一種骨組織工程用多孔復(fù)合支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說骨組織工程用的多孔復(fù)合支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨是人體的支架，對人體起著保護(hù)和支持作用，而在運(yùn)動中起杠桿作用。骨膜、骨質(zhì)和骨髓是構(gòu)成骨的三大部分。但是，骨缺損是臨床上的常見病，據(jù)統(tǒng)計，我國每年因疾病、創(chuàng)傷、腫瘤等造成的骨缺損病人超過100萬，大范圍骨缺損的修復(fù)目前仍是骨科治療的難題之一。雖然骨具有再生和自修復(fù)的能力，但是單純靠自我修復(fù)，缺損部位往往很難自我愈合。在這種情況下，則需要進(jìn)行治療。目前，治療骨缺損的方法有骨移植、人工骨移植替代材料和組織工程技術(shù)等。其中，組織工程學(xué)組織具有來源不受限、可預(yù)先設(shè)計形狀、低抗原性和具有生命力等優(yōu)點。另外，應(yīng)用骨組織工程技術(shù)治療骨缺損可以克服自體骨移植供體不足和異體骨移植免疫排斥等缺點。因此，利用骨組織工程學(xué)來進(jìn)行骨修復(fù)是治療骨缺損的熱點。
[0003]絲素蛋白(Silk f ibroin，SF)是從蠶絲中提取的一種疏水性的天然高分子纖維蛋白質(zhì)，由18種氨基酸組成，其中甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸約占其總組成的80%以上。絲素蛋白來源豐富，成本低廉，具有力學(xué)性能優(yōu)異，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，良好的生物相容性和可加工性的優(yōu)點，是一種優(yōu)良的天然的高分子材料?；诮z素蛋白這些優(yōu)點，越來越多地用作骨組織工程支架材料。但是由于絲素蛋白本身沒有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)的作用，對骨缺損的修復(fù)有所限制，因此，制備一種具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力的絲素蛋白多孔支架，作為骨修復(fù)組織工程材料，是本專利的目的。
[0004]輕基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)屬于I丐磷陶瓷，由于它與骨里面的無機(jī)成分非常相似，在骨組織工程中是一種重要的生物陶瓷。羥基磷灰石具有良好的生物相容性，生物活性，、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，經(jīng)常用于牙修復(fù)，骨修復(fù)和矯形修復(fù)。但是，羥基磷灰石不易被吸收且脆性大，限制了其在骨組織工程中的應(yīng)用。因此，必需研發(fā)一種新的載藥體系，使得羥基磷灰石能夠順利地應(yīng)用在骨組織工程中。
[0005]納米微晶纖維素(Nanocrystal Cellulose，CNC)，是由天然纖維素或微晶纖維素通過化學(xué)，物理或者生化的方法制備而得，納米微晶纖維素不但具有納米微粒的相關(guān)性質(zhì)例如:較大的比表面、高強(qiáng)度和高結(jié)晶度;還具備了纖維素的基本結(jié)構(gòu)與特性，例如:無毒性、生物相容性和可降解性等特點；另外，納米纖維素一般在復(fù)合物當(dāng)中充當(dāng)?shù)慕巧茄a(bǔ)強(qiáng)填料，以提高復(fù)合物的熱穩(wěn)定性及機(jī)械性能。而且，納米微晶纖維素中含有豐富的羥基，加入復(fù)合物中，能夠改善復(fù)合物的親水性能。
[0006]近年來，利用絲素蛋白作為三維支架，在骨組織工程應(yīng)用和研究成為了熱點。有研究表明，用絲素蛋白作為骨修復(fù)材料，用于裸鼠顱骨缺損獲得了比較好的修復(fù)效果;而納米纖維素一般在復(fù)合物當(dāng)中充當(dāng)?shù)慕巧茄a(bǔ)強(qiáng)填料，以提高復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，親水性及機(jī)械性能。另一方面，如何改善羥基磷灰石不易被吸收且脆性大的缺點，也是研究人員所關(guān)注的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對上述存在的問題，提供一種力學(xué)性能優(yōu)良、具有良好的生物相容性的骨組織工程用多孔復(fù)合支架。
[0008]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
[0009]—種骨組織工程用的多孔復(fù)合支架，其特征在于:所述骨組織工程用多孔復(fù)合支架為羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架，是由羥基磷灰石、納米微晶纖維素、絲素蛋白組成的三維多孔復(fù)合支架，孔隙率為90?95%，孔徑為180?220μπι。
[0010]優(yōu)選的，所述的羥基磷灰石為針狀，粒徑為10?lOOnm。
[0011]優(yōu)選的，納米微晶纖維素為呈規(guī)整的短棒狀結(jié)構(gòu)，其長度為150-350nm，寬度為20-40nmo
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供上述骨組織工程用的多孔復(fù)合支架的方法:
[0013]所述方法包括以下步驟:
[0014](I)將蠶繭剪碎，然后加入80_100°C、濃度為0.2wt ^NaCO3水溶液中煮2_4h進(jìn)行脫膠形成絲素，蠶繭與NaCO3水溶液的比例為:2-5g蠶繭加入100ml、0.2wt ^NaCO3水溶液，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性；
[0015](2)重復(fù)步驟(I);
[0016](3)將步驟(2)洗至中性的絲素于40_60°C烘干，得到絲素蛋白；取絲素蛋白，加入濃度為9.8mol/L溴化鋰水溶液中，40?60°C水浴加熱4?6h后用去離子水透析3?4天，離心兩次，得到2?I Owt %絲素蛋白溶液；
[0017](4)將羥基磷灰石、納米微晶纖維素加入2?1wt%絲素蛋白溶液中，混合的比例為:每毫升絲素蛋白溶液加入0〈m < 60mg輕基磷灰石、0〈m < 60mg納米微晶纖維素攪拌均勾，其中m表示質(zhì)量，然后冷凍干燥，得到羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架。
[0018]優(yōu)選的，步驟(2)所述的每毫升絲素蛋白溶液加入羥基磷灰石和納米微晶纖維素的量均為30mg。
[0019]進(jìn)一步，所述的蠶繭為去蛹的蠶繭；
[0020]優(yōu)選的，所述的透析過程采用截留分子量為10000?12000的透析袋進(jìn)行透析。
[0021 ] 優(yōu)選的，所述的離心的條件為于25°C、10000r/min條件下離心5_15min。
[0022]優(yōu)選的，步驟(2)中所述的冷凍干燥的條件為-50?_70°C冷凍干燥18_24h。
[0023]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0024](I)本發(fā)明羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架，羥基磷灰石和納米微晶纖維素均勻分布于支架中，力學(xué)性能優(yōu)良，而且該支架具有良好的生物相容性，能夠支持和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；
[0025](2)該復(fù)合多孔支架具有孔隙率高(90-95%)、孔徑均勻(180-220um)的優(yōu)點；
[0026](3)本發(fā)明將羥基磷灰石、納米微晶纖維素和絲素蛋白溶液混合，通過冷凍干燥的方法，形成羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架，制備工藝簡單、材料來源廣泛，生產(chǎn)效率高，成本低，可應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0027]圖1是實施例1的羥基磷灰石的形貌圖，其中圖1a為羥基磷灰石的掃描電鏡圖，圖1b羥基磷灰石的透射電鏡圖；
[0028]圖2是實施例1的納米微晶纖維素的透射電鏡圖；
[0029]圖3是對比實施例1的絲素蛋白多孔支架的掃描電鏡圖；
[0030]圖4是對比實施例2的納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的掃描電鏡圖；
[0031]圖5是對比實施例3的羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架的掃描電鏡圖；
[0032]圖6是實施例1的羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的掃描電鏡圖；
[0033]圖7是對比實施例1的絲素蛋白多孔支架、對比實施例2的納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架、對比實施例3的羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架和實施例1的羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的細(xì)胞毒性圖，其中:SF為對比實施例1的絲素蛋白多孔支架細(xì)胞毒性圖；CNC/SF為比實施例2的納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架細(xì)胞毒性圖;HA/SF為對比實施例3的羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架細(xì)胞毒性圖;HA/CNC/SF為實施例1的羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的細(xì)胞毒性圖；
[0034]圖8是對比實施例1的絲素蛋白多孔支架、比實施例2的納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架、對比實施例3的羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架和實施例1的羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化圖；其中:SF為對比實施例1的絲素蛋白多孔支架的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化圖；CNC/SF為比實施例2的納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化圖;HA/SF為對比實施例3的羥基磷灰石/絲素蛋白多孔支架骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化圖；HA/CNC/SF為實施例1的羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化圖。
[0035]具體實施案例
[0036]下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
[0037]實施例1
[0038](I)將去蛹的蠶繭剪碎，將2.5g的蠶繭加入10ml、濃度為0.2wt %的NaCO3水溶液中進(jìn)行脫膠形成絲素，在100°c條件下煮2h。脫膠后用去離子水清洗絲素至中性；
[0039](2)再重復(fù)上述步驟一次；
[0040](3)將洗至中性的絲素于50°C烘干，得到絲素蛋白；取絲素蛋白，加入濃度為9.8mol/L溴化鋰水溶液中，50°C水浴加熱6h后用去離子水透析4天(透析袋的截留分子量為8000，每天換水一次)，然后于25°(^、100001'/111；[11離心10111；[11，離心兩次，得到濃度為4￥1:%的絲素蛋白溶液；
[0041 ] (4)將加入30mg輕基磷灰石，30mg納米微晶纖維素加入Iml步驟(3)的4wt%絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，_60°C冷凍干燥24h，得到羥基磷灰石/納米微晶纖維素/絲素蛋白多孔支架。從圖1和圖2可知，輕基磷灰石為針狀，粒徑為