延長至3～5年，使用方便，可規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】
一種易保存生物羊膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種易保存生物羊膜的制備方法，屬于生物羊膜制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]羊膜由于自身獨有的特性受到國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，羊膜是指人類胎盤的基底膜層，是無血管、無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膠原組織層，富含IV、V型膠原、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)、干細(xì)胞生長因子(HGF)，易使上皮細(xì)胞移行長入、促進(jìn)上皮的分化、增殖，在上皮創(chuàng)傷愈合中起重要作用。羊膜含各種蛋白抑制因子，通過抑制相應(yīng)蛋白酶而發(fā)揮抗炎作用。同時還含有抑制細(xì)胞因子表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡成分TGF-fo，可避免膠原纖維過度增生，預(yù)防粘連。作為一種新的生物材料，近年來國內(nèi)外臨床上廣泛用于燒傷創(chuàng)面及眼科疾病的輔助治療，其療效非常顯著。
[0003]目前，人羊膜主要用于外科手術(shù)中，其中包括:1、眼睛表面疾病如角膜修復(fù)、先天性青光眼、角膜潰瘍等;2、修補(bǔ)鼓膜損傷;3、用于疝修補(bǔ);4、外科手術(shù)后預(yù)防粘連;5、燒傷后表面覆蓋，用作生物敷料。
[0004]傳統(tǒng)制備得到的羊膜材料比較薄、易卷曲、黏附性較差、使用時易滑動脫落。為了克服上述缺點，目前采用交聯(lián)技術(shù)制備復(fù)合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但處理時使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多種有機(jī)試劑，處理強(qiáng)度大，經(jīng)過脫脂等多個步驟后對羊膜的天然結(jié)構(gòu)破壞很大，造成膠原束排列不規(guī)則，膠原纖維斷裂，同時大量的生物活性因子失活試劑殘留風(fēng)險尚。
[0005]目前臨床上采用的羊膜主要為臨時剝離處理的新鮮羊膜，或者經(jīng)過預(yù)處理的深低溫保存羊膜。兩者均不能做到隨取隨用。目前還有一種技術(shù)是將羊膜預(yù)處理后真空冷凍干燥，滅菌包裝儲存，該種方式能夠做到隨取隨用，延長保存期到I?3年。但這種羊膜材料極少能完全取出細(xì)胞等抗原成分，因此仍具有一定的抗原性，有可能在使用時引發(fā)炎癥。單層的羊膜或羊膜材料較薄，機(jī)械強(qiáng)度較差，易撕裂，手術(shù)中操作困難，不利于臨床使用和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前普遍使用的新鮮羊膜，不利于保存，使用時不方便，且羊膜材料較薄，機(jī)械強(qiáng)度較差，易撕裂，導(dǎo)致手術(shù)中操作困難的現(xiàn)狀，提供了一種將羊膜清洗酶解，過濾后加入甘油浸泡，并用生理鹽水沖洗，得粗生物羊膜，之后取殼聚糖和無菌水，混合加入磷酸緩沖溶液，茶多酚、酪蛋白以及過硫酸銨，再次混合加熱并加入甲殼素，得混合液，隨后將得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通過微波反應(yīng)，沖洗過濾，置于無菌凈化間自然晾干，從而得到易保存生物羊膜的制備方法。該方法操作工藝簡便，無需特殊儀器，不僅克服了現(xiàn)有羊膜材料較薄，機(jī)械強(qiáng)度較差，易撕裂的缺陷，而且制得的生物羊膜無生物學(xué)毒性，具有較好的相容組織性，可在常溫下長期保存，保存時間延長至3?5年，使用方便，可規(guī)?；a(chǎn)，廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)中。
[0007 ]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是: (1)取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4?6%乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在23?25KHz下振蕩50?70min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量3?5 %胰蛋白酶，攪拌均勻，在30?35°C下酶解5?7h ；
(2)待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于4?6°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗5?7次，得粗生物羊膜，備用；
(3)按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆颍湃氩Ａ萜髦?，再向玻璃容器中加入pH為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的30?40 %，攪拌均勻并靜置10?15min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量50?60%茶多酚、殼聚糖質(zhì)量I?3%酪蛋白及酪蛋白質(zhì)量10?15%的過硫酸銨；
(4)在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)行加熱至50?60°C，以150r/min攪拌4?7h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量2?4%甲殼素，攪拌均勻，將步驟(3)所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中10?12h，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜5?7次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
[0008]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:選取3?5只健康小老鼠，消毒后經(jīng)乙醚麻醉，切開背部皮膚2?3cm，植入長(cm)X寬(cm)為0.5X1.0?0.8X1.0本發(fā)明制得的生物羊膜，縫合，消毒，術(shù)后觀察7?14天，可發(fā)現(xiàn)傷口無任何感染，創(chuàng)面愈合良好，植入物周圍物任何積液、化膿現(xiàn)狀，具有顯著的組織相容性，可作為醫(yī)用材料廣泛用于各種外科手術(shù)中。本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作工藝簡便，在制備的過程中無需特殊儀器，反應(yīng)溫和，制得的生物羊膜無生物學(xué)毒性，具有較好的相容組織性，且機(jī)械強(qiáng)度大，不易撕裂；
(2)本發(fā)明制得的生物羊膜可在常溫下長期保存，保存時間延長至3?5年，使用方便，可規(guī)?；a(chǎn)，廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)中。
【具體實施方式】
[0009]首先取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4?6 %乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在23?25KHz下振蕩50?70min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量3?5 %胰蛋白酶，攪拌均勻，在30?35°C下酶解5?7h;待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于4?6°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗5?7次，得粗生物羊膜，備用；隨后按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆?，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的30?40%，攪拌均勻并靜置10?15min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量50?60%的茶多酚、殼聚糖質(zhì)量I?3%的酪蛋白及酪蛋白質(zhì)量10?15%的過硫酸錢;最后在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)行加熱至50?60 °C，以150r/min攪拌4?7h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量2?4%的甲殼素，攪拌均勻，將上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中10?12h，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜5?7次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
[0010]實例 I
首先取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在23KHz下振蕩50min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量3%胰蛋白酶，攪拌均勻，在30°C下酶解5h;待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于4°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗5次，得粗生物羊膜，備用；隨后按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆颍湃氩Ａ萜髦校傧虿Ａ萜髦屑尤隤H為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的30 %，攪拌均勻并靜置1min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量50 %的茶多酚、殼聚糖質(zhì)量I %的酷蛋白及酷蛋白質(zhì)量I %的過硫酸錢；最后在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)tx加熱至50°C，以150r/min攪拌4h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量2%的甲殼素，攪拌均勻，將上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中10h，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜5次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
[0011 ]本實例方法獨特新穎，測試時，選取3只健康小老鼠，消毒后經(jīng)乙醚麻醉，切開背部皮膚2cm，植入長(cm) X寬(cm)為0.5 X 1.0本發(fā)明制得的生物羊膜，縫合，消毒，術(shù)后觀察7天，可發(fā)現(xiàn)傷口無任何感染，創(chuàng)面愈合良好，植入物周圍物任何積液、化膿現(xiàn)狀，具有顯著的組織相容性，可作為醫(yī)用材料廣泛用于各種外科手術(shù)中。
[0012]實例2
首先取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在24KHz下振蕩60min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量4%胰蛋白酶，攪拌均勻，在33°C下酶解6h;待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于5°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗6次，得粗生物羊膜，備用；隨后按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆?，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入PH為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的40%，攪拌均勻并靜置13min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量55%的茶多酚、殼聚糖質(zhì)量2%的酷蛋白及酷蛋白質(zhì)量13%的過硫酸錢；最后在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)行加熱至55°C，以150r/min攪拌6h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量3 %的甲殼素，攪拌均勻，將上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中l(wèi)lh，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜6次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
[0013]本實例方法獨特新穎，測試時，選取4只健康小老鼠，消毒后經(jīng)乙醚麻醉，切開背部皮膚2.5cm，植入長(cm) X寬(cm)為0.7 X 1.0本發(fā)明制得的生物羊膜，縫合，消毒，術(shù)后觀察12天，可發(fā)現(xiàn)傷口無任何感染，創(chuàng)面愈合良好，植入物周圍物任何積液、化膿現(xiàn)狀，具有顯著的組織相容性，可作為醫(yī)用材料廣泛用于各種外科手術(shù)中。
[0014]實例3
首先取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在25KHz下振蕩70min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量5%胰蛋白酶，攪拌均勻，在35°C下酶解7h;待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于6°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗7次，得粗生物羊膜，備用；隨后按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆颍湃氩Ａ萜髦?，再向玻璃容器中加入PH為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的35%，攪拌均勻并靜置15min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量60%的茶多酚、殼聚糖質(zhì)量3 %的酪蛋白及酪蛋白質(zhì)量15 %的過硫酸銨;最后在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)行加熱至60°C，以150r/min攪拌7h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量4%的甲殼素，攪拌均勻，將上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中12h，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜7次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
[0015]本實例方法獨特新穎，測試時，選取5只健康小老鼠，消毒后經(jīng)乙醚麻醉，切開背部皮膚3cm，植入長(cm) X寬(cm)為0.8 X 1.0本發(fā)明制得的生物羊膜，縫合，消毒，術(shù)后觀察14天，可發(fā)現(xiàn)傷口無任何感染，創(chuàng)面愈合良好，植入物周圍物任何積液、化膿現(xiàn)狀，具有顯著的組織相容性，可作為醫(yī)用材料廣泛用于各種外科手術(shù)中。
【主權(quán)項】
1.一種易保存生物羊膜的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)取新鮮羊膜，使用水將其表面清洗干凈，將清洗后的羊膜浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4?6%乳酸溶液中，并置于超聲振蕩器中，在23?25KHz下振蕩50?70min后進(jìn)行過濾，使用蒸餾水淋洗羊膜表面，直至淋洗液PH為7.0，將淋洗后羊膜與羊膜質(zhì)量3?5 %胰蛋白酶，攪拌均勻，在30?35°C下酶解5?7h ； (2)待上述酶解結(jié)束后進(jìn)行過濾，收集酶解后的羊膜，將笛膜平鋪于冰塊表面，將酶解后的羊膜平鋪于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用細(xì)胞刮子將羊膜上的表面雜質(zhì)去除，隨后將去除雜質(zhì)后的羊膜浸泡于甘油中，于4?6°C下，靜置脫水過夜，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水將過濾后的羊膜沖洗5?7次，得粗生物羊膜，備用； (3)按固液比1:3，取殼聚糖與無菌水?dāng)嚢杈鶆?，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH為4.5的磷酸緩沖溶液，加入量為無菌水體積的30?40 %，攪拌均勻并靜置10?15min，分別向玻璃容器中加入殼聚糖質(zhì)量50?60%茶多酚、殼聚糖質(zhì)量I?3%酪蛋白及酪蛋白質(zhì)量10?15%的過硫酸銨； (4)在上述物質(zhì)加入后，對玻璃容器進(jìn)行加熱至50?60°C，以150r/min攪拌4?7h后，向其中加入上述殼聚糖質(zhì)量2?4%甲殼素，攪拌均勻，將步驟(3)所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，隨后將玻璃容器移至微波反應(yīng)器中10?12h，再進(jìn)行過濾，使用生理鹽水沖洗過濾后的羊膜5?7次，將沖洗后的羊膜置于無菌凈化間內(nèi)，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
【文檔編號】A61L31/14GK105833357SQ201610303279
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】郭迎慶, 張明, 宋奇
【申請人】郭迎慶